專利名稱：：一種彎孢屬菌株及其用于防除雜草的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種近緣彎孢(CurvulariaaffinisBoedijn)的菌株PPF-002,含有該菌株的組合物及其防治狗尾草或馬唐的用途。
背景技術：
：雜草主要是通過與農作物爭奪水、肥、光、生長空間以及他感作用等抑制農作物的生長發育導致減產，據統計，每年因雜草危害造成的農作物減產9.7%，全世界達2億噸，中國因草害年損失農產品可達到近400萬噸。隨著人們生活水平的日益提高，各地區不斷地改善環境，尤其城市的綠化面積越來越大，草坪地也越來越多。草坪事業的發展以及草坪建植質量是人民生活水平的高低和國家文明建設程度的象征之一。雜草是草坪養護管理中的重點和難點，尤其禾本科雜草與北方地區廣泛采用的冷季型草坪草具有形態、生理生態的相似性，并且其發生不整齊，繁殖蔓延迅速，抗逆性和抗藥性強，防除非常困難，嚴重影響了草坪的美觀及功能。北京地區種植的草坪有草地早熟禾、高羊茅等，由于化學防治技術的薄弱及草坪管理不善，雜草引起的草坪退化甚為嚴重，新建草坪若不治理雜草，3-5年便被雜草替代，來不及拔除就只能更換草坪，造成了嚴重的浪費。在北京草坪禾本科雜草的調查中，狗尾草和馬唐分別被列為嚴重雜草和比較嚴重的雜草。狗尾草危害35個國家的29種作物，大多數為谷類、蔬菜和豆類作物。據報道，狗尾草被認為是谷子的原始祖先，約公元前6000年谷子被中國的耕作者從狗尾草中選育出來。自從第一種作物在中國和歐洲種植，狗尾草就已經成為作物田中的雜草。馬唐被作物世界18大惡性雜草之一，對于熱帶和溫帶環境適應能力都比較強，在非常多國家的很多種作物田中都能夠發現，生長繁殖快而又難于防除，在世界各地危害嚴重，曾被報道危害56個國家的33種作物。化學除草劑從應用至今已有60多年的歷史，曾挽回了約50%的糧食產量損失，在提高作物產量方面起到過不可低估的作用，同時也帶來了一系列的生態環境問題，尤其是多種雜草對化學除草劑產生了抗藥性，使得研制與開發化學除草劑的成本大大增加，因此研究人員不斷尋找新的途徑來防除雜草。目前，生物除草劑多是利用真菌，故將利用真菌研制的生物除草劑稱之為真菌除草劑，它是一類施用技術和方法類似化學除草劑并用以防治特定雜草的活真菌產品。因而研究除草效果好且具有潛在應用價值的真菌資源是真菌除草劑研究方面重要的前期基礎性工作。
發明內容為獲得對禾本科雜草有效的微生物，發明人從全國各地采集了大量的寄生于禾本科雜草上的真菌標本，通過篩選，發現一種屬于彎孢屬的新菌株PPF-002，具有很好的防治禾本科雜草狗尾草和馬唐的效果。因此，本發明的目的是提供一種彎孢屬的菌株PPF-002。本發明的新菌株PPF-002已經于2010年1月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCCNo.3569。該菌株為近緣彎孢(CurvulariaaffinisBoedijn)，隸屬于旋孢腔菌屬(CochliobolusDrechsler)[無性階段彎孢屬(CurvulariaBoedijn)]，格孢腔菌科(PleosporaceaeNitschke)，格孢腔菌目(PleosporalesUittrellexBarr)，格孢腔菌亞纟岡(Pleosporomycetidae)，座囊菌纟岡(Dothideomycetes)，子囊菌門(Ascomycota)，真菌界(Fungi)。本發明的新菌株PPF-002是通過下述途徑獲得的，發明人對北京地區的農田、草坪、荒地環境狗尾草和馬唐的發病情況進行調查并采集發病的植物葉片和莖稈，記錄植株發病癥狀及有關信息，回實驗室后進行鏡檢。l病原真菌的分離分離用培養基的制備用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PotatoDextroseAgar,PDA)，12rC濕熱滅菌30分鐘，在滅菌的平板中加入3滴25X乳酸后，倒入適量PDA培養基，輕搖混勻后靜置。