專利名稱：側柏內生真菌代謝產物的農用生物活性及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物農藥技術領域，特別是涉及側柏內生真菌代謝產物的農用生物活性及其應用。
背景技術：
豐白[Platycladus orientalis (L. ) Franco] M 白禾斗(Cupressaceae) 豐白 M (Platycladus Spach.)，是我國特有樹種，是城市尤其是北方城市綠化常用樹種之一。側柏葉氣清香、味苦澀、微辛，具有涼血止血、清肺止咳功效，種仁可入藥，能養心安神、止汗潤腸。側柏葉提取物對金葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度抑菌活性，其根際土壤提取物對蘿
卜等植物種子的萌發和幼苗生長有抑制作用。青島農業大學從2005年開始研究側柏的農藥活性，發現側柏各器官提取物對蘋果腐爛、葡萄白腐、葡萄黒痘等植物病原菌都有較強抑制作用，其中葉提取物的抑菌活性最好，并進一步從葉中分離到抑菌化合物8-甲基香豆素，相關研究已申請國家發明專利。然而眾所周知，植物資源是限制植物源農藥規模化生產和使用的主要因素之一。申請者根據宿主植物與其內生微生物長期協同進化，而具有相同或相似次生代謝產物生物合成途徑的 “內共生理論”，從側柏中分離篩選到對多種農業病蟲草害有顯著抑制作用的內生真菌，相關研究未見文獻報道。
發明內容
本發明的目的是從側柏中分離篩選出代謝產物有農藥活性的內生真菌，并將該菌發酵代謝產物應用于農業上以防治作物的病害、蟲害及草害。本發明的目的通過以下技術方案得以實現側柏內生真菌的分離篩選及其代謝產物在農業病蟲草害防治上的應用，具體包括以下步驟(1)側柏組織的準備采集健康側柏的根、莖、葉。(2)側柏組織的表面消毒與無菌檢測將步驟(1)側柏組織經表面消毒后，直接接種于PDA培養基表面，置于(27士 1) °C恒溫箱培養，從中選出表面無任何菌種生長的組織。(3)側柏組織內生真菌的分離培養將步驟O)的無菌組織在無菌條件下切割成小片移植于PDA培養基上，置于(27士 1)°C恒溫箱培養，至樣品周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落，經純化后轉接到PDA斜面培養基，備用。(4)內生真菌液體發酵培養基的配置每升含蛋白胨0-5. 5g、玉米粉l_8g、麩皮 0-10g、可溶性淀粉 0-10g、葡萄糖 l_8g、黃豆餅粉 l-9g、CaC03 0 . 5-2 . 5g, NH4NO3 0. 1-1. 2g、 MgSO4 0. 1-0. 9 g、KH2PO4 0. 1-0. 9g，其余為無菌水。(5)內生真菌發酵培養將步驟(4)液體發酵培養基分別裝在三角瓶中，用接種鉤挑取少許經步驟(3)分離純化的內生真菌菌絲于培養瓶中，置于(27 士 1)°C搖床，200r/ min，振蕩培養4-5天，發酵液經5000r/min離心，取發酵上清液。
(6)有效菌株篩選取步驟(5)各上清液與冷卻至50°C的PDA培養基按體積1 9 混合于無菌培養皿內，凝固后在每個培養基平板上放一個直徑為4mm的供試菌餅，置培養箱培養，計算各菌株發酵液對供試病原菌的抑制率，從中篩選出高效抑菌內生真菌菌株，備用。(7)側柏內生真菌代謝產物在防治植物病蟲草害中的應用將步驟(6)篩選出的高效菌株，采用步驟(4)液體發酵培養基在發酵罐中發酵培養，以其上清液或發酵混合物， 配以適量農用藥物輔料，制備成多種劑型的農用藥物。本發明(6)所述供試菌為蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、葡萄黑痘病菌 (Elsinoe ampelina)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)。
具體實施例方式下面結合實施例對本用途發明作進一步描述。實施例1 側柏內生真菌的典型分離培養從青島農業大學校園采集側柏莖葉等組織，自來水洗凈晾干，75%乙醇浸泡5min， 0. 升汞浸泡aiiin，進行表面消毒，最后用無菌水漂洗5次。用無菌濾紙吸干水分備用。 表面消毒后的莖組織，直接接種于PDA培養基表面，置于(27士 1) °C恒溫箱培養，從中選出表面無任何菌種生長的莖組織。在無菌狀態下，將上述無菌莖組織切成0. 2cmX0. 2cm的片段，接入新鮮的PDA培養基中，置于(27 士 1)°C的恒溫培養箱中培養。當樣品周圍明顯長出菌絲時，采用菌絲尖端挑取法，根據菌絲顏色，形態以及長出的先后順序，挑取菌絲轉接到新的PDA培養基上培養，反復純化直至獲得單一菌株，斜面保存編號備用。將上述分離得的側柏內生真菌各菌株進行液體發酵培養，培養基各組分與每升所含的質量為蛋白胨2. 5g、玉米粉3g、麩皮5g、可溶性淀粉4g、葡萄糖4g、黃豆餅粉4g、CaC03 lg、NH4NO3 0. 6g、MgSO4 0. g、KH2PO4 0. 6g ；將500mL液體發酵培養基分別裝在300mL三角瓶中，每瓶裝液量為50mL ；用接種鉤挑取少許菌絲接種于培養瓶中，置于(27 士 1) °C搖床，200r/min，振蕩培養5天，發酵液經 5000r/min離心lOmin，取發酵上清液。實施例2 側柏內生菌典型活性(殺菌)篩選取上述各菌株發酵上清液ImL于無菌培養皿內，與9mL冷去至50°C的PDA培養基迅速混勻，冷卻凝固后在每個培養基平板上放一個直徑為4mm的供試菌餅，置培養箱培養。以無菌水處理作為對照，重復三次。采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)X 100% /(對照菌落直徑-4)結果表明有21株至少對1種植物病原真菌有拮抗作用(占總分離株數的 19. )，編號為G21、J77、J86、TO1、TO7、Y127的內生真菌對蘋果腐爛病菌和葡萄黑痘病菌有較強的拮抗作用。實施例3 側柏內生菌典型制劑制備產品含2 %的J77菌種代謝產物，加入3 %的白炭黑作為吸附劑，并加入1 %的農乳0203-B和3%的木質素磺酸鈉輔料，最后用輕質碳酸鈣補足100%，混勻后，經氣流粉碎制成可濕性粉劑。
權利要求
1.側柏內生真菌代謝產物的農藥活性及其在防治作物上病、蟲、草害的應用
2.根據權利要求1所述的在防治作物上病、蟲、草害的應用，其特征在于將菌株發酵培養后，以其上清液或發酵混合物，配以農用藥物輔料，制備成多種劑型的農用藥物。
全文摘要
本發明(名稱為側柏內生真菌代謝產物的農用生物活性及其應用)涉及側柏內生真菌及其分離培養方法和其代謝產物對農業主要病蟲草害的抑制作用。該真菌分離自側柏，它對蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、葡萄黑痘病菌(Elsinoe ampelina)、棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)等多種農業植物病原菌具有較好的抑菌活性，同時對反枝莧、野燕麥等多種雜草及多種害蟲也有一定抑制作用。
文檔編號A01P3/00GK102204568SQ201010154980
公開日2011年10月5日 申請日期2010年3月31日 優先權日2010年3月31日
發明者王現坤, 郝雙紅, 魏艷 申請人:青島農業大學