番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因和應用的制作方法

專利名稱：番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
有研究表明在C3植物中存在一個C4代謝的微循環，這也合理地解釋了 C4代謝的 多源進化過程，也預示著利用轉基因改良(3植物是有價值的，利用C4代謝關鍵酶基因轉化 C3植物不僅能改善其光合特性，而且能提高其抵抗生物脅迫和非生物脅迫的能力。在C3植 物中過表達或者導入外源C4代謝關鍵酶基因是提高光合效率的有效途徑。在水稻上，PEPC 酶活性可以作為水稻高光效育種的指標。ppc基因是編碼PEPC (磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的基因，PEPC是植物細胞代謝 中的一種重要羧化酶，在C4和CAM植物中，它能富集C02，從而提高光合效率，該酶介導不可 逆的β羧化反應，將磷酸烯醇式丙酮酸轉化成草酰乙酸和磷酸。而在C3植物中，該酶具有 為Krebs循環補充四碳二羧酸水平的回補反應功能。C4途徑的PEPC對CO2有很強的親和 能力，可將大氣中低濃度CO2固定下來，并運輸到維管束鞘細胞的葉綠體中供C3途徑利用， 因此C4途徑固定CO2能力比C3途徑強，起到CO2泵的作用，提高了 C4植物利用CO2的能力。轉C4代謝關鍵酶基因改良C3植物最熱門的研究是在水稻上，ku等1999年報道了 獲得轉玉米PPC基因水稻的PEPC活性高達原種的44-81倍，是玉米PEPC活性的2_3倍，光 抑制作用也下降了 20 %，種子產量比原種提高10 %-12%,轉玉米C4型ppdk基因水稻產量 增加35%，這些均展示了通過增強水稻的C4光合特性增加光合效率以提高水稻產量的端 倪。Jiao等(2001)研究了轉玉米C4光合多個酶PEPC、PPDK, NADP-ME基因水稻不僅外源 C4光合基因在水稻中正確而且高效的表達，轉NADP-ME、ppdk基因水稻的ME、PPDK活性比原 種高5倍，分別達到玉米的50%和70% ；在高溫(35°C )下，轉PEPC基因水稻的凈光合速 率比原種高20.2%，羧化效率提高57%，C02補償點降低32%。在高光強下，與原種相比轉 PEPC基因水稻中Rubissco羧化酶活性變化不明顯，但碳酸酐酶(CA)誘導活性增加I. 8倍， 顯示光合特性的顯著改善(Jiao et al.，2002)。另外，陳緒清等(2004)發現轉玉米C4型 PEPC基因的小麥植株部分轉基因植株光合速率有所提高，氣孔對水蒸氣的導度以及蒸騰速 率也顯著提高，推測C4光合基因的高效表達可引起氣孔保衛細胞中蘋果酸濃度的升高，促 進氣孔開放。過表達ppc基因的煙草和馬鈴薯均能提高PEPC酶的活性，轉玉米PEPC基因水稻 的葉內具有初級的CO2濃縮機制，為轉基因的高光效育種技術提供了生理依據。轉PEPC基 因水稻中午Fv/Fm、qP和PS II降低較少，qN略為增加，光能轉化為化學能的效率較高，熱 耗散較低，表現耐光抑制。這些材料的PEPC活性和凈光合速率(Pn)提高，CO2補償點降低， 且Pn和PEPC活性呈正相關。玉米C4型ρ印c基因的高表達反過來也增強C3植物內源逆境 相關因子或基因的增強子等交叉因子誘導，從而誘導SOD和POD等抗氧化酶活性的提高，表 現耐光氧化能力增強。番茄生產中常出現35°C以上的亞高溫現象和設施生產中常面臨CO2濃度不足的問
3題。由于番茄是C3植物，對于高溫和低CO2濃度的適應性較差，導致落花落果，大大的影響 了番茄的產量和質量。針對這種情況，目前主要是通過人工通風、遮光、噴水和化控技術來 避免高溫傷害和增施CO2肥料來解決的，但不能從根本上改變番茄不適應高溫和低CO2濃度 的問題，所以培育適應能力強的優良品種是關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白(PEPC蛋白)，是一種番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，來源于番 爺 micro-tom (Solanum lycopersicum L·)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由序列1衍生的蛋白質。為了便于PEPC蛋白的純化，可在由序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質的氨基 端或羧基端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列 上述(b)中的PEPC蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得 到。上述(b)中的PEPC蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2或3所示的DNA序列中 缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在 其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼上述蛋白的基因(ppc基因)也屬于本發明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且具有磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶活性的蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有磷酸烯醇
4式丙酮酸羧化酶活性的蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件 下雜交并洗膜。含有以上任一所述基因的重組載體也屬于本發明的保護范圍，如重組表達載體。可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與 mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因、植物基因3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功 能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強型啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結 合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子 或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需 與 編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子 的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或 結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組表達載體可為將所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒。 所述重組表達載體具體可為將序列表的序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分 子插入PBI121的Xba I和BamH I酶切識別位點之間得到的重組質粒。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的 保護范圍。含有以上任一所述基因(ppc基因)的表達盒、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發 明的保護范圍。