專利名稱：一種分離武夷菌素抗菌活性物質的方法
技術領域：
本發明屬于生物農藥領域，具體而言涉及一種不吸水鏈霉菌武夷變種的高產菌株(Streptomyces anhygroscopicus var. wuyiensis) F64產生的次級代謝產物-武夷菌素,本 發明還涉及利用該菌株的發酵液分離不同抗菌活性物質的方法。
背景技術：
生物農藥是21世紀農藥產業發展的新方向，其中抗生素類殺菌劑是生物農藥 產業化發展最快的產品之一。武夷菌素是中國農業科學院研制的具有防病增產效果的 生物農藥產品，其來源于不吸水鏈霉菌武夷變種(Sti^ptomyces anhygroscopicus var. wuyiensis)產生的一種抗生素(微生物學報，24 :401_402，1984)，主要用于防治農作物真 菌病害，具有高效、廣譜、低毒、環境安全的特點，因此，在生態農業和綠色食品生產中具有 廣闊的應用前景。武夷菌素的生產是利用培養武夷菌素產生菌，通過生物深層發酵產生的 微生物的次生代謝產物。目前武夷菌素生產過程中的分離方法主要是采用高溫減壓濃縮器和分子膜。高溫 減壓濃縮器是在60-90°C的高溫下蒸發出水分，獲得武夷菌素有效成分的濃縮液，這種方法 容易破壞其中的有效成分，降低殺菌效果。采用分子膜分離武夷菌素有效成分只能去除糖、 無機鹽等小分子物質，不能分離到不同部位的有效成分。本發明提供的分離武夷菌素的方 法，操作簡單，工作量少，成本低廉；可以快速分離得到武夷菌素的不同極性部位，并確定不 同極性部位對不同病原菌引起的病害的抑菌效果。研究武夷菌素殺菌劑的高產、高效的生產方法，對于提高我國的農用抗生素自行 開發、創制的能力和水平，提高具有自主知識產權的新微生物農藥產業化程度，不僅直接為 農業生產提供新生物農藥品種，而且為開發微生物農藥產品提供基礎。
發明內容
本發明的目的在于提供一種分離武夷菌素抗菌活性物質的方法，從而為提高武夷 菌素的利用率、開發武夷菌素的新品種提技術基礎。發明人提供的分離武夷菌素抗菌活性物質的方法，關鍵的步驟為(1)制備武夷 菌素發酵液；(2)武夷菌素發酵液經過柱色譜分離，用不同濃度的溶劑如含水甲醇、乙醇等 以及不同濃度的鹽溶液進行梯度洗脫，得到不同極性的洗脫部位，減壓濃縮，干燥；(3)按 照不同細菌或真菌的培養條件進行培養。(4)管碟法或紙片法確定不同極性部位的抑菌活 性。本發明所述的抗菌活性包括對細菌和真菌有抑制作用。上述第二步中，分離用的柱色譜法，所用的填充劑為不同廠家生產的所有型號和 規格的樹脂，包括極性、弱極性和非極性大孔吸附樹脂、丙烯腈型和苯乙烯性大孔吸附樹 月旨，苯乙烯系和丙烯酸系離子交換樹脂、凝膠型和大孔型離子交換樹脂，葡聚糖凝膠樹脂、 聚酰胺樹脂等樹脂材料，例如AB-8大孔吸附樹脂、Dl 13離子交換樹脂、SephadexLH-20葡聚糖凝膠樹脂等。上述第二步中，所述的柱層析洗脫劑為含水低級醇，例如，甲醇或乙醇。上述第三步中，所述的細菌或真菌培養條件和培養方法均為常規的細菌或真菌培 養方法。 上述第四步中，其特征在于所述的抗菌活性包括對細菌和真菌有抗菌作用。本發明提供的一種分離武夷菌素抗菌活性物質的方法，操作簡單，工作量少，成本 低廉；樹脂材料可循環使用，節能環保；可以快速分離得到武夷菌素的不同極性部位，并確 定不同極性部位對不同病原菌引起的病害的抑菌效果，為開發和生產針對不同農作物病害 的武夷菌素的新品種提供技術基礎。
具體實施例方式實施例1 AB-8大孔吸附樹脂分離武夷菌素的抗菌活性物質
(1)制備武夷菌素發酵液；(2)武夷菌素發酵液經過AB-8大孔吸附樹脂，用不同比例的水-甲醇(1 0， 1 9,3 7,5 5,7 3,0 1)進行梯度洗脫，得到六個不同極性的洗脫部位，減壓濃
縮，干燥；(3)按照不同細菌或真菌的培養條件進行培養。(4)管碟法或紙片法測定六個不同極性部位的抑菌活性。將六個不同極性部位的濃縮液減壓干燥，用25%的甲醇水溶液溶解，連續稀 釋至2，1，0. 5，0. 25，0. 125,0. 0625 (mg/ml)六個不同濃度，測定抑菌活性，指示菌為 紅酵母(Rhodotorula rubra)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，巨大芽孢桿菌 (Bacillusmegaterium)禾口大腸桿菌(Escherichia coli).觀察實驗結果結果顯示六個不同極性部位均有抑菌活性，第一個部位(水洗部 位)對所有指示菌有很強的抑菌效，第四個部位對紅酵母的抑菌效果好，第六個部位對枯 草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和大腸桿菌有很好的抑制作用。