專利名稱：：一種減少八仙花組培苗氣生根的方法
技術領域：
：本發明屬于植物組織培養
技術領域：
，具體涉及一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，以解決八仙花組培苗生根過程中產生氣生根的問題，提高八仙花的再生植株的移栽成活率。
背景技術：
：八仙花(^Krfra/^ea/2acro/A^7a)繡球花科，八仙花屬，落葉灌木，高l-2m，花色艷麗，花朵碩大，花期長，觀賞價值高，是重要的園林和室內盆花植物之一。近年來，隨著微型盆栽如'雪王后'(〃瓜'SnowQueen，)、'紅色新娘'瓜flushingBride，)等名優新品種的培育成功，微型八仙花在國內外市場越來越受到歡迎，其種苗供不應求。組織培養技術在苗木快繁中顯得越來越重要。與很多其他花卉一樣，在八仙花組培快繁過程中，通過增加繼代次數、應用細胞分裂素是提高繁殖系數常用的方法。但在提高增殖率的同時也很容易生成氣生根，即在培養基表面以上的莖的部位形成的根(如馬鈴薯)。氣生根的形成容易造成八仙花試管苗老化，主要表現為組培苗生長較弱，莖基根系少，生長差，試管苗的存活率低，導致移栽成活率不高，給生產推廣應用上帶來很大影響。前人有關八仙花的組培的報道主要集中在中國栽培的普通八仙花原種(^^ra/^ea/z7acro/A^7a)上。江弈鳳(1996)、邱運亮(2005)、任叔輝(2006)、雷亞靈(2008)等主要從八仙花快繁培養基和激素種類和濃度方面做了研究，尚未涉及有關氣生根的問題。由于八仙花品種來源不同，基因型的差異表現在快繁、增殖、生根培養等過程中產生氣根的差異性也不同。一般八仙花組培苗用膠化劑瓊脂蔗糖作為支撐物質，增殖后培養瓶內生根至瓶外，嚴重影響八仙花再生植株的移栽成活率。該問題到目前為止是八仙花離體繁殖的難題尚未解決。申請人分析，造成八仙花組培苗氣生根問題主要有以下幾個原因(1)品種的特異性，矮花盆栽八仙花品種中均有一定得氣生根的現象形成，個別品種特別嚴重。(2)培養瓶內透氣性差及其凝膠中水分較多，瓶內濕度較大，容易誘導八仙花形成氣生根。(3)繼代次數對氣生根的形成也有一定得影響。組培苗經過多次繼代，氣生根增加，生長較弱。(4)組培苗在高濃度的激素條件下，容易產生氣生根。在申請人所供試的10個八仙花微型品種中，隨著激素濃度和繼代次數的增加，繁殖系數增加，氣根數量相應增加但程度不同。為了滿足八仙花增殖率的需要，八仙花莖段在B5基本培養基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)1.Omg/L+B引哚丁酸(IBA)0.5mg/L+瓊脂7g/L的快繁增殖培養中，增殖率高，植株的生長速度較快，并生長健壯，但同時又導致氣生根的形成。現有文獻對八仙花離體生根的報道主要限于在生根培養基的篩選，但是有關植物組織培養特別是八仙花的快繁殖過程中外植體的生根是直接受到前處理(培養步驟和培養基)的影響，現有專利或非專利文獻都沒有涉及。
發明內容本發明的目的是提供一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，以解決八仙花組培苗生根過程中產生氣生根的難題，提高八仙花的再生植株的移栽成活率。本發明對八仙花組織培養中的關鍵步驟生根移栽做了試驗對比研究，利用珍珠巖作為支持體代替瓊脂，結合生根培養基的設計，解決了八仙花氣生根的問題，從而提高了莖基生根率和移栽成活效果。