專利名稱：一種新疆雪蓮組織培養叢生苗及其大規模繼代培養的方法
技術領域：
本發明涉及可迅速分化叢生苗、穩定、高產，可繼代的新疆雪
5蓮愈傷組織XCSY-1及其選擇方法，本發明還涉及一種新疆雪蓮組 織培養叢生苗及其大規模繼代培養的方法。
背景技術：
雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir. et Maxim.)菊禾斗鳳毛菊 屬雪蓮亞屬的草本植物。雪蓮是高山地區的民間藥用植物，用于散 10 寒除濕、活血通經、抗炎鎮痛等，民間多用于風濕性關節炎、婦女
小腹冷痛、閉經，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、陽痿、髙山不 適應癥等癥的治療。近年來，雪蓮作為民族藥在抗炎鎮痛、抗早孕、 抗衰老及抑制癌細胞增生方面的作用倍受關注。但我國雪蓮主要分
布在4000m以上的高原寒帶地區，如新疆、甘肅、四川、云南和西 15 藏。這些地區氣候多變，冷熱無常，最高月平均氣溫3-l(TC，最低 月平均氣溫則在零下十幾度到幾十度，生長環境十分惡劣，只有耐 寒的苔草屬、蒿草屬以及少數高山多年生草本植物與之伴生， 一般 在此環境下的雪蓮植物大多為多年生，生長緩慢，人工栽培困難， 長期以來掠奪性采挖已使雪蓮資源嚴重匱乏，己使得雪蓮成為瀕危 20 物種，自然資源難以滿足臨床日益增長的需要。因此應用組織培養 的方法進行雪蓮的開發即可以滿足臨床對雪蓮藥物的需求，也可以 保護自然資源，維護生態環境。
現有技術表明，對雪蓮叢生苗的誘導與培養多為器官發生，采 用這方方法的問題是，生產雪蓮叢生苗的過程中會耗費很多人力、 25物力，并且，由芽生長的雪蓮叢生苗，生長狀態不均一，不便于后 期的利用與開發。國內有文獻報多多是對雪蓮愈傷組織進行繼代規模培養的報道，鮮有直接利用繼承代方式直接培養雪蓮叢生苗的報 道。
發明內容
本發明的第一個目的在于提提供了一種新疆雪蓮組織培養叢生
5苗及其大規模繼代培養的方法，該方法包括在MS改良培養基①上 誘導形成愈傷組織；在MS改良培養基②上通過愈傷組織篩選和繼 代誘導出一種可穩定繼代、芽點突出的愈傷組織XCSY-1，該組織在 壯苗培養基上可迅速分化成狀態均一的叢生苗。通過對愈傷組織 XCSY-1進行繼代增殖，可大量培養出生長狀態均勻的新疆雪蓮叢生 io苗。該雪蓮叢生苗可直接作為產品或原料，又可培育生根試管苗進 行人工種植。
本發明第二個目的在于提供一種可迅速分化雪蓮叢生苗、高產、 穩定可繼代的新疆雪蓮愈傷組織XCSY-1，用于雪蓮叢生苗的生產。 本發明以新疆雪蓮(其種胚、根、莖、葉)作為外植體，誘導愈 15傷組織，通過與上組織誘導叢生芽，通過反復繼代培養和篩選得到 高產、穩定可繼代的的新疆雪蓮愈傷組織XCSY-1。該新疆雪蓮愈傷 組織XCSY-1具有以下特征生長旺盛、顏色呈嫩綠色或黃綠色， 結構緊湊、帶有明顯尖狀突起組織，培養周期15-20天。 、 具體地說，本發明通過如下方法制備得到上述雪蓮愈傷組織 20 XCSY-1:
(1)新疆雪蓮無菌苗的培育
取天然新疆雪蓮的種子，已通過中國科學院研究所標本館(國
家植物標本館)鑒定，用75%的酒精溶液浸泡30秒，用0.1%升汞 溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5次；用含有赤霉素 25 1.0mg/L_0.2 mg/L的溶液中浸泡24小時；浸泡24小時后，將種子 再次使用0.1%升滎溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5 次；在無菌條件下剝去種子外殼，撕去種子內膜，將去皮種子接種在配好的植株誘導MS培養基(赤霉素1.0mg/L—0.2mg/L)上，每 40毫升培養基播種10粒種子；在25。C下，避光培養4-6天，待種 子發芽后，將培養物轉移至光照條件下培養3-5天，培養成雪蓮植 株。
5 (2)愈傷組織的誘導和培養
取無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽做外植體，在無菌條件下，用 無菌手術剪刀和無菌鑷子將無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽切成 2-5mm長的小段，接種在MS改良培養基①(MS基本培養基+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAAl-3mg/L+蔗糖3。/o+瓊脂0.60/。)上，22-27。C暗培 io養，7-10天誘導出愈傷組織。
