防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株at31的制作方法

專利名稱：：防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株at31的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31，屬于植物保護
技術領域：
，專用于蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的無公害防治。二
背景技術：
：由根結線蟲(Me/o/^)gyMespp.)侵染引起的蔬菜根結線蟲病是國內外最為嚴重的植物病害之一，可為害黃瓜、冬瓜、西瓜、絲瓜、番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、萵苣、菠菜、胡蘿卜、白菜、豆科蔬菜等大多數蔬菜。由植物寄生線蟲侵襲寄生引起的植物病害，受害植物可因侵入線蟲吸收體內營養而影響正常的生長發育；線蟲代謝過程中的分泌物還會刺激寄主植物的細胞和組織，導致植株畸形，使農產品減產和質量下降；此外，還可以通過線蟲危害，加劇其它病害的發生，尤其是保護地蔬菜，致使寄主常年減產15-25%，有時達70%以上，嚴重地制約了大棚蔬菜、果樹、花卉等作物的生產和出口創匯，有的甚至到了無法種植的地步。據估計，我國農作物的生產每年因根結線蟲的為害而遭受的經濟損失達數億元以上。根結線蟲病害屬于土傳病害，防治十分困難。目前，人們主要采取有機磷類化學殺線蟲劑、選種抗病作物品種、實施輪作、建立無病種苗基地和對進出口農作物進行嚴格的檢疫來控制根結線蟲病害的發生。化學殺線蟲劑雖防效顯著，但其選擇性差，破壞農作物的生態環境；不易降解，高殘留，對人畜極不安全；破壞土壤結構，造成土壤沙化；抗藥性問題日益突出。水稻紋枯病是由土壤真菌立枯絲核菌(朋izo加m'asoto"ZKuhn)引起的一類嚴重制約水稻生產的全球性水稻病害，是我國水稻三大主要病害之一。由于紋枯病菌腐生能力強，寄主范圍廣，尤其是隨著水稻優質品種的推廣和高肥密植技術的應用，該病危害日趨嚴重，每年都會給水稻生產造成一定損失，發病嚴重的區域水稻可減產50%。直接威脅水稻的穩產高產。水稻不同品種間對紋枯病的抗性雖有一定的差異，但至今尚未發現免疫和高抗品種。我國防治水稻紋枯病主要依靠抗生素類農藥井岡霉素，品種單一，加之該藥己使用多年，當季使用次數過多，用藥量大，極易誘導抗藥性產生或有的已產生抗藥性，同時，也使農業成本增加。綜上所述，開發新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑控制蔬菜根結線蟲病、水稻紋枯病的發生是提高社會生產總量的需要，同時更是農業安全可持續發展的需要，符號社會發展需求。現有技術中按照本實驗室的菌體保藏液專利(公開專利號CN1358838,公開日2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存23年。
發明內容技術問題針對現有技術中沒有對蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病有較高防效的生防制劑的現狀，提供開發一種防治蔬菜根結線蟲病害和水稻紋枯病的單一生防菌菌株及其菌劑，該菌劑對這兩種重要土傳病害的防效均在50%以上，并且有增產功能。技術方案防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31,為蠟狀芽孢桿菌屬(SflC77/^c^e^)，2009年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.3128。生防菌株AT31用于制備生防菌劑的方法為將上述生防菌株AT31在PDA培養液30。C180rpm振蕩培養20-24h，然后6000rpm離心10min，取AT31濕菌與菌體保藏液(專利號ZL02112559.7，公開專利號CN1358838)，按質量體積比為l:40配成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為lxlO、lxl01Gcfii/ml。菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0.001mol/L的Tween20(非離子型表面活性劑)。上述生防菌劑在防治溫室蔬菜根結線蟲病方面的應用方法為，每畝3升AT31菌株制劑在作物移栽前做成堆肥使用，或者每畝6升AT31菌株制劑，稀釋100倍后在移栽時灌根使用。在水稻紋枯病方面的應用方法為每畝用AT31菌株制劑3升，稀釋10倍后對水稻莖基部進行噴霧處理。有益效果本發明的優點和積極效果表現在本發明是專門針對蔬菜根結線蟲病、青枯病、疫病和水稻紋枯病等土傳病害開發的生防制劑。由于是生物制劑，'完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬菜的無公害生產，農民可以不用或減少其他防治蔬菜根結線蟲病化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利于蔬菜的出口。同時，該菌劑還有增產功能，可為農民增加收入。溫室實驗表明該菌制劑能顯著降低根結線蟲的侵入，并兼有促進番茄生長的作用。該菌劑可以稀釋100倍后在幼苗移栽時灌根使用，或者經過堆肥制成微生物肥料在幼苗移栽前一周使用，對黃瓜、絲瓜、番茄等蔬菜根結線蟲病的防效在5875%，增產在30%以上，對番茄的防效在74.31%，增產43.35%(表l)。利用AT31生防菌劑對水稻莖基部進行噴霧處理，對水稻紋枯病的溫室防效在60%以上，增產20%以上(表2)。該菌劑用濕菌與本實驗室的菌體保藏液(屬本實驗室已授權專利，專利號ZL02112559.7，公開專利號CN1358838,公開日2002年7月17日)按l:40(g/ml)配成菌劑，可室溫保存23年。菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0.001mol/L的Tween20(非離子型表面活性劑)。四具體實施例方式1、AT31生防菌劑的制備本發明涉及一種防治溫室蔬菜根結線蟲病、青枯病、疫病和水稻紋枯病的生防菌株AT31，為蠟狀芽孢桿菌屬(5""7/^cew^)，2009年6月18日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.3128。