本發明采用以下技術方案申請人發明了一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，其步驟包括A:在培養瓶中加入40-60mL的珍珠巖，然后加入25-35mL液體生根培養基，所述的液體生根培養基成分及配比如下1/2B5基本培養基+萘乙酸或H引哚丁酸0.l-1.0mg/L+蔗糖10g/L，調pH至4-7，在12rC下高壓蒸汽滅菌20min，備用；B:在無菌環境下(例如在超凈工作臺中)，將苗高為l-2cm具有2片以上葉片的八仙花組培苗(組培苗獲得以前的培養步驟和培養基的設計參見實施例部分)的頂芽接種于A步驟制備的生根培養基上，在培養室內養30-50天；C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接將八仙花組培苗移栽到體積比為1:1的泥炭土珍珠巖的基質中；其中上述步驟A和B的培養條件是光照為1500-20001x，光照時間為16h.d—1，培養溫度為23_25°C:上述步驟C的移栽條件是遮蔭80%,保持相對濕度95%，栽培溫度為25'C;上述步驟A步驟的1/2B5基本培養基成分按mg/L計的成分及配比如下硝酸鉀1250.0;二水氯化鈣75,0;七水硫酸鎂125.0;硫酸氨67.0;磷酸二氫鈉75.0;碘化鉀0.375;硼酸1.5;四水硫酸錳5.0;七水硫酸鋅1.0;二水鉬酸鈉0.125;五水硫酸銅0.0125:六水氯化鈷0.0125;七水硫酸亞鐵13.9;乙二胺四乙酸二鈉18.7;肌醇50.0;煙酸0.5;鹽酸吡咳醇0.5;鹽酸硫胺素5.0。上述B5培養基參照報道的培養基配方制備(參見李明浚編譯，植物組織培養，中國農業出版社，1992年版)。本發明有益的效果是1、由于利用珍珠巖作為基質，加入一定比例的液體生根培養基，可有效調節培養瓶中的濕度，從而抑制了氣生根的形成，有利于在培養基里面形成正常根系。2、珍珠巖形成了疏松的、黑暗的環境，有利于誘導八仙花組培苗根的形成。明顯縮短了八仙花組培苗的生根時間，8天左右就能形成完整的根，本發明的生根率和移栽成活率均為100%。而且在該環境下，八仙花再生植株生長快速健壯。3、本發明利用珍珠巖作支持體，勿需瓶內煉苗后和清洗根系直接移栽，減少對根系的損傷，簡化了移栽程序，提高了移栽成活率。而且珍珠巖價格便宜，可重復循環利用，節約組培成本。4、本發明的培養基中，申請人將蔗糖含量從30g/L降低至10g/L，從而節約組培成本。5、本發明方法簡便、易行，操作方便，可提高矮化八仙花品種生根及移栽的效果。圖1A:培養30天后八仙花組培苗在50mL珍珠巖+25mL液體生根培養基(1/2B5基本培養基+IBA0.5mg/L蔗糖10g/L,pH5.8)中的生長情況；圖1B:培養30天后八仙花組培苗在瓊脂7g/L+l/2B5基本培養基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L,pH5.8的生根培養基中生長情況；圖2A:培養30天后八仙花組培苗在50mL珍珠巖+25mL液體生根培養基(1/2B5基本培養基+IBA0.5mg/L蔗糖10g/L，pH5.8)中的根系生長情況；圖2B:培養30天后八仙花組培苗在瓊脂7g/L+l/2B5基本培養基+IBAO.5mg/L+蔗糖10g/L，pH5.8的生根培養基中根系生長情況。圖3:八仙花組培苗在珍珠巖支持體上生根和移栽成活情況。圖4:珍珠巖基質中不同液體生根培養基(1/2B5基本培養基+IBAO.5mg/L+蔗糖10g/，調pH至5.8)用量情況下八仙花組培苗的生根情況，在圖4中圖4A:珍珠巖50mL+液體培養基25mL的液體生根培養基中的八仙花組培苗的生根及防止氣生根的情況；圖4B:珍珠巖50raL+液體培養基35mL的培養基中八仙花組培苗的生根及防止氣生根的情況；圖4C:珍珠巖50mL-液體培養基15mL培養基中八仙花組培苗的生根及抑制氣生根的情況。具體實施方案實施例lA:在培養瓶中加入50mL的珍珠巖，然后加入25mL的液體生根培養基(1/2B5基本培養基+吲哚丁酸(IBA)0.2、0.5、1.Omg/L+蔗糖10g/Ll，調pH至5.8)，在121'C高壓蒸汽滅菌20min，備用B:在無菌條件下，將八仙花組培苗的頂芽(苗高l-2cm，具有2片以上葉片)，接入配好的生根培養基內，在培養室內培養30-50天(見圖1A,圖2)。