專利名稱：象草的快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種象草的快速繁殖方法，屬于植物細胞工程技術領域。
二背景技術：
象草(Pennisetum Purpureum Schumach)又名紫狼尾草，為禾本科狼尾草屬多年生草本植物，原產熱帶非洲，適宜在熱帶和亞熱帶地區栽培。象草不僅可作為草食畜禽和水
產魚類的優質青飼料，優質紙漿和中高檔復合人造板的理想原料，還是重要的生物質能源作物，國內外種植面積正在迅速擴大。 盡管象草為多年生草本植物，但在我國長江中下游及其相同緯度地區不能自然開
花結實，即使結實，也由于種子成熟期不一、易于落粒和發芽率極低的原因，國內外象草繁殖通常采用生長2個月左右的莖節為材料無性擴繁，具有繁殖系數低、操作費力費工的不足。江洪如等以矮象草幼嫩莖節為外植體，建立了矮象草的試管快繁技術體系(如江洪如，佘發新，王碧琴，劉騰云.矮象草的試管快繁技術研究，2003 :472，中國重要會議全文數據庫)，有效利用了幼嫩莖節，具有較高的繁殖系數；鐘小仙等以象草幼穗為外植體，建立了"象草體細胞培養植株再生方法"(ZL 200610085256. 2)，為利用象草幼穗進行種苗擴繁提供了可能，但存在現有幼穗離體培養不能誘導叢生苗，繁殖系數低的不足。本方法以象草幼穗為材料，通過改進培養基配方和培養條件，經幼穗愈傷組織誘導、叢生苗誘導以及增殖和壯根培養，具有繁殖率高、操作簡便的特點，為象草的快速繁殖提供了又一有效方法。
三
發明內容
本發明的目的在于提供一種以象草幼穗為外植體進行快速繁殖的方法，彌補現有象草繁殖技術以利用莖節為主的不足；通過改進培養基配方和培養條件，改進現有象草幼穗離體培養植株再生方法，通過誘導叢生苗，提高繁殖系數。 本發明的技術方案如下 利用象草幼穗為外植體，通過不同激素配比和改善光照條件，進行愈傷組織誘導和分化，促使愈傷組織直接分化為叢生苗，經叢生苗增殖和壯根培養，1個象草幼穗可產生85 406株細胞工程苗。 具體步驟如下 ①外植體的選擇與滅菌 選用象草的幼穗為外植體，在無菌條件下用70%的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗，切成2 3mm長的片段；
②幼穗愈傷組織誘導 把幼穗的切段接種于下列培養基中改良的MS(MS中鐵鹽含量加倍)+4. 0mg/L2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)+0. 05mg/L激動素(KT)+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;培養室溫度為26°C 28。C，光強1500 2000Lx，光照時間為16小時/天，培養時間為35 40d ;
③叢生苗誘導 將幼穗誘導的顆粒狀愈傷組織培養于下列培養基中改良的MS+3 4mg/L6-BA (或3 4mg/L KT) +30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;培養室溫度為26°C 28。C，光強2500 3000Lx，光照時間為16小時/天，培養時間為30 35d ;
④叢生苗增殖和壯根培養 將叢生苗中具有3張完整葉的分蘗在無菌條件切割分離后，分別接種于下列培養基中:MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;培養室溫度為26°C 28。C，光強3500 45000Lx，光照時間為16小時/天，培養時間為25 30d。 (2)細胞工程苗的苗床移栽 將上述根系發達、生長良好的細胞工程苗，移栽至溫室或大田苗床，環境溫度控制在25 35°C ;苗床的土壤具有較好的肥力，排灌方便，去除雜草，精細整地，做畦，畦長自定，畦寬l 1.5米為宜，行株距為20 25cmX10 15cm，移栽時澆透水，7d內保持土壤濕潤，14 20d時，可施用尿素2 3kg/666. 7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生長30d
以后，可作為種苗向大田移栽。
有益效果 本發明與現有技術相比具有如下優點和積極效果 以象草幼穗為外植體，1個幼穗產生的愈傷組織可分成2 3mm左右的愈傷組織團60 96塊，愈傷組織塊30 40d分化培養，再生植株的頻率80%以上，叢生苗誘導率75%以上，每個叢生苗具有3張完整葉片的分蘗有2 8個，增殖和壯根培養后，1個幼穗1次擴繁可產生細胞工程苗85 406株細胞工程苗，平均細胞工程苗繁殖系數為198株/穗；細胞工程苗溫室或大田苗床移栽成活率達98%，生長30d以后，可作為種苗用于大田種植，以1株大田生長的象草有效分蘗穗30個計，1株象草幼穗通過本方法可繁殖5811株種苗，象草按株行距40cmX40cm大田種植計，可滿足約1. 4畝大田象草種植的需要。
四
圖1幼穗誘導的愈傷組織
圖2愈傷組織分化的叢生苗
五具體實施例方式(1)外植體的選擇與滅菌 10月下旬至11月上旬，選用自然分化孕穗的象草N51 (公知公用，白淑娟，張運昌，陳德新.雜交狼尾草親本花期及主要植物學性狀[J].中國草地，1996，(3) :49-52)的幼穗為外植體，在無菌條件下用70%的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗。幼穗長度小于2cm，直接接種；幼穗長度2 5cm，切成2 3mm長的穗段；幼穗長度超過5cm，則取幼穗基部5cm以內部分，同樣切成2 3mm長的穗段。
