專利名稱：一種吳茱萸的組織培養法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種吳茱萸組織培養的方法。
背景技術：
吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬其中的一個種，果實入藥，性熱，味辛、苦，具有散寒止 痛，降逆止嘔，助陽止瀉等功效，用于治療頭痛、疝痛、腳氣、痛經、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、口瘡 等，藥用價值很高；生于溫暖地帶山地、路旁或疏林下，其分布于廣東、廣西、貴州、云南、四 川、陜西、湖南、湖北、福建、浙江、江西等地。 吳茱萸花單性，雌雄異株，苗期雌雄株不易分辨且不同株系果實有效成分含量差 異大，造成生產上品種混雜嚴重，單位面積果實產量低；而傳統的種子或插條育苗方式，繁 殖系數低，分別僅為40-55% (而雄株率高達50% )和10%左右；嚴重影響到優良品種的 大規模應用和藥材品質的一致性和穩定性。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種吳茱萸的組織培養方法，采用該方法能獲得 大量的吳茱萸的種苗。 為了解決上述技術問題，本發明提供一種吳茱萸組織培養的方法，依次包括以下 步驟 1)、取無病斑、生長健壯的吳茱萸嫩芽進行流水沖洗； 2)、將上述流水沖洗后的嫩芽經常規消毒，然后切成0. 5 1. Ocm長的小段嫩芽I， 將上述小段嫩芽I接種到誘導不定芽培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強 度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和 暗培養交替進行； 3)、待小段嫩芽I上長出的不定芽長至2.0 3.0cm高的小苗I時，割取小苗I ; 將此小苗I切成0. 5 1. 2cm長的莖段I，將上述莖段I接種到增殖培養基上進行培養；培 養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養， 溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行； 4)、待莖段I上長出的不定芽長至2.0 5.0cm高的小苗時II，割取小苗n ;將此 小苗II切成0. 8 1. 2cm長的莖段II，將上述莖段II接種到增殖培養基上進行培養；培 養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養， 溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行； 5)、待莖段II上長出的不定芽長至3.0 5.0cm高的小苗ni時，割取小苗III ; 將此小苗III接種到生根培養基中；6)、待上述小苗III長出大于2cm的至少3條根時，得可出瓶種植的種苗。
作為本發明的吳茱萸的組織培養法的改進步驟2)中的誘導不定芽培養基為MS
基本培養基+BA 0. 5 1. Omg/l+IBA 0. 1 0. 5mg/l+糖20 30g/l+瓊脂5 9g/1， pH為5. 5 6. 0。 誘導不定芽培養基的制作方法具體如下以MS基本培養基作為基礎，分別加入 6_芐基腺嘌呤(BA)、乙哚丁酸(IBA)、糖和瓊脂，均勻混合，利用lmol/L的K0H或lmol/L的 HC1調節pH為5. 5 6. 0 ;每1L的MS基本培養基中加0. 5 1. Omg BA、0. 1 0. 5mg IBA、 20 30g糖和5 9g瓊脂。 作為本發明的吳茱萸的組織培養法的進一步改進步驟3)和步驟4)中的增殖培 養基均為MS基本培養基+BA 0. 3 1. Omg/l+IBA 0. 1 0. 3mg/l+糖20 30g/l+瓊脂 5 9g/l， pH為5. 5 6. 0。 增殖培養基的制作方法具體如下以MS基本培養基作為基礎，分別加入6-芐基 腺嘌呤(BA)和乙哚丁酸(IBA)、糖和瓊脂，均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L的HC1 調節pH為5. 5 6. 0 ;每1L的MS基本培養基加0. 3 1. Omg BA、0. 1 0. 3mg IBA、20 30g糖和5 9g瓊脂。 作為本發明的吳茱萸的組織培養法的進一步改進步驟5)中的生根培養基為 1/2MS基本培養基+NAA 0. 2 0. 5mg/l+糖30g/l+瓊脂5 9g/l， pH為5. 5 6. 0。