C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，不需要清洗和煉苗，直接將組培苗移栽到為泥炭土珍珠巖體積比為l:l的基質中；上述步驟A、B的培養條件分別是光照為1500-20001x,光照時間16h.cT,培養溫度為23-25°C:上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網遮蔭80%，保持相對濕度95%，氣溫為10-25。C。在本實施例中，八仙花在B步驟的前處理(培養)的基礎培養如下實驗材料購自武漢花卉開發中心的八仙花'雪球'品種(^Kc/ra/^ea歷acro/7AW7a'Kuhnert')，取其幼嫩莖段，先在化洗衣粉漂洗10min,再在自來水中沖洗30rain，然后在無菌超凈工作臺上用75%酒精消毒30s后，用0.1%的升汞消毒8min，最后用無菌水沖洗3-5次，將八仙花莖段切割成1-2cm的帶芽莖段接種于誘導培養基上，所述的誘導培養基成分及配比如下(1)B5基本培養基+6-BA0.5mg/L+NAAO.01mg/L+蔗糖3%,調pH至5.8,在121'C高壓蒸汽滅菌20min。培養條件是光照為1500-20001x，光照時間16lLd—、培養溫度為23-25'C，經過30天的培養，腋芽誘導率達100%。以八仙花離體萌發的1.5cra腋芽莖段作為外植體接種于增殖培養基上，所述增殖培養基的成分及配比為B5基本培養基+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L，培養室光照為1500-20001x，光照時間為16h.d-'，培養溫度為23-25'C,培養30d,帶腋芽的八仙花離體莖段不經愈傷過程直接形成不定芽，其增殖系數可達10.6。然后取1-2cm再生苗頂芽，在無菌條件下轉入本發明制備的生根培養基(參見本實施例的步驟B)上，繼續完成八仙花組培苗的生根和防止氣生根的形成。表1珍珠巖生根培養基中不同濃度IBA對八仙花再生苗氣生根形成的影響處理編號及IBA水平氣生根率％基部生根率(％)平均根數(個)平均根長(cnO平均苗高(era)移栽成活率(％)再生苗生長狀況l號(IBA0.2mg/L)0.00100.007.371.472.25100.00無氣生根形成，植株生長較快，基部根細長。2號(IBA0.5mg/L)0.00■005.881.062.13100.00無氣生根形成，植株生長健壯健壯，葉片綠色，且基部根細長。3號(IBA1.0mg/L)2.25100.004.130.851.73100.00少量氣生根形成，葉片小而呈黃，且基部根粗短。實施例2培養室內盆栽場培養程序、培養條件和栽培管理同實施例1。具體步驟是A:在培養瓶中加入50mL生根培養基(1/2B5基本培養基+IBA分別設0.2、0.5、1.0mg/L三種配比+蔗糖10g/L+瓊脂7g/L，調pH至5.8)，在121'C高壓蒸汽滅菌20rain;B:將八仙花組培苗的頂芽(苗高l-2cra,帶2片以上葉片)，在超凈工作臺無菌條件下接入步驟A的生根培養基內，在培養室培養30-50天；C:將八仙花組培苗從步驟B的加有瓊脂的生根培養基中取出，洗凈根部的培養基，直接將八仙花組培苗移栽到泥炭土珍珠巖體積比為hl的基質中，移栽成活率可達50%左右。上述步驟A、B的培養條件分別是光照為1500-20001x,光照時間為16h.d—\培養溫度為23-25'C:上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網遮蔭80%,保持相對濕度95%，氣溫為10-25。C。表2瓊脂生根培養基中不同濃度IBA對八仙花再生苗氣生根的影響處理編號及IBA水平氣生根率(％〕生根率(%)平均氣根數(個)平均氣根長(cm)平均苗高(cm)移栽成活率(％)再生苗生長狀況l號(IEAO.2mg/L)80.0012.506.310.891.8060.00氣生根細長，基部沒有根形成，葉片綠色。