一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物兩步成苗組培快速繁殖的方法，具體是一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法。
【背景技術】
[0002]心葉小花苣笞(Chiritopsiscordifolia D.Fang et W.T.Wang)，為苦苣笞科小花苣苔屬草本植物。多數苦苣苔科植物具有清熱解毒、祛痰、止咳、平喘、活血散結、消腫止痛、除濕等功效，全草可用于治療跌打損傷，燙傷，瘡癤，對于各種炎癥、咳喘、瘡癤、風濕、跌打、燙傷、蛇蟲咬傷及婦科疾病有較好的療效。主要分布于我國廣西柳江、融安等縣，為廣西特有植物，既可觀賞，又是民間草藥。生于海拔100?260米的石灰巖山陡崖上，分布范圍小、繁殖困難，資源量極少，再加上近年來南方喀斯特地貌地區石漠化日益嚴重，全球變暖導致很多地區長期干旱，以及洞穴旅游的不合理開發使得苦苣苔植物賴以生存的環境嚴重受到破壞，地方種已處于瀕危狀態，甚至已經滅絕，對小花苣苔屬植物資源的保護和合理開發利用已刻不容緩。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法，能夠實現心葉小花苣苔的兩步成苗和快速繁殖，縮短心葉小花苣苔種苗生產周期，降低生產成本，提高種苗質量，為心葉小花苣苔大規模生產提供技術支持，對進一步保護和利用苦苣苔科植物資源、拯救物種具有十分重要的意義。
[0004]本發明通過以下技術方案達到上述目的:一種心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法，包括以下步驟:
[0005](I)外植體的消毒:取無病蟲害心葉小花苣苔的幼嫩葉片，用軟紗布擦拭表面污垢，流水沖洗2min，然后在超凈工作臺內用75v/v%的乙醇消毒15s，無菌水沖洗I次，再用0.lv/v% HgCl2消毒6min，無菌水浸泡2次，每次約lmin，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0006](2)無菌芽的誘導:將步驟⑴得到的外植體剪切成I?1.5cm2的葉片，接種于外植體誘導培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行培養7?12d開始萌發，隨后長出不定芽，所述外植體誘導培養基是以MS為基本培養基，還加入0.1?2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6_BA、0.05?1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8 ;
[0007](3)不定芽的增殖培養:將步驟(2)中得到的不定芽或芽叢置于MS增殖培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進行培養50d，長出更多的叢生芽，所述增殖培養基是以MS為基本培養基，還加入0.3?2.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.1-1.0mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8 ;
[0008](4)不定芽的生根:將步驟(3)中得到的叢生芽剪切為單芽置于1/2MS生根培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行生根培養10?15d便開始生根，所述1/2MS生根培養基是以1/2MS為基本培養基，還加入0.1?1.0mg/L的萘乙酸NAA,0.05?1.0mg/L的吲哚丁酸IBA,0.5?1.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8。
[0009]本發明的突出優點在于:
[0010](I)利用組織培養方法實現了心葉小花苣苔的兩步成苗和快速繁殖。縮短了心葉小花苣苔種苗生產周期，降低生產成本，提高種苗質量，為心葉小花苣苔大規模生產提供技術支持。
[0011](2)采用本發明所述的兩步成苗及組培快速繁殖的方法，外植體消毒培養7d便開始長出不定芽，30d出芽率為86.9%，生根率為89.5%，培養50d增殖系數為6.1。
【具體實施方式】
[0012]下面結合實施例對本發明的技術方案進一步說明。
[0013]實施例1
[0014]本發明所述的心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法一個實例，包括如下步驟:
[0015](I)外植體的消毒:取無病蟲害心葉小花苣苔的幼嫩葉片，用軟紗布擦拭表面污垢，流水沖洗2min，然后在超凈工作臺內用75v/v%的乙醇消毒15s，無菌水沖洗I次，再用0.lv/v% HgCl2消毒6min，無菌水浸泡2次，每次約lmin，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0016](2)無菌芽的誘導:將步驟⑴得到的外植體剪切成I?1.5cm2的葉片，接種于外植體誘導培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30 ymol/m2.S，光照時間為12h/d的條件下進行培養12d開始萌發，隨后長出不定芽。所述外植體誘導培養基是以MS為基本培養基，還加入0.lmg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養基的PH值為5.8，培養30d誘導率為68.4%。
[0017](3)不定芽的增殖培養:將步驟(2)中得到的不定芽置于MS增殖培養基中，在培養溫度為23±2°C，光照強度20?30ymol/m2.s，光照時間為12h/d的條件下進行培養50d，長出更多的叢生芽。所述增殖培養基是以MS為基本培養基，還加入0.3mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8，培養50d增殖系數為 3.8o
[0018](4)不定芽的生根:將步驟(3)中得到的叢生芽剪切為單芽置于1/2MS生根培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行生根培養，培養15d便開始生根。所述1/2MS生根培養基是以1/2MS為基本培養基，還加入0.lmg/L的萘乙酸NAA、0.05mg/L的吲哚丁酸IBA，0.5g/L的活性炭，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8，培養30d生根率為76.3%0
[0019]實施例2
[0020]本發明所述的心葉小花苣苔兩步成苗組培快速繁殖的方法另一個實例，包括如下步驟:
[0021](I)外植體的消毒:取無病蟲害心葉小花苣苔的幼嫩葉片，用軟紗布擦拭表面污垢，流水沖洗2min，然后在超凈工作臺內用75v/v%的乙醇消毒15s，無菌水沖洗I次，再用0.lv/v% HgCl2消毒6min，無菌水浸泡2次，每次約lmin，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，獲得外植體，其中無菌水為經高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0022](2)無菌芽的誘導:將步驟⑴得到的外植體剪切成I?1.5cm2的葉片，接種于外植體誘導培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30 μπιο?/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行培養，培養Sd開始萌發，隨后長出不定芽。所述外植體誘導培養基是以MS為基本培養基，還加入0.8mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8，培養30d誘導率為84.2%。
[0023](3)不定芽的增殖培養:將步驟(2)中得到的不定芽置于MS增殖培養基中，在培養溫度23±2°C，光照強度20?30 μmol/m2 *s，光照時間為12h/d的條件下進行培養50d，長出更多的叢生芽。所述增殖培養基是以MS為基本培養基，還加入0.8mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.lmg/L的萘乙酸NAA，5g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.8，培養50d增殖