生根培養基的制作方法具體如下以1/2MS基本培養基(即溶液中所有物質的含 量為MS基本培養基的一半)作為基礎，分別加入萘乙酸(NAA)、糖、瓊脂，均勻混合，利用 lmol/L的KOH或lmol/L的HC1調節pH為5. 5 6. 0 ;每1L的1/2MS基本培養基加入0. 2 0. 5mgNAA、30g糖禾口 5 9g瓊脂。 作為本發明的吳茱萸的組織培養法的進一步改進步驟1)為將吳茱萸嫩芽放入 燒杯中，自來水沖洗1 2小時。 本發明所用的吳茱萸嫩芽的來源是購自浙江星光農業開發有限公司。 本發明的吳茱萸的組織培養法(離體培養的方法)，屬于一種誘導吳茱萸快速繁
殖的組織培養方法。依照植物組織培養中細胞全能性的原理，可以在短時間內生產大量遺
傳背景相同、長勢一致的優質種苗，而且依靠實驗室可以實現周年的長期提供優質種苗。在
本發明的方法中，將健壯的吳茱萸嫩芽先進行消毒，再通過合適的誘導培養基誘導獲得一
定量的無菌苗。采用本發明的方法，一般僅需60 80天即可得到可出瓶種植的種苗；因此
吳茱萸試管苗一周年內的繁殖系數理論上為512倍以上。本發明的吳茱萸組織培養法，是一
種不受季節等因素影響，高效、快速提供優質吳茱萸苗的方法，可以加速良種推廣速度，提
高田間品種種植產量。 本發明所得的種苗可采用以下方法進行種植把具有至少3條長于2cm根的種苗 移出培養瓶，洗凈其根部培養基，移栽到基質(由體積比為3 : 1 : l的泥炭、珍珠巖和蛭 石組成)中，于人工氣候箱室培養，培養條件溫度20 25t:，濕度85% 90%， 14 16 小時光照，光照強度15 25 ii mol m—2. s—、 10 8小時暗培養，上述光照和暗培養交替進 行；3 5周后，14 16小時光照，光照強度30 40iimo1 m—2. s—、 10 8小時暗培養，上
述光照和暗培養交替進行。 2個月后，存活率達到90%以上。 對購自浙江星光農業開發有限公司的10個株系wzyl wzy10，首先按照本發明的 方法獲得種苗，然后再將種苗按照上述方法進行種植，存活率均能達到90%以上。
具體實施例方式
實施例1、一種吳茱萸的組織培養法，依次進行以下步驟
1)、取無病斑、生長健壯的吳茱萸嫩芽放入燒杯中，自來水沖洗1 2小時；
2)、將上述嫩芽經常規消毒后(即0. 1 % w/v HgCl2處理6 10分鐘后，無菌水沖 洗5 8遍，然后用無菌濾紙吸干)，切成lcm左右的小段嫩芽I，接種到誘導不定芽培養基 上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C; 8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行； 誘導不定芽培養基為MS基本培養基+BA 0. 8mg/l+IBA 0. 3mg/l+糖25g/l+瓊脂 7g/l，pH為5.7。 3)、待小段嫩芽I上長出的不定芽長至2.0 3.0cm高的小苗I時，割取小苗I ; 將此小苗I切成lcm左右的莖段I，將上述莖段I接種到增殖培養基上進行培養；培養條件 為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為 20 22 °C ;上述光照和暗培養交替進行； 增殖培養基為MS基本培養基+BA 0. 7mg/l+IBA 0. 2mg/l+糖25g/l+瓊脂7g/l， pH為5. 5 6. 0。 4)、待莖段I上長出的不定芽長至2.0 5.0cm高的小苗時II，割取小苗n ;將此 小苗II切成0. 8 1. 2cm長的莖段II，將上述莖段II接種到增殖培養基上進行培養；培 養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養， 溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
增殖培養基同步驟3)的增殖培養基。 5)、待莖段II上長出的不定芽長至3.0 5.0cm高的小苗ni時，割取小苗III ; 將此小苗III接種到生根培養基中；培養條件為16小時光照，光照強度30 40ymo1 m一2. s一、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
生根培養基為1/2MS基本培養基+NAA 0. 4mg/l+糖30g/l+瓊脂7g/1， pH為 5. 5 6. 0。 6)、待上述小苗III長出大于2cm的至少3條根時，得可出瓶種植的種苗。 依照上述方法，只需60 80天即可獲得試管苗(種苗)；因此采用本發明的方法