從野外采集有典型葉斑癥狀的葉片用于病原菌的分離。將供試樣品病健交界處切取5mmX5mm的組織塊，置4%次氯酸鈉溶液小燒杯中3至5分鐘，無菌水漂洗3次，移至分離用PDA培養基上培養，每平板置4個組織塊，每份樣品接種兩皿；每份樣品分離前更換漂洗用的三個小燒杯中無菌水。在培養箱中25t:條件下培養35天，純化長出的病原真菌，將菌株接種至PDA斜面上于4t:冰箱中保藏。2病原真菌的鑒定2.1菌株的形態學鑒定對分離出來的菌株鏡檢，觀察產孢情況，對未產孢的菌株轉到燕麥培養基(OatmealAgar)、水瓊脂培養基(TubeWaterAgar)、玉米粉培養基(CMA)上促使其產孢。將菌株接種在適宜的培養基上，26t:恒溫培養3天，記錄菌落形態，取直徑2cm的菌餅放在鋪有兩層濕潤濾紙的培養皿中，4天后挑取少量菌絲制片，觀察記錄孢子形態及產孢結構，測量孢子(30個)和孢子梗寬度等，進行詳細描述，查閱專著文獻進行鑒定。菌株PPF-002的形態特征與Sivanesan對近緣彎孢CurvulariaaffinisBoedijn的描述(SivanesanA.，GraminicolousspeciesofBipolaris，Curvularia,Drechslera，Exserohilumandtheirteleomorphs.MycologicalP即ers，1987，158:1261.)基本一致，鑒定結果為C.affinis。描述如下在PDA培養基上菌落灰黑，表面灰白色，絮狀，菌落背面黑色，易產孢。菌絲黃褐色，有分枝，多隔膜；分生孢子梗單生或稀疏叢生，直立或彎曲，曲膝狀延伸，黃褐色，基部細胞膨大，頂端細胞色淺，多數分生孢子梗寬4.57.5m。分生孢子多數直，有的彎曲，淺褐至黃褐色，兩端細胞較小色淺，頂端細胞近無色，中間細胞大色深，寬紡錘形或橢圓形，多數具4個隔膜，少數3個隔膜，大小19.535X712.5iim，平均24.5X10.5iim;臍部略突出。2.2菌株的DNA提取、PCR擴增及擴增產物的序列分析在PDA平板上鋪玻璃紙，然后把供試菌株(PPF-002)接種到玻璃紙上，待菌落接近長滿平板時從玻璃紙上收獲菌絲體，用SDS法提取基因組DNA(LeeSB&TaylorJW，1990.IsolationofDNAfromfungalmyceliaandsinglespores.In:InnisMA，GelfandDH，SninskyJJ，WhiteTJed.PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications.AcademicPress,SanDiego，282287.)，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。以上述基因組DNA為模板，用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')對供試菌株rDNA的ITS區域進行PCR擴增。反應液體積50iiL，包括10XPCR緩沖液(100mmol/LTris-HCl(pH8.8)，500mmol/LKC1，0.8%NonidetP-40)5iiL，25,1/LMgC125iiL，引物ITS4(10iimol/L)和ITS5(10iimol/L)各1iiL，10mmol/LdNTP2yL，5U/iiLTaqDNA聚合酶0.4iiL，基因組DNAlyL，雙蒸滅菌水34.6iiL。PCR反應程序95。C預變性2min后，95。C變性lmin，53。C復性lmin，72。C延伸2min，進行34個循環，最后72。C延伸10min，4t:保存。