(3) 誘導愈傷組織XCSY-1 將誘導形成的愈傷組織轉至MS改良培養基②(MS基本培養基
+6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAAO.l-l.Omg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%)上，誘 導愈傷組織XCSY-1，繼代時間15-20天，培養溫度為22。C-28。C， 15光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天。
(4) 叢生芽繼代培養
篩選愈傷組織XCSY-1細胞系，選取生長旺盛、顏色為嫩綠色 或黃綠色、結構緊湊、帶有明顯尖狀突起組織特征的愈傷組織進行 周期性的繼代培養。培養條件，每100mlMS改良培養基②中轉接愈 20 傷組織XCSY-12g，培養周期15-20天，培養溫度為22。C-28。C，光 照強度為2200-27001lix，光照時間為8-12小時/天；至培養期，選 取生長旺盛、顏色為嫩綠色或黃綠色、芽點突出特征的愈傷組織作 為種子，種子量為生產量的30%，其他轉入壯苗培養基中培養叢生 苗。
25 本發明的第三個目的在于提供上述雪蓮愈傷組織XCSY-1的繼
代培養方法，其所用培養基為MS改良培養基②(MS基本培養基 +6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAA O.l-l.Omg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%) pH值
85.2-5.8，培養條件每100ml MS改良培養基②中轉接愈傷組織 XCSY-1 2g溫度22-27°C ，光照10-12小時，培養時間15 20天。
本發明細胞系可用于雪蓮叢生苗的大規模生產，不僅滿足了臨床 需求，而且保護了國家珍稀植物野生雪蓮。
5 本發明的優點主要體現
(1)本發明提供一種可以迅速分化叢生苗，且可穩定繼代的雪
蓮愈傷組織XCSY-1細胞。通過在對愈傷組織XCSY-1進行繼代增 殖，從而能生產出大量的雪蓮叢生苗。(2)雪蓮叢生苗有效成份， 生長狀態與野生雪蓮相同，具有野生雪蓮的有效含量。(3)通過本 io 發明方法可進行大規模生產，與野生型相比生產周期大大縮短，并 且所生產的培養物質量穩定產量高。(4)本發明方法不占耕地，不 破壞雪蓮野生資源，保護了生態環境，解決了新疆雪蓮資源短缺的 問題。
具體實施例方式
15 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實
施例僅用于說明本發明，而不能限制本發明的保護范圍。
實施例l雪蓮愈傷組織XCSY-1的獲得
取天然新疆雪蓮的種子，用75%的酒精溶液浸泡30秒，用0.1% 升汞溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5次；用含有赤霉
20 素1.0mg/L—0.2 mg/L的溶液中浸泡24小時；浸泡24小時后，將種 子再次使用0.1%升汞溶液浸泡振蕩滅菌IO分鐘，用無菌水清洗4-5 次；在無菌條件下剝去種子外殼，撕去種子內膜，將去皮種子接種 在配好的植株誘導MS培養基(赤霉素1.0mg/L—0.2mg/L)上，每 40毫升培養基播種10粒種子；在25'C下，避光培養4-6天，待種
25 子發芽后，將培養物轉移至光照條件下培養3-5天，培養成雪蓮植 株。
取無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽做外植體，在無菌條件下，用無菌手術剪刀和無菌鑷子將無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽切成
2-5mm長的小段，接種在MS改良培養基①(MS基本培養基+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAAl-3mg/L+蔗糖3。/o+瓊脂0.60/0)上，22-27。C暗培 養，7-10天誘導出愈傷組織。 5 將誘導形成的愈傷組織轉至叢MS改良培養基②(MS基本培養