可以長期得到大量的試管苗。 實施例2、一種吳茱萸的組織培養法，依次進行以下步驟
1)、取無病斑、生長健壯的吳茱萸嫩芽放入燒杯中，自來水沖洗1 2小時；
2)、將上述嫩芽經常規消毒后(即0. 1 % w/v HgCl2處理6 10分鐘后，無菌水沖 洗5 8遍，然后用無菌濾紙吸干)，切成lcm左右的小段嫩芽I，接種到誘導不定芽培養基 上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C; 8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行； 誘導不定芽培養基為MS基本培養基+BA 0. 5mg/l+IBA 0. 5mg/l+糖20g/l+瓊脂 5g/l，pH為5.7。 3)、待小段嫩芽I上長出的不定芽長至2.0 3.0cm高的小苗I時，割取小苗I ; 將此小苗I切成lcm左右的莖段I，將上述莖段I接種到增殖培養基上進行培養；培養條件 為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為20 22 °C ;上述光照和暗培養交替進行； 增殖培養基為:MS基本培養基+BA 1. 0mg/l+IBA 0. lmg/l+糖20g/l+瓊脂5g/l， pH為5. 7。 4)、待莖段I上長出的不定芽長至2.0 5.0cm高的小苗時II，割取小苗n ;將此 小苗II切成0. 8 1. 2cm長的莖段II，將上述莖段II接種到增殖培養基上進行培養；培 養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養， 溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
增殖培養基同步驟3)的增殖培養基。 5)、待莖段II上長出的不定芽長至3.0 5.0cm高的小苗ni時，割取小苗III ; 將此小苗III接種到生根培養基中；培養條件為16小時光照，光照強度30 40ymo1 m一2. s一、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
生根培養基為1/2MS基本培養基+NAA 0. 2mg/l+糖30g/l+瓊脂9g/1， pH為5. 7。
6)、待上述小苗III長出大于2cm的至少3條根時，得可出瓶種植的種苗。
依照上述方法，只需60 80天即可獲得試管苗；因此采用本發明的方法可以長期 得到大量的試管苗。 實施例3、一種吳茱萸離體培養的方法，依次進行以下步驟
1)、取無病斑、生長健壯的吳茱萸嫩芽放入燒杯中，自來水沖洗1 2小時；
2)、將上述嫩芽經常規消毒后(即0. 1 % w/v HgCl2處理6 10分鐘后，無菌水沖 洗5 8遍，然后用無菌濾紙吸干)，切成lcm左右的小段嫩芽I，接種到誘導不定芽培養基 上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C; 8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行； 誘導不定芽培養基為MS基本培養基+BA 1. 0mg/l+IBA 0. lmg/l+糖30g/l+瓊脂 9g/l， pH為5. 5 6. 0。 3)、待小段嫩芽I上長出的不定芽長至2.0 3.0cm高的小苗I時，割取小苗I ; 將此小苗I切成lcm左右的莖段I，將上述莖段I接種到增殖培養基上進行培養；培養條件 為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為 20 22 °C ;上述光照和暗培養交替進行； 增殖培養基為MS基本培養基+BA 0. 3mg/l+IBA0. 3mg/l+糖30g/l+瓊脂9g/l ， pH 為5. 5 6. 0。 4)、待莖段I上長出的不定芽長至2.0 5.0cm高的小苗時II，割取小苗n ;將此 小苗II切成0. 8 1. 2cm長的莖段II，將上述莖段II接種到增殖培養基上進行培養；培 養條件為16小時光照，光照強度30 40 ii mol m—2. s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養， 溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