由南京紫金山森林土壤中分離得到。將上述生防菌株AT31在PDA培養液30°C180rpm振蕩培養20-24h，然后6000rpm離心10min，取AT31濕菌與菌體保藏液(專利號ZL02112559.7，公開專利號CN1358838)，按質量體積比為1:40配成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1><109~lxl01Qcfo/rnl，保存備用。菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為O.OOlmol/L的Tween20(非離子型表面活性劑)。2、溫室盆缽試驗檢測AT31生防菌劑對根結線蟲病的防效移栽2天后，用40ml生防菌AT31(1(^CFU'ml'1)灌根處理番茄苗48缽；灌根處理2天后，將6ml(100條/ml)線蟲懸浮液稀釋滴注到番茄的根部，處理24缽。不用生防菌AT31進行灌根處理，直接接種線蟲懸浮液稀6ml(100條/ml)的作為對照處理(24缽)。在溫度2528'C，相對濕度40%，光照12h/12h條件下，培養8周后調查病級數，計算病害嚴重度和防效。對僅用生防菌AT31處理的番茄苗，8周后拔出，用水輕洗根系，分別測根長、莖長和干物質重量。按照Luc(1990)提出的病級標準記錄病級數，病害嚴重度和防效的計算公式如下-.Z(病植株數x病級數)病害嚴重度=-^-x100%總植株數x最高病級數對照病害嚴重度-處理病害嚴重度防效=x100%對照病害嚴重度增產效果的計算公式如下:處理產量-對照產量增產=-xl00%對照產量在移栽8周后的調査結果顯示，生防菌劑AT31對番茄根結線蟲病的防效高達74.31%;與對照相比，經AT31處理后番茄增產43.35%。表4-4溫室中生防菌劑AT31對番茄根結線蟲病的生防效果及促生作用處理生防效果(％)產量增加(％)根結線蟲水AT31阿維菌素水AT31阿維菌素水74.3140.8743.3515.563、溫室試驗檢測AT31生防菌劑對水稻紋枯病的防效水稻拔節期進行紋枯病溫室試驗。每桶4穴水稻，每桶接種水稻紋枯病菌接種體10g于水稻莖基部，套袋保濕24h后，AT31生防制劑稀釋100倍后對水稻莖基部進行噴霧處理(500ml/36穴)，保濕2天以利于發病。溫室溫度28_30°C，濕度85%-99%。AT31生防菌劑處理水稻莖基部21天后調査病情并統計防效。水稻收獲后計算增產率。防效調查水稻長至揚花前期，擱田調査水稻紋枯病情。調査方法采用雙行直線取樣法，每處理取10點，每點査5穴，調査病穴數，病穴病斑高度級別。病穴病斑高度的分級方法0級整穴不發病；1級一穴中少數植株發病或多數植株病斑在稻株1/4以上。2級多數病株病斑在1/4-1/2之間；3級多數病株病斑在1/2-3/4之間；.4級多數病株病斑在3/4以上；5級多數病株發病枯死。病害嚴重度與防效計算公式同"溫室盆缽試驗檢測AT31生防菌劑對根結線蟲病的防效"。生長指標測定調査病害嚴重度的同時調查各處理植株的根長、莖長、濕重、干重。水稻收割時分處理統計產量。結果顯示，AT31生防菌劑對水稻紋枯病的溫室防效在64.71%以上；生防菌劑AT31有明顯的促進水稻生長能力，增產率達22.33%。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、溫室試驗檢測AT31生防菌劑對蔬菜青枯病、疫病的防效辣椒苗移栽2天后，用AT31生防制劑稀釋100倍后進行灌根處理，灌根5天后接病原菌。30d后統計病情指數，計算防效。溫室試驗結果顯示AT31生防菌劑對蔬菜青枯病、疫病也有較好的防治效果，防效均高于50%。同時該菌劑還可以改善土壤板結現象。權利要求1、一種防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31，為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，于2009年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.3128。2、用權利要求1所述防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31制備的生防菌劑。3、用權利要求1所述防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31制備生防菌劑的方法，其特征在于將權利要求1所述防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31在PDA培養液30°C180rpm振蕩培養20-24h，然后6000rpm離心10min，取AT31濕菌與菌體保藏液按質量體積比為1:40配成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為lx109~lxl01Qcfii/ml，菌體保藏液為O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0.OOlmol/L的Tween20。4、權利要求2或3所述生防菌劑在防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病方面的應用。全文摘要本發明涉及一種防治溫室蔬菜根結線蟲病和水稻紋枯病的生防菌株AT31，屬于植物保護
技術領域：
。AT31菌株在PDA培養液37℃180rpm振蕩培養20～24小時，然后6000rpm離心10min，其菌劑成品中活菌總濃度為1×10⁹～1×10¹⁰cfu/ml，稀釋100倍后在蔬菜幼苗移栽時灌根使用，或者經過堆肥制成微生物肥料在幼苗移栽前一周使用，對番茄、絲瓜、黃瓜等蔬菜根結線蟲病的防效在58～82％。該菌劑稀釋100倍對水稻莖基部進行噴霧處理，對水稻紋枯病的防效為64.71％，增產22.33％。同時該菌劑還可以兼治蔬菜青枯病、疫病，改善土壤板結現象。文檔編號A01P5/00GK101671641SQ20091018404公開日2010年3月17日申請日期2009年8月12日優先權日2009年8月12日發明者劉紅霞,郭堅華,云陳,魏利輝申請人:南京農業大學