基+6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAA O.l-l.Omg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%)上誘 導雪蓮愈傷組織XCSY-1發生，繼代時間15-20天，培養溫度為22 °C-28°C，光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天。 篩選穩定、高產的叢生芽培養株，選取生長旺盛、顏色為嫩綠
io色或黃綠色、芽點突出特征的叢生芽進行周期性的繼代培養。每 100ml MS改良培養基②(MS基本培養基+6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAA 0.1-1.0mg/L+蔗糖3。/。+瓊脂0.6。/。)中轉接愈傷組織XCSY-1 2g，培 養周期15-20天，培養溫度為22°C-28°C ，光照強度為2200-27001ux， 光照時間為8-12小時/天；至培養期，選取生長旺盛、顏色為嫩綠色
15 或黃綠色、結構緊湊、帶有明顯尖狀突起組織特征的愈傷組織 XCSY-1作為種子，種子量不超過生產量的30%，其他轉入壯苗培養 基中培養叢生苗。
實施例2生產方法
1雪蓮叢生苗的生產
20 1.1選種
選取培養10-14天，長勢較好，顏色為嫩綠色或黃綠色、結構緊 湊、帶有明顯尖狀突起組織特征的雪蓮愈傷組織XCSY-1作種子。 1.2培養基
MS改良培養基②(MS基本培養基+6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAA 250.1-1.0mg/L+蔗糖3。/o+瓊脂0.60/0) 1.3接種
無菌條件下，挑取顏色為嫩綠色或黃綠色、結構緊湊、帶有明顯
尖狀突起組織特征的雪蓮愈傷組織XCSY-1于培養皿上切割成小塊組
織，將小塊組織轉接致叢生芽培養基中，接種塊大小為6-10mm。1.4雪蓮愈傷組織XCSY-1培養
培養溫度22-27°C，光照10h-12h、 20001ax;培養周期15-20天。
1.5叢生苗接種
5 菌條件下，挑取顏色為嫩綠色或黃綠色、結構緊湊、帶有明顯尖
狀突起組織特征的愈傷組織，將愈傷組織直接轉接至壯苗培養基中。。
1.6叢生苗培養培養溫度22-27。C，光照10h-12h、 20001ax;培養周期15-20天。
io 2培養物的收集及循環生產 2.1留種
大規模生產的同時，可以從中選擇顏色為嫩綠色或黃綠色、帶 有明顯尖狀突起組織，質地均勻、略偏硬為特征的雪蓮愈傷組織 XCSY-1留種，用于雪蓮愈傷組織XCSY-1的繼代增殖，選種量不能 15超過總生產量的15%。 2.2培養物的收集
培養成的新疆雪蓮叢生苗，低溫真空干燥，即可。根據需要， 可以將干燥的培養物磨成粗粉或細粉，或者使用苗的形態、或者用 來提取黃酮及其他活性成分。 20 經測定，用此方法進行的大規模生產成本較低，培養物生長速率 快，產量可達5-10克干重/月/升培養基；干品培養物中總黃酮含量 高，達培養物干重的2-4%，并且培養物質量穩定。在相同的時間里， 其生長的生物量遠遠大于自然條件下生長的新疆需雪蓮，前景廣闊。
25附表1培養基配方
成分名稱分子式分子量MS(mg/L)1/2MS (mg/L)
硝酸鉀KN03101.111900950
硝酸銨NH4N0380.041650825
l喊 l l 整KH2P04136,0917085
硫酸鎂MgS04.7H20246.47370185
氯化鈣CaCl2.2H20147.02440220
碘化鉀KI166.010.830.83
硼酸H3B0361.836.26.2
硫酸錳MnS04.4H20223.0122.322.3
硫酸鋅ZnS04.7 H20287.548.68.6
鉬酸鈉Na2Mo04.2H20241.950.250.25
硫酸銅CuS04.5H20249.680.0250.025
氯化鈷CoCl2.6H20237.930.0250.025
乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA372.2537.337.3
硫酸亞鐵FeS04.7H20278.0327.827.8
肌醇100100
甘氨酸22
鹽酸硫胺素(VB1)0.10.1
鹽酸吡眵醇(VB6)0.50.5
煙酸(VB5或VPP)0.50.5
添加附
圖1愈傷組織XCSY-1照片
附圖2雪蓮叢生苗照片
權利要求