增殖培養基同步驟3)的增殖培養基。 5)、待莖段II上長出的不定芽長至3.0 5.0cm高的小苗ni時，割取小苗III ; 將此小苗III接種到生根培養基中；培養條件為16小時光照，光照強度30 40 mol m—2s—、溫度為26 28°C ;8小時暗培養，溫度為20 22°C ;上述光照和暗培養交替進行；
生根培養基為1/2MS基本培養基+NAA0. 5mg/l+糖30g/l+瓊脂5g/l ， pH為5. 5 6. 0。
6)、待上述小苗III長出大于2cm的至少3條根時，得可出瓶種植的種苗。 依照上述方法，只需60 80天即可獲得試管苗；因此采用本發明的方法可以長期
得到大量的試管苗。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
一種吳茱萸的組織培養法，其特征是依次包括以下步驟1)、取無病斑、生長健壯的吳茱萸嫩芽進行流水沖洗；2)、將上述流水沖洗后的吳茱萸嫩芽經常規消毒，然后切成0.5～1.0cm長的小段嫩芽I，將上述小段嫩芽I接種到誘導不定芽培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30～40μmol m-2.s-1，溫度為26～28℃；8小時暗培養，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養交替進行；3)、待小段嫩芽I上長出的不定芽長至2.0～3.0cm高的小苗I時，割取小苗I；將此小苗I切成0.5～1.2cm長的莖段I，將上述莖段I接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30～40μmol m-2.s-1，溫度為26～28℃；8小時暗培養，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養交替進行；4)、待莖段I上長出的不定芽長至2.0～5.0cm高的小苗II時，割取小苗II；將此小茁II切成0.8～1.2cm長的莖段II，將上述莖段II接種到增殖培養基上進行培養；培養條件為16小時光照，光照強度30～40μmol m-2.s-1，溫度為26～28℃；8小時暗培養，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養交替進行；5)、待莖段II上長出的不定芽長至3.0～5.0cm高的小苗III時，割取小苗III；將此小曲III接種到生根培養基中；6)、待上述小苗III長出大于2cm的至少3條根時，得可出瓶種植的種苗。
2. 根據權利要求1所述的吳茱萸的組織培養法，其特征是步驟2)中的誘導不定芽培 養基為MS基本培養基+BA 0. 5 1. 0mg/l+IBA 0. 1 0. 5mg/l+糖20 30g/l+瓊脂5 9g/1， pH為5. 5 6. 0。
3. 根據權利要求2所述的吳茱萸的組織培養法，其特征是步驟3)和步驟4)中的增 殖培養基均為:MS基本培養基+BA 0. 3 1. 0mg/l+IBA 0. 1 0. 3mg/l+糖20 30g/l+瓊 月旨5 9g/1， pH為5. 5 6. 0。
4. 根據權利要求3所述的吳茱萸的組織培養法，其特征是步驟5)中的生根培養基 為1/2MS基本培養基+NAA 0. 2 0. 5mg/l+糖30g/l+瓊脂5 9g/l， pH為5. 5 6. 0。
5. 根據權利要求4所述的吳茱萸的組織培養法，其特征是所述步驟1)為將吳茱萸 嫩芽放入燒杯中，自來水沖洗1 2小時。
全文摘要
本發明公開了一種吳茱萸的組織培養法，包括以下步驟1)吳茱萸嫩芽進行流水沖洗；2)經常規消毒，然后切成0.5～1.0cm長的小段嫩芽I并接種到誘導不定芽培養基上進行培養；3)待小段嫩芽I上長出的不定芽長至小苗I時，將此小苗I切成莖段I并接種到增殖培養基上進行培養；4)待莖段I上長出的不定芽長至2.0～5.0cm高的小苗II時，將此小苗II切成莖段II并接種到增殖培養基上進行培養；5)待莖段II上長出的不定芽長至3.0～5.0cm高的小苗III時，割取小苗III并接種到生根培養基中；6)待上述小苗III長出大于2cm的至少3條根時，得可出瓶種植的種苗。采用該方法能獲得大量的吳茱萸的種苗。
文檔編號A01H4/00GK101790960SQ200910154310
公開日2010年8月4日 申請日期2009年11月30日 優先權日2009年11月30日
發明者毛碧增, 陳銀龍 申請人:浙江大學