PCR產物在1.4%瓊脂糖凝膠中電泳分離后，于溴化乙錠溶液(0.5iig/mL)中染色15min，通過ALPHA凝膠成像系統顯示記錄電泳結果。PCR擴增產物經檢測后送到上海英駿生物技術有限公司測序，測序引物為ITS5。對PCR產物進行序列測定，獲得的rDNAITS序列經在NCBI上進行Blast比對，供試菌株與Genbank中Curvulariaaffinis(登錄號AF071335)同源性最高，為100%。序列比較結果與形態學鑒定結果相符。將菌株PPF-002的序列在GenBank上進行了登錄(登錄號為GU073105)。本發明還提供一種除草組合物，包含本發明的近緣彎孢新菌株PPF-002和農藥學上可接受的載體。所述的菌株PPF-002可以以被培養的活細胞、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式用于除草組合物中，所述的活細胞可以是分生孢子、菌絲或含有分生孢子和菌絲的菌絲體的形式，優選使用該菌株的分生孢子。含有菌株PPF-002和載體的本發明除草組合物可被加工成多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑、水分散粒劑等，優選加工成適于噴灑施用的劑型。上述劑型所使用的載體是農藥學上可接受的載體，優選農藥領域常用的且在生物學上是惰性的載體，可以是固體的或液體的形式。固體載體的實例包括礦物，如粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土；植物材料，如玉米粉、豆粉或淀粉；高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二醇。液體載體的實例包括各種有機溶劑，如癸烷和十二烷；植物油；礦物油和水。根據需要，本發明的除草組合物可使用表面活性劑、粘合劑、穩定劑等助劑，表面活性劑如吐溫20、吐溫so等，穩定劑可使用抗氧化劑和/或ra調節劑等。本發明除草組合物中的菌株PPF-002的分生孢子數量隨制劑的形式和施用的方法而變化。固體制劑中，分生孢子的數量為1X1051X1()8個孢子/克，優選5X1051X10S個孢子/克，而對于液體制劑，稀釋后的噴灑液中分生孢子的含量通常為2.0X1041.0X107個孢子/mL，優選1.0X1051.0X106個孢子/mL。本發明的除草組合物可以與其它適合的化學除草劑配合使用，從而降低化學除草劑的用量，減少對環境的污染。本發明的除草組合物可以與其它適合的微生物及其產品如生物肥料、對其他雜草防除效果較好的菌株等配合使用，以增加菌株的用途，減少對環境的污染。本發明的菌株PPF-002或除草組合物可用于防除禾本科雜草中的狗尾草或馬唐。本發明的菌株PPF-002或除草組合物可用于農田和園林中，優選用于雙子葉作物、果園以及園林環境中防除狗尾草或馬唐。本發明對環境友好，可抑制雜草的耐藥和抗藥性發展，有利于綠色食品和有機農業的推廣，并且成本低、無污染、對農作物安全。生物學試驗1試驗方法1.1多個菌株對狗尾草和馬唐致病性的篩選試驗將狗尾草和馬唐的種子播于直徑10cm的營養缽中，于光照培養架(光強150001ux，光照/黑暗交替12h/12h)培養至3-4片葉時，間苗至每盆約10株。將供試菌株移至玉米粉瓊脂培養基(CMA)平板培養，每菌10板，培養15-30天使其產生足量的孢子。無菌操作臺上用刮鏟刮取表面菌絲和孢子，無菌水沖洗平板表面，雙層無菌紗布過濾，加入0.1%吐溫-80，接種前用血球計數板鏡檢孢子懸浮液的孢子濃度，稀釋至1X105個/ml用來接種植株，對照用無菌水加入O.1%吐溫_80用來噴灑植株。用微型噴霧器噴灑至培養好并間過苗的植株上，噴至液體沿葉片流下，每株菌接種狗尾草和馬唐各6盆，每2盆為1處理，重復3次。接種后置于密閉容器中保濕24h，然后置于光照培養架上(同培養時光照條件)，接種后兩周內觀察發病情況。