1、權利要求1所述的一種新疆雪蓮組織培養叢生苗及其大規模繼代培養的方法，其特征在于，采用野生新疆雪蓮的種胚或由種子萌發的無菌苗為外植體，在含激素的MS(配方見附表1)改良培養基①(MS基本培養基+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA1-3mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％)上誘導愈傷組織；在含激素的MS(配方見附表1)改良培養基②(MS基本培養基+6-BA2.0-4.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％)上通過愈傷組織篩選和繼代誘導出一種可穩定繼代、芽點突出的愈傷組織XCSY-1；將愈傷組織XCSY-1轉接至壯苗培養基上壯苗，形成新疆雪蓮叢生苗。具體操作按下列步驟進行a、植株誘導選取成熟的雪蓮種子，用75％的酒精溶液浸泡30秒，用0.1％升汞溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5次；用含有赤霉素2.0-1.0mg/L的水溶液中浸泡24小時；浸泡24小時后，將種子再次使用0.1％升汞溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5次；在無菌條件下剝去種子外殼，撕去種子內膜，將去皮種子接種在配好的植株誘導MS培養基(MS基本培養基+赤霉素2.0-1.0mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％)上，每40毫升培養基播種10粒種子；在25℃下，避光培養5天，待種子發芽后，將培養物轉移至光照條件下培養4天，培養成雪蓮植株；b、誘導愈傷組織取無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽做外植體，在無菌條件下，用無菌手術剪刀和無菌鑷子將無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽切成2-5mm長的小段，接種在MS改良培養基①(MS基本培養基+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA1-3mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％)上，22-27℃暗培養，7-10天誘導出愈傷組織。c、誘導愈傷組織XCSY-1將誘導形成的愈傷組織轉至MS改良培養基②(MS基本培養基+6-BA2.0-4.0mg/L+NAA0.1-1.0mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％)上，誘導愈傷組織XCSY-1，繼代時間15-20天，培養溫度為22℃-28℃，光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天。d、愈傷組織XCSY-1繼代培養選取生長旺盛、顏色為嫩綠色或黃綠色、結構緊湊、帶有明顯尖狀突起組織特征的愈傷組織進行周期性的繼代培養。培養條件，每100ml MS改良培養基②中轉接愈傷組織XCSY-12g，培養周期15-20天，培養溫度為22℃-28℃，光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天；至培養期，選取生長旺盛、顏色為嫩綠色或黃綠色、芽點突出特征的愈傷組織作為種子，種子量為生產量的30％，其他轉入壯苗培養基中培養叢生苗。e、叢生苗的培養將篩選出愈傷組織XCSY-1的轉至壯苗培養基(MS基本培養基+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％)中，愈傷組織分化，組織上生長出從生苗。培養期結束，叢生苗的葉片數為6-10片、凈高5-7cm。培養時間為15-20天，培養溫度為22℃-28℃，光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天。培養結束后，直接收集叢生苗并低溫真空干燥，成為新疆雪蓮叢生苗組織培養產品。
