專利名稱：一株具提高大豆對除草劑抗性的寡養單胞菌及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及一株處理大豆種子后可提高大豆對大 豆敏感除草劑產生抗性的寡養單胞菌及其制備方法和應用。
背景技術：
我國是大豆的故鄉，全國大豆種植面積達8000萬畝以上，每年大豆產量達1600多 萬噸。隨著農村土地流轉和耕作規模擴大以后，人工除草越來越受到限制，但目前大豆田的 化學除草劑對玉米的藥害比較大，而玉米田的除草劑對大豆的藥害也比較大，導致玉米和 大豆的間作難以實現。因此，如果對大豆種子進行微生物處理后可以使大豆抵抗對大豆敏 感的玉米田除草劑，就可以解決大豆和玉米混種問題，同時，可以解決玉米前茬使用玉米田 除草劑對后茬種植大豆的藥害問題。
除草劑阿特拉津(Atrazine)又名莠去津，全稱為2_氯-乙胺_6_異丙胺_1，3， 5_三嗪，是一種廣泛使用于玉米田的除草劑。阿特拉津是選擇性內吸傳導型苗前、苗后除草 齊U，用于玉米、高粱、甘蔗、果樹、林地等，可防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草，對某些多年 牛雜草也有一定的抑制作用。目前，阿特拉津在世界各地得到了大面積的使用。在美國，阿 特拉津被列為使用最廣泛的除草劑之一。在1980-1990年間，每年噴灑阿特拉津達8000萬 磅，1986年，瑞典全國施用了 120t的阿特拉津。20世紀60年代以來，許多國家均致力于尋找高效降解阿特拉津的微生物。到目前 為止，已分離出能徹底降解阿特拉津的單菌株。阿特拉津生物降解機理的研究也獲得了迅 速發展。近兩年來，國內也開始了阿特拉津生物降解的研究報道，但缺乏利用微生物的誘導 使敏感農作物產生對阿特拉津的抗性研究。由于阿特拉津具有難降解和在土壤中持留期長的特點，容易影響后茬敏感作物正 常生長，尤其對豆科作物危害更大。因此，阿特拉津的環境問題得到了廣泛的關注。為了消 除阿特拉津在農田環境中的殘留對后茬豆科作物的影響，本研究分離、篩選可以誘導大豆 產生抗阿特拉津的菌株，通過此種方法使大豆生長不受阿特拉津殘留或阿特拉津的影響， 為豆科作物抗均三氮苯類除草劑的研究提供基礎。
發明內容
本發明的目的是選擇一株菌株處理大豆種子可以使大豆產生對其敏感除草劑產 生抗性，將菌株按常規液體發酵培養后，該菌體活體或代謝產物可以形成生物農藥用于處 理大豆種子，使大豆產生對阿特拉津的抗性。本發明篩選到的一株處理大豆種子可以使大豆產生對除草劑莠去津(阿特拉津) 產生抗性的細菌菌株是Sneb 42，其分類學命名為嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Sneb 42，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保 藏日期2010年2月1日；保藏登記入冊的編號CGMCC No. 3620。嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)Sneb 42該菌株是段玉璽于2006年5月從中國遼寧省沈 陽市沈河區沈陽農業大學試驗地土壤細菌菌株中篩選出的一個細菌菌株。本發明通過研究發現，獲得的這株土壤細菌及其液體發酵產物處理大豆種子后可 專一使大豆產生對大豆敏感除草劑阿特拉津產生抗性。本發明的細菌菌株嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 是通過試管種培養后，再經擴大發酵培養來制備，其具體方法如下1.試管種培養培養基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母 浸膏lg，蔗糖10g，瓊脂20g，加水至IOOOmL02.液體發酵培養其中液體發酵培養基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2% -0. 4%、蛋白 胨_2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水，pH為7-8。將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養基中，25°C 28°C下，搖 床轉速以150r · mirT1 200r · mirT1、發酵45-50小時，優選48h。液體發酵的菌種可以通過大型發酵罐進行規模生產，其產品為發酵液或發酵液的 制成品。本發明涉及一種大豆種子處理劑，其包含有效量的本發明所述的嗜麥芽寡養單胞 菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42本身或其代謝物作為有效活性成分。本發明的目的在于提供一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的本申請 的細菌菌株嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42或其細菌代謝物 作為活性成分，用于誘導大豆產生對大豆敏感的除草劑阿特拉津的抗性。本發明的細菌菌株嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 或其代謝物具有誘導大豆產生對大豆敏感除草劑阿特拉津產生抗性的能力，可用于大豆種 子處理。