病害調查采用Horsfall&Barratt(1945)的方法進行(ChandramohanS&CharudattanR，2001.Controlofsevengrasseswithamixtureofthreef皿galpathogenswithrestrictedhostranges.Biologicalcontrol22，246255.)，病害按照病斑占整個葉片的面積分為12級，1級=0%，2級=0-3%，3級=3-6%，4級=6-12%，5級=12-25%，6級=25_50%，7級=50_75%，8級=75_88%，9級=88-94%，10級=94-97%，11級=97-100%，12級=100%，調查每株植株的每片葉片，記錄級數。每處理級數的平均數，轉換成相應病害級數的平均百分率，進行反正弦轉換后進行多重比較分析，數據采用SPSS11.5軟件進行統計分析。1.2測定近緣彎孢寄主范圍的試驗通過人工接種方法，測定PPF-002菌株對常見禾本科雜草、主要禾本科及非禾本科作物苗期的致病性，以了解其寄主范圍。將供試植物(名單見表2)種子播種于直徑10cm的塑料花盆中，每種植物播種6盆，在溫度為203(TC的溫室中培育。當供試植物達到24片真葉時進行接種，根據供試植物的植株大小每盆保留510株。將接產孢充分的PPF-002菌株菌落用刮鏟輕輕刮下，用含有0.05%吐溫-80的滅菌水配制懸浮液，經兩層紗布過濾，稀釋至血球計數板測得濃度為1.0X105個孢子/ml。采用孢子懸浮液噴霧法接種，用微型噴霧器將混勻的孢子懸浮液均勻噴灑到供試植株上。每種植物接種3盆，另3盆噴含0.05%吐溫_80的無菌水做對照。接種后的植株置于密閉容器內室溫下保濕培養24h，然后移到人工氣候箱中培養，每天光照/黑暗交替12h，光照度16500Lx，溫度32°C/25°C(光照/黑暗)、相對濕度80%。接種1周后按下述標準記載發病情況NS，無癥狀；LS，有零星病斑；MS，病斑較大、較多；SS，病斑遍布植物葉片，病斑融合，植株死亡。2測定結果2.1多個菌株接種狗尾草和馬唐后致病性的篩選結果從2007至2008年在北京地區采集的狗尾草和馬唐病害樣品中共分離出69株真菌。選擇其中有代表性屬種的ll株菌進行了狗尾草和馬唐的致病性測定，其中包括細極鏈格孢(Alternariate皿issima)2株，多節平臍蠕孢(Bipolarisnodulosa)1株，穗狀平臍蠕孢(B.spicifera)1株，近緣彎孢(Curvulariaaffinis)1株，香茅彎孢(C.cymbopogonis)1株，間型彎孢(C.intermedia)4株和鐮刀菌(Fusariumsp.)1株。(見表1)供試11個菌株中，有9株菌包括2株細極鏈格孢，1株多節平臍蠕孢，1株穗狀平臍蠕孢，1株近緣彎孢，1株香茅彎孢，2株間型彎孢和1株鐮刀菌對狗尾草和馬唐的致病效果與對照比均不顯著。另2株間型彎孢馬唐控制效果與對照比差異顯著(P=0.01)，但對狗尾草致病效果不顯著(見表l)。但供試菌株中，PPF-002(近緣彎孢Curvulariaaffinis)對狗尾草的致病性明顯，嚴重度為78.2%，對馬唐的致病性與對照比也是差異極顯著(P=0.Ol)，植株死亡率為30-55%。表l.供試菌株及其對馬唐和狗尾草接種后的病害嚴重度序號菌株接種時植株病害嚴重度葉片數馬唐狗尾草1茲erww/afewwfw'附fl(ZXL07125d)3-423.3A132.5A2茲er朋n'ote柳/訓'附a(DH08042-1)3-414.5A50.9A35z]po/a〃、(ZXL07127b)3-415A34.7A45z>o/an.s5pic!