2號(IBAO.5rag/L)80.000.007.370.511.7230,25氣生根多且短，基部沒有根形成，葉片稍微發黃。3號(]BAl.0mg/L)100.000.005.870.411.5620.00形成A色毛狀氣生根短壯，基部不形成根，葉片黃，且植株生長緩慢。實施例3培養室內和盆栽場培養程序、培養條件和栽培管理同實施例1。具體步驟是A:在培養瓶中加入50mL左右珍珠巖，然后分別加入0、15mL、25mL、35mL液體生根培養基(1/2B5基本培養基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L，調pH至5.8)，在121'C高壓蒸汽滅菌20min;6B:在超凈工作臺的無菌環境中，將八仙花組培苗頂芽(苗高l-2cm,2片以上葉片)，接入A步驟配制的生根培養基內，在培養室培養30-50天(見圖4A，B,C)。C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接將八仙花組培苗苗移栽到泥炭土珍珠巖體積比為l:l的基質中，移栽成活率可達100%。上述步驟A、B的培養條件分別是光照為1500-20001x，光照時間16h.d—、培養溫度為23-25°C;上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網遮蔭80%，保持相對濕度95%，氣溫為10-25。C。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4培養室內和盆栽場培養程序、培養條件和栽培管理同實施例1。具體步驟是A:在培養瓶中加入50mL珍珠巖，然后加入25mL液體生根培養基(1/2B5基本培養基+NM0.2，0.5，1.0mg/L+庶糖10g/L，調pH至5.8)，在121。C高壓蒸汽滅菌20min;B:在超凈工作臺的無菌環境中，將八仙花組培苗頂芽(苗高l-2cni，2片以上葉片)，接入A步驟配好的培養基內，在培養室培養30-50天；C:從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接讓苗移栽到泥炭土珍珠巖(體積比為1:1)的基質中，移栽成活率可達100%;上述步驟A、B的培養條件分別是光照為1500-20001x，光照時間16h.d—',培養溫度為23-25'C;上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網遮蔭80%,保持相對濕度95%,栽培溫度為10-25。C。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例5A:在培養瓶中加入50mL左右珍珠巖，然后加入25mL左右的液體生根培養基(1/2B5基本培養基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L，PH3、4、5、6、7、8),在121。C高壓蒸汽下滅菌20min。B:在無菌環境中，將八仙花組培苗頂芽(苗高l-2cm,2片以上葉片)，在無菌條件下接入配好的生根培養基內，在培養室培養30-50天。C:然后從珍珠巖中取出八仙花苗，勿需清洗和煉苗，直接讓苗移栽到泥炭土珍珠巖(體積比1:1)的基質中，移栽成活率可達100%。上述步驟A、B的培養條件分別是光照為1500-20001x,光照時間16h.d—'，培養溫度為23_25°C;上述步驟C的移栽和栽培條件分別是盆栽場用遮陽網遮蔭80%,保持相對濕度95%,栽培溫度為10-25°C。培養40天后結果如表5所示。表5珍珠巖基質中不同液體生根培養基pH值對八仙花氣生根的影響處理編號及pH值氣生根率(%)基部生根率(％)平均根數(個)平均根長(cm)平均苗高(cm)移栽成活率(％)再生苗生長狀況l號(pH3)4.25100.004.000.801.75100.00偶有氣生根形成，植株葉片發黃。