具體實施例方式為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發明，給出了下列實施例。實施例1 嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的獲得取大豆田的土壤lg，加入無菌水100ml，取200 μ 1，加入冷卻至35°C以下的滅菌的 20ml NA液體培養基，25°C下培養待菌落長出后，根據菌落色澤和邊緣狀態，挑取嗜麥芽寡 養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌落單獨保存，進行擴繁和生理生化測定，培 養性狀符合嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)特征的保存備用。實施例2 嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的培養首先對嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42菌株進行發 酵培養，然后對發酵培養后的代謝產物進行大豆誘導活性試驗，確定其對大豆的誘導作用。將嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42的菌體接種到試 管瓊脂培養基上，培養基配方為NA培養基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，酵母浸膏lg， 蔗糖10g，瓊脂20g，加水至lOOOmL。25°C培養10d，獲得試管種。再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養基中，培養基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 5%、蔗糖1%、余下為蒸餾 7jC, pH為8。在25°C下培養，搖床轉速以180r · mirT1、發酵48h，形成的發酵液或發酵液的 制成品可以直接或間接處理大豆種子。被處理的大豆種子可以種植在噴施莠去津除草劑的 土壤中，大豆出苗時可以抵抗阿特拉津(莠去津)的藥害。實施例 3 嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的發酵基本同實施例一，不同之處是將液體培養的菌種接種到1000L的發酵罐進行發 酵，在25°C下培養，pH為8，發酵48h。實施例4 嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 的發酵基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方，其配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0. 3%、蛋白胨1%、酵母浸膏0. 1%、蔗糖2%、余 下為蒸餾水，PH為7。實施例5 嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) Sneb 42 發酵產 品的使用將發酵液稀釋為108cfu/L，按1 50的比例處理包衣大豆種子，晾干后，將處理過 的大豆種子正常播種，按150g/667m2噴施阿特拉津(莠去津)，大豆可以正常出苗生長。
權利要求
處理大豆種子后具有誘導大豆產生抗阿特拉津抗性的細菌菌株，其特征在于該菌株為嗜麥芽寡養單胞菌Stenotrophomonas maltophilia Sneb 42，已于2010年2月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3620。
2.具有誘導大豆產生抗阿特拉津抗性的細菌代謝物，其特征在于，是由權利要求1所 述的細菌菌株經過液體發酵后形成的發酵液制備的，液體發酵培養基配方為以重量百分 比計，含有牛肉浸膏0.2%-0.4%、蛋白胨-2%、酵母浸膏0.5%、蔗糖1%-2%、 余下為蒸餾水，PH為7-8。
3.權利要求1所述的細菌菌株的液體發酵方法，其特征在于液體發酵培養基配方為 以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% _0.4%、蛋白胨1%-2%、酵母浸膏0. 1% -0.5%, 蔗糖-2%、余下為蒸餾水，pH為7-8，發酵溫度為25-28°C，搖床轉速150r · mirT1 200r · mirT1、發酵時間 45_50h。
4.根據權利要求3所述的液體發酵方法，其特征在于所述的發酵時間為48h.
5.具有誘導大豆產生抗阿特拉津抗性的細菌代謝物的制備方法，其特征在于是由權 利要求1所述的細菌菌株經過液體發酵后形成的發酵液制備的，液體發酵培養基配方為 以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% -0.4%、蛋白胨-2%、酵母浸膏0. -0.5%、 蔗糖_2%、余下為蒸餾水，pH為7-8，發酵溫度為25-28°C，搖床轉速150r · mirT1 200r · mirT1、發酵時間 45_50h。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的發酵時間為48h.
7.一種用于發酵權利要求1所述的細菌菌株的培養基，其特征在于發酵培養 基配方為以重量百分比計，含有牛肉浸膏0.2% _0.4%、蛋白胨1%_2%、酵母浸膏 0. 1% -0. 5%、蔗糖_2%、余下為蒸餾水。
8.權利要求7所述的培養基，其特征在于培養基的pH為7-8。
9.一種大豆種子處理劑，其特征在于，包含有效量的權利要求1所述的細菌菌株或權 利要求2所述的細菌代謝物作為活性成分，用于誘導大豆產生對大豆敏感的除草劑阿特拉 津的抗性。
10.權利要求1所述的細菌菌株或權利要求2所述的細菌代謝物在誘導大豆抗阿特拉 津除草劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株處理大豆種子后具誘導大豆產生對阿特拉津抗性的嗜麥芽寡養單胞菌Stenotrophomonas maltophilia Sneb 42及其制備方法和應用，屬于微生物農藥技術領域。本發明涉及的細菌菌株Sneb 42，已于2010年2月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3620。通過液體發酵培養制備，其代謝物處理大豆種子后，大豆種子萌發出苗時可以產生對阿特拉津的抗性。通過該細菌的代謝產物處理后的大豆可以與玉米等禾本科作物混種，采用統一阿特拉津除草劑除草，解決了玉米與大豆間套作的除草難題，具良好的應用開發前景。
文檔編號A01P21/00GK101818124SQ201010124089
公開日2010年9月1日 申請日期2010年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 羅在全, 陳立杰 申請人:沈陽農業大學