/era(DH08107⑩)3-418.4A61.5ACw/"ra/ar/a(PPF-002,ZXL07096al)3-427.9B78.2B6Cwvw/ar/acy附Zwjoogom、(DH08106③)3陽412.9A35.1A7Cwrra^w7'ar/她nnW"(DH08049-1)3-438.4B25.1A8CMrvw/ar/a(ZXL07093)3-414.6A26.5A9Cwrro/an'a/她mWa(DH08122E)3-417.7A26.7A10CMn^/fl7"Za/加er附W(2(DH08105E)3隱429.3B46.1A11尸腿r/w附sp.(DH08033⑧)3-416.5A20.9A12CK3-49A38A注1同列數據后相同字母表示基于方差的多重比較分析差異不顯著(P=0.01)。2.2測定近緣彎孢寄主范圍的試驗結果對10科22種植物進行了菌株PPF-002的接種試驗，狗尾草接種后3天開始發病，葉片上產生黃色至黃褐色小斑點，逐步擴大成黑褐色不規則形病斑，接種后14天后30_55%的植株枯萎死亡。該菌株除對狗尾草有很強的致病性，對馬唐也有一定的致病效果。但對禾本科其它雜草如稗草、牛筋草無致病性。對禾本科作物小麥、水稻、玉米、高梁和谷子接種后，未出現致病癥狀，與對照相比差異不顯著。供試的雙子葉植物包括作物、蔬菜等，如菊科的向日葵，十字花科的甘藍，葫蘆科的黃瓜，豆科的大豆，百合科的洋蔥，錦葵科的棉花，胡麻科的芝麻，茄科的番茄，傘形科的胡蘿卜等均無致病性。對于常見草坪草，如禾本科的高羊茅、黑麥草和早熟禾，豆科的白三葉等也進行了接種試驗，均未出現致病癥狀(見表2)。通過接種10科22種植物測定致病效果，表明菌株PPF-002寄主范圍相對較窄，對于狗尾草的致病性具有較強的專一性。表2菌株PPF-002對不同植物的致病性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注NS，無癥狀；LS，有零星病斑；MS，病斑較大、較多；SS，病斑遍布植物葉片，病斑融合，植株死亡。權利要求一種彎孢屬菌株PPF-002，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏日期2010年1月13日；保藏號CGMCCNo.3569。2.根據權利要求1所述的菌株PPF-002,在PDA培養基上菌落灰黑，表面灰白色，絮狀，菌落背面黑色，易產孢。菌絲黃褐色，有分枝，多隔膜；分生孢子梗單生或稀疏叢生，直立或彎曲，曲膝狀延伸，黃褐色，基部細胞膨大，頂端細胞色淺，多數分生孢子梗寬4.57.5m。分生孢子多數直，有的彎曲，淺褐至黃褐色，兩端細胞較小色淺，頂端細胞近無色，中間細胞大色深，寬紡錘形或橢圓形，多數具4個隔膜，少數3個隔膜，大小19.535X712.5iim，平均24.5X10.5iim;臍部略突出。3.—種除草組合物，包含權利要求1所述的菌株PPF-002和農藥學上可接受的載體。4.權利要求l的菌株PPF-002用于防除狗尾草或馬唐的用途。5.權利要求3的除草組合物用于防除作物田、荒地、園林和草坪環境中的狗尾草或馬唐的用途。6.根據權利要求5的用途，其中所述的作物優選雙子葉植物。全文摘要本發明涉及一種彎孢屬的新菌株PPF-002，名稱為近緣彎孢(CurvulariaaffinisBoedijn)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2010年1月13日，保藏號CGMCCNo.3569，該菌株對狗尾草的致病性強，并且有較強的專一性。菌株PPF-002與農藥領域常用的載體組成除草組合物可用于防除禾本科雜草狗尾草和馬唐，可與其他適合的微生物及其產品如生物肥料、對其他雜草防除效果較好的菌株等配合使用。文檔編號A01N63/04GK101712933SQ20101000101公開日2010年5月26日申請日期2010年1月18日優先權日2010年1月18日發明者牛永春,鄧暉申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所