(2)幼穗愈傷組織誘導 把幼穗的切段接種于愈傷組織誘導培養基，誘導時間為30 35d，培養室溫度為26°C 28。C，光強1500 2000Lx，光照時間為16小時/天。培養基配方為改良的MS(MS中鐵鹽含量加倍)+4. 0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)+0. 05mg/L激動素(KT)+30g/L蔗 糖+8g/L瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8，統計了 60個幼穗，愈傷組織誘導率為100%;
(3)叢生苗誘導 將幼穗誘導的顆粒狀愈傷組織分成2 3mm大小的愈傷組織團，接種于叢生苗誘 導培養基，培養時間為30 35d，培養室溫度為26°C 28。C，光強2500 3000Lx，光照時 間為16小時；培養基配方為改良的MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂 條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ;統計了 48個幼穗誘導的愈傷組織，可分成2 3mm大小的 愈傷組織團64-96塊，植株再生率(再生植株數/愈傷組織團數)平均為81%，2 8個分 蘗的叢生苗率(叢生苗數/再生植株數)為75. 2% ;
(4)叢生苗增殖和壯根培養 將叢生苗中具有3張完整葉的分蘗在無菌條件切割分離后，分別接種于下列培養 基中MS+4mg/L 6-BA(或4mg/L KT)+308/1蔗糖+88/1瓊脂條+0. 5g/L活性碳，pH值為5. 8 ; 培養室溫度為26°C 28。C，光強3500 45000Lx，光照時間為16小時，培養時間為25 30d ;1個幼穗產生莖和葉綠色、根系發育正常的細胞工程苗數為85 406株，30個幼穗產 生的細胞工程苗數總數為5930株，平均每個幼穗可生產細胞工程苗198株；
(5)細胞工程苗的苗床移栽 將細胞工程苗移栽至溫室，苗床環境溫度控制在25 35t:;苗床畦長6米， 畦寬1.5米，行株距為25X10cm，移栽時澆透水，7d內保持土壤濕潤，15d時，施用尿素 2kg/666. 7m、施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生長30d以后，可提供5811株生長健壯的種 苗供大田種植，細胞工程苗苗床移栽成活率達98%。
權利要求
象草的快速繁殖方法，其特征在于，(1)外植體的選擇與滅菌選用象草的幼穗為外植體，在無菌條件下用70％的酒精徹底擦拭包在幼穗外部的葉鞘和莖，剝出幼穗，切成2～3mm長的片段；(2)幼穗愈傷組織誘導把幼穗的切段接種于下列培養基中改良的MS+4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D+0.05mg/L激動素KT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0.5g/L活性碳，pH值為5.8；培養室溫度為26℃～28℃，光強1500～2000Lx，光照時間為16小時/天，培養時間為35～40d；其中改良的MS指的是MS中鐵鹽含量加倍；(3)叢生苗誘導將幼穗誘導的顆粒狀愈傷組織培養于下列培養基中改良的MS+3～4mg/L 6-芐基腺嘌呤6-BA或3～4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0.5g/L活性碳，pH值為5.8；培養室溫度為26℃～28℃，光強2500～3000Lx，光照時間為16小時/天，培養時間為30～35d；(4)叢生苗增殖和壯根培養將叢生苗中具有3張完整葉的分蘗在無菌條件切割分離后，分別接種于下列培養基中MS+3～4mg/L 6-BA或3～4mg/L KT+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂條+0.5g/L活性碳，pH值為5.8；培養室溫度為26℃～28℃，光強3500～45000Lx，光照時間為16小時/天，培養時間為25～30d；(5)細胞工程苗的苗床移栽將培養苗移栽至溫室或大田苗床，環境溫度控制在25～35℃；做畦，畦長自定，畦寬1～1.5米，行株距為20～25cm×10～15cm，移栽時澆透水，7d內保持土壤濕潤，14～20d時，可施用尿素2～3kg/666.7m2，施肥后雍根，并把尿素埋入土中，生長超過30d，可作為種苗進行大田移栽。
全文摘要
本發明涉及一種象草的快速繁殖方法，屬于植物細胞工程技術領域。以象草幼穗為材料，通過愈傷組織誘導、叢生苗誘導以及叢生苗增殖和壯根培養，進行象草細胞工程苗的快速擴繁；1個幼穗1次擴繁可產生細胞工程苗85～406株，平均細胞工程苗繁殖系數為198株/穗，細胞工程苗溫室或大田苗床移栽成活率達98％，經30d以上的生長，可作為種苗用于大田種植；本方法能改進已建立的“象草體細胞培養植株再生方法”不能誘導叢生苗的不足，是現有象草種莖無性擴繁和種莖細胞工程擴繁技術的有益補充，具有繁殖系數高、取材方便和操作簡便的特點，為象草產業化應用提供技術支撐。
文檔編號A01H4/00GK101703003SQ20091023492
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月20日 優先權日2009年11月20日
發明者張建麗, 梁流芳, 潘玉梅, 鐘小仙, 顧洪如 申請人:江蘇省農業科學院