2、如權利要求1所述的一種穩定、高產，可繼代的新疆雪蓮叢 生芽培養株的繼代篩選方法，其特征在于，在MS改良培養基②上， 通過篩選誘導出一種可迅速分化叢生苗、穩定繼代的雪蓮愈傷組織 XCSY-1。該培養物經如下步驟得到 25 a、植株誘導選取成熟的雪蓮種子，用75%的酒精溶液浸泡30秒，用0.1% 升汞溶液浸泡振蕩滅菌IO分鐘，用無菌水清洗4-5次；用含有赤霉素2.0-1.0mg/L的水溶液中浸泡24小時；浸泡24小時后，將種子再 次使用0.1%升汞溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5次； 在無菌條件下剝去種子外殼，撕去種子內膜，將去皮種子接種在配 好的植株誘導MS培養基(MS基本培養基+赤霉素2.0-1.0mg/L+蔗 5 糖3%+瓊脂0.6%)上，每40毫升培養基播種10粒種子；在25X:下， 避光培養5天，待種子發芽后，將培養物轉移至光照條件下培養4 天，培養成雪蓮植株；b、 誘導愈傷組織取無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽做外植體，在無菌條件下，用 io無菌手術剪刀和無菌鑷子將無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽切成 2-5mm長的小段，接種在MS改良培養基①(MS基本培養基+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAAl-3mg/L+蔗糖3。/。+瓊脂0.6。/。)上，22-27。C暗培 養，7-10天誘導出愈傷組織。c、 誘導愈傷組織XCSY-1將誘導形成的愈傷組織轉至MS改良培養基②(MS基本培養基+6-BA2.0-4.0 mg/L+ NAAO.l-l.Omg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%)上，誘 導愈傷組織XCSY-1，繼代時間15-20天，培養溫度為22。C-28°C， 光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天。d、 愈傷組織XCSY-1繼代培養篩選愈傷組織XCSY-1細胞系，選取生長旺盛、顏色為嫩綠色或黃綠色、結構緊湊、帶有明顯尖狀突起組織特征的愈傷組織進行 周期性的繼代培養。培養條件，每100mlMS改良培養基②中轉接愈 傷組織XCSY-12g，培養周期15-20天，培養溫度為22°028"，光 照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天；至培養期，選取生長旺盛、顏色為嫩綠色或黃綠色、芽點突出特征的愈傷組織作 為種子，種子量為生產量的30%，其他轉入壯苗培養基中培養叢生 苗。
3、 根據權利要求1、 2所述的一種新疆雪蓮組織培養叢生苗及其大規模繼代培養的方法，其特征在于雪蓮種子的滅菌消毒條件為:75%的酒精溶液浸泡30秒，用0.1%升汞溶液浸泡振蕩滅菌10分鐘，用無菌水清洗4-5次；用含有赤霉素1.0mg/L的水溶液中浸泡24小 時；浸泡24小時后，將種子再次使用0.1%升汞溶液浸泡振蕩滅菌IO分鐘，用無菌水清洗4-5次。
4、 如權利要求2所述的一種可穩定繼代、芽點突出的愈傷組織XCSY-1，其特征在于，愈傷組織生長旺盛、顏色為嫩綠色或黃綠色、結構緊湊，帶有明顯尖狀突起組織、可進行周期性繼代培養。
5、如權利要求2所述的一種可迅速分化叢生苗、穩定繼代的愈傷組織XCSY-1，其特征在于，培養條件為每100mlMS改良培養基②中轉接愈傷組織XCSY-12g，培養周期15-20天，培養溫度為22°C-28°C，光照強度為2200-27001ux，光照時間為8-12小時/天。
6、 如權利要求1所述的愈傷組織XCSY-1繼代培養方法，其特 征在于，對愈傷組織XCSY-1轉接增殖，對從而增加叢生苗的數量。
7、 權利要求1所述的新疆新疆雪蓮組織培養叢生苗及其大規模繼代培養的方法，其特征在于所述的低溫真空干燥條件為真空回旋干燥，干燥溫度為4(TC。
全文摘要
本發明提供了一種新疆雪蓮組織培養叢生苗及其大規模繼代培養的方法，該方法包括在MS改良培養基①上誘導形成愈傷組織；在MS改良培養基②上通過愈傷組織篩選和繼代誘導出一種可迅速分化叢生苗、穩定繼代的愈傷組織XCSY-1，該組織在壯苗培養基上可迅速分化成狀態均一的叢生苗。通過對愈傷組織XCSY-1進行繼代增殖，可大量培養出生長狀態均勻的新疆雪蓮叢生苗。該雪蓮叢生苗可直接作為產品或原料，又可培育生根試管苗進行人工種植。該方法操作簡單，可用于大規模生產，與野生型相比生產周期大大縮短，并且質量穩定，產量高。此外，該方法不占耕地，不破壞雪蓮野生資源，保護了生態環境，解決了新疆雪蓮資源短缺的問題。
文檔編號A01H4/00GK101473790SQ20091001010
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月14日 優先權日2009年1月14日
發明者劉漢石 申請人:大連普瑞康生物技術有限公司;陳 梓;初 穎