2號(pH4)0.00100.005.251.052.33100.00無氣生根生根，葉片黃綠色3號(pH5)0.00100.005,571.212.17100.00無氣生根形成，植株健壯，基部根發達4號(pH6)0.00100.006.331.592.51100.00無氣生根形成，葉片綠色，基部根發達5號(pH7)0.00100.006.171.241.38100.00無氣生根形成，且葉片綠色，基部根生長較慢6號(pH8)0.00100.005.170.911.56100.00無氣生根形成，但植株生長較慢，葉黃綠色除上述實施方案外，本發明還有其他實施方案，凡采用同等替換等效變換形成的技術方案，均落在本發明的要求保護范圍內。參考文獻江奕鳳.繡球花的組織培養.亞熱帶植物通訊[J].1998，27(1):53.任叔輝.八仙花的組織培養與快繁技術.防護林科技[J].2006，1(70):10-11.李際紅,等.繡球組織培養技術的研究.山東林業科技[J].2002,139(2):20-28.龔偉.八仙花離體培養和植株再生.植物生理學通訊[J].2003,39(6):624-625.段新玲，等.大花圓錐八仙花組織培養及快速繁殖技術.塔里木農墾大學學報[J].1999(3):14-16.雷亞靈,等.八仙花莖段組織培養技術研究.西北林學院學報[J].2008,23(4):101-103.黃萍，等.GA3、NM、BA對馬鈴薯試管苗氣生根形成的影響.種子[J].2003(5):105-107。權利要求1、一種減少八仙花組培苗氣生根的方法，其步驟包括A在培養瓶中加入40-60ml的珍珠巖，然后加入25-35ml液體生根培養基，所述的液體生根培養基成分及配比如下1/2B5基本培養基+萘乙酸或吲哚丁酸0.1-1.0mg/L+蔗糖10g/L，調pH至4-7，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min，備用；B在無菌環境下，將苗高為1-2cm具有2片以上葉片的八仙花組培苗的頂芽接種于A步驟制備的生根培養基中，在培養室培養30-50天；C從珍珠巖中取出八仙花組培苗，勿需清洗和煉苗，直接將八仙花組培苗移栽到體積比為1∶1的泥炭土珍珠巖的基質中；其中上述步驟A和B的培養條件是光照為1500-2000xl，光照時間16h.d-1，培養溫度為23-25℃；上述步驟C的移栽條件是遮蔭為80％，保持相對濕度為95％，栽培溫度為25℃；上述步驟A的1/2B5基本培養基成分按mg/L計的配比如下硝酸鉀1250.0；二水氯化鈣75.0；七水硫酸鎂125.0；硫酸氨67.0；磷酸二氫鈉75.0；碘化鉀0.375；硼酸1.5；四水硫酸錳5.0；七水硫酸鋅1.0；二水鉬酸鈉0.125；五水硫酸銅0.0125；六水氯化鈷0.0125；七水硫酸亞鐵13.9；乙二胺四乙酸二鈉18.7；肌醇50.0；煙酸0.5；鹽酸吡哆醇0.5；鹽酸硫胺素5.0。全文摘要本發明屬于植物組織培養
技術領域：
，具體公開了一種減少八仙花氣生根方法，解決了八仙花組培過程中氣生根的問題，可提高八仙花組培苗的移栽成活率。本發明通過以下步驟實現以八仙花組培苗為實驗材料，接種于珍珠巖(40-60ml)+25-35ml液體生根培養基(1/2B5+NAA或IBA0.1-1.0mg/L+糖10g/LpH4-7)，30天后組培苗無氣生根形成，培養瓶內生根率達100％，移栽成活率可達100％。本發明不僅提高移栽成活率和簡化移栽操作程序，而且用珍珠巖代替瓊脂，可循環利用，節約了組培成本。文檔編號A01H4/00GK101578960SQ20091008760公開日2009年11月18日申請日期2009年6月24日優先權日2009年6月24日發明者峰劉,李揚麗,王彩云,黃麗莉申請人:華中農業大學