實施例2 Diaion HP-20大孔吸附樹脂分離武夷菌素的抗菌活性物質(1)制備武夷菌素發酵液；(2)武夷菌素發酵液經過Diaion HP-20大孔吸附樹脂，用不同比例的水-甲醇 (1 0,1 9,3 7,5 5,7 3,0 1)進行梯度洗脫，得到六個不同極性的洗脫部位， 減壓濃縮；(3)按照不同細菌或真菌的培養條件進行培養。(4)管碟法或紙片法測定六個不同極性部位的抑菌活性。將六個不同極性部位的濃縮液減壓干燥，用25 %的甲醇水溶液溶解，連續稀釋 至2,1,0.5,0. 25,0. 125,0. 0625 (mg/ml)六個不同濃度，測定抑菌活性，指示菌為紅酵母 (Rhodotorula rubra)，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)，巨大芽抱桿菌(Bacillusmega terium)禾口大腸桿菌(Escherichia coli).觀察實驗結果結果顯示六個不同極性部位均有抑菌活性，第一個部位(水洗部 位)對所有指示菌有很強的抑菌效果，第四個部位對紅酵母的抑菌效果好，第六個部位對 枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和大腸桿菌有很好的抑制作用。
實施例3 Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離武夷菌素的抗菌活性物質(1)制備武夷菌素發酵液；(2)武夷菌素發酵液經過S印hadex LH-20大孔吸附樹脂，用不同比例的水-甲醇(1 0,1 9,3 7,5 5,7 3,0 1)進行梯度洗脫，得到六個不同極性的洗脫部位， 減壓濃縮；(3)按照不同細菌或真菌的培養條件進行培養。(4)管碟法或紙片法測定六個不同極性部位的抑菌活性。將六個不同極性部位的濃縮液減壓干燥，用25 %的甲醇水溶液溶解，連續稀釋 至2,1,0.5,0. 25,0. 125,0. 0625 (mg/ml)六個不同濃度，測定抑菌活性，指示菌為紅酵母 (Rhodotorula rubra)，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)，巨大芽抱桿菌(Bacillusmega terium)禾口大腸桿菌(Escherichia coli)。觀察實驗結果結果顯示六個不同極性部位均有抑菌活性，第一個部位(水洗部 位)對所有指示菌有很強的抑菌效果，第四個部位對紅酵母的抑菌效果好，第六個部位對 枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和大腸桿菌有很好的抑制作用。
權利要求
一種分離武夷菌素抗菌活性物質的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)制備武夷菌素發酵液；(2)武夷菌素發酵液經過柱色譜分離，用不同濃度的溶劑以及不同濃度的鹽溶液進行梯度洗脫，得到不同極性的洗脫部位，減壓濃縮，干燥；(3)按照不同細菌或真菌的培養條件進行培養；(4)管碟法或紙片法確定不同極性部位的抑菌活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，分離用的柱色譜法所用的填充劑為極性、 弱極性和非極性大孔吸附樹脂、丙烯腈型和苯乙烯性大孔吸附樹脂、苯乙烯系和丙烯酸系 離子交換樹脂、凝膠型和大孔型離子交換樹脂、葡聚糖凝膠樹脂、聚酰胺樹脂。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述填充劑是AB-8大孔吸附樹脂、D113離子交換 樹脂或S印hadex LH-20葡聚糖凝膠樹脂。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于分離所用的洗脫劑為含水甲醇或乙醇。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述的細菌或真菌的培養 條件為常規的細菌或真菌培養方法。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的抑菌活性包括對細菌和真菌有抗菌 作用。
全文摘要
本發明提供了一種分離武夷菌素抗菌活性物質的方法，本方法操作簡單，工作量少，成本低廉；樹脂材料可循環使用，節能環保；可以快速分離得到武夷菌素的不同極性部位，并確定不同極性部位對不同病原菌引起的病害的抑菌效果，為開發和生產針對不同農作物病害的武夷菌素的新品種提供技術基礎。
文檔編號A01P3/00GK101818172SQ20101015681
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者孫蕾, 崔增杰, 張克誠, 折改梅, 林寅妮 申請人:中國農業科學院植物保護研究所