擴增上述基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，是將以上任一所述基因導入目的植物 中，得到如下(I)和/或(II)和/或(III)的轉基因植物(I)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶含量高于所述目的植物的轉基因植物；(II)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活性高于所述目的植物的轉基因植物；(III)光合效率高于所述目的植物的轉基因植物。所述的基因具體可通過所述重組載體導入所述目的植物中。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，均可將編碼所述蛋白的基 因導入植物，獲得轉基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、 植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細 胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。所述雙子葉植物優選為番茄，最優選番茄micro-tom。所述光合效率可體現為凈光合速率。所述基因可用于改良番茄種質。所述基因可用于番茄育種。依據C4代謝關鍵酶基因改良(3植物在水稻上已取得的成就，本發明主要探討過表 達番茄PPC基因對番茄PEPC活性的影響，預期為提高PEPC活性，增加量子效率、Fv/Fm、qP 和非光化學淬滅(qN)，降低CO2補償點，增加番茄抗氧化酶活性和抗氧化物質含量，使番茄 具備耐高溫和光抑制特性，從而提高光合效率，增加其光合能力。本發明立足于提高番茄適 應非生物脅迫的能力，結合基因工程輔助育種研究，過表達番茄的C4代謝關鍵基因ppc，提 高番茄對非生物脅迫的適應能力和提高番茄的光合效率，為創新番茄種質改良方法，加快 番茄選擇育種進程提供科學依據。本發明將為番茄等園藝作物高光效轉基因育種提供重要 的技術與理論支撐。


圖1為過表達番茄ppc基因的轉基因植株分子鑒定。圖2為過表達番茄ppc基因的轉基因植株PEPC酶活性鑒定。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為 自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。 以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。限制性內切酶(Xba I和 BamH I)購自MBI fermentas公司。其它試劑均為分析純。番茄mi cro-tom 中國農業大學保證向公眾提供；參考文獻劉小花，張嵐 7^； jk 胄，,昆 公， 余昌 $ ；Mechanisms for miniature dwarf characteristics
ofMicro-Tom tomato and its application in plant functional genomicsstudies ； HEREDITAS(Beijing)2008，10,30(10) 1257-1264 ；ISSN 0253_9772www.chinagene.cn.； 很多園藝公司均有出售，如南京豐碩園藝有限公司。實施例1、番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)及其編碼基因(ppc)的發現一、RNA提取和反轉錄將番茄micro-tom種子用水浸泡30min，經無菌水沖洗一遍后，用75% (體積百分 含量)酒精浸泡30s，用次氯酸鈉消毒lOmin，再用無菌水連續沖洗5次后接種到基本培 養基(MS培養基+3%蔗糖+0. 25% Gerite)上，待無菌苗有3_4片真葉時，取葉片用博邁德 公司EASY spin RNA提取試劑盒提取總RNA，用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄，獲得cDNA。二、設計引物根據NCBI已有的番茄ppc基因cDNA序列AJ243416. 1 (LYCes ；Ppc)，使用 primer5. 0軟件設計兩對引物。第一對引物為Iyppcls和lyppclas。第二對引物為lyppc2s 禾口 lyppc2as。Iyppcls 5 ‘ - T A G G G A T T G A T G A A C G A G - 3 ‘ ； lyppclas:5 ‘ -TTCCATATTCCAGGTGAC-3‘；1 ypp C 2 s 5 ‘ -GTTGAGTGAGAAATGAC-3 ‘ ； lyppc2as 5 ‘ -AATAGTACAAGTTAGCTG-3‘。三、PCR擴增將步驟一的cDNA作為模板，利用步驟二設計的引物進行PCR擴增。反應體系為 25 μ 1。第一對引物反應條件95°C 預變性 5min ；94 °C, Imin ； 52 °C, 30s ； 72 °C Imin ；35 個 循環；72°C延伸lOmin。第二對引物反應條件95°C預變性5min ；94°C, Imin ；52°C, 30s ； 72°C 2min ；35 個循環；72°C延伸 IOmin0第一對引物PCR擴增獲得micro-tom的ppc基因前796個核苷酸，根據第二對引物 PCR擴增獲得micro-tom的ppc基因后2209個核苷酸；分別連接pMD_18T載體，轉化大腸 桿菌感受態DH5 α，涂加有Amp (氨芐青霉素)的LB固體培養基平板篩選陽性克隆，并通過 測序對PCR產物進行鑒定，經過測序比對；把得到的兩段序列拼接，獲得全長cDNA，由2895 個核苷酸組成。序列2所示的DNA由2895個核苷酸組成，編碼序列1所示的蛋白質。將序列1所 示的蛋白質命名為PEPC蛋白，由964個氨基酸殘基組成。將PEPC蛋白的編碼基因命名為 ppc基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示，含有起始密碼子前部分核苷酸的ppc基因 如序列表的序列3所示。實施例2、過表達番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因載體構建和遺傳轉化一、基因的克隆1、特異引物對的設計根據序列3所示的ppc基因設計如下特異引物對上游引物CTAGTCTAGAGTTGAGTGAGAAATGAC；引入 Xba I 酶切識別位點；下游引物CGGGATCCGGATTAGCTTAACCAGTA；引入 BamH I 酶切識別位點。2、基因的克隆提取番茄micro-tom的RNA，反轉錄為cDNA ；以cDNA為模板，用步驟1設計的特異 引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物(ppc基因)。二、重組質粒(ppc基因過表達載體)的構建1、把PCR擴增產物(ppc基因)連接到pMD-18T載體(TAKARA公司)上，得到重組 質粒 pMD-18T-ppc。2、用限制性內切酶Xba I和BamH I雙酶切重組質粒pMD-18T-ppc，進行瓊脂 糖凝膠電泳，用藍罡生物科技公司的凝膠回收試劑盒切膠回收小片段(PPC基因)。3、用限制性內切酶Xba I和BamH I雙酶切pBI121質粒(購于北京拜爾迪生物技 術有限公司；含有35s啟動子的原始表達載體)，回收質粒骨架。4、將步驟2回收的小片段和步驟3回收的質粒骨架連接(連接酶是TAKARA的 T4連接酶)，連接產物進行測序，測序結果表明，得到了 ppc基因過表達載體pBI-ppc (在 PBI121質粒的Xba I和BamH I酶切識別位點之間插入了序列表的序列3自5’末端第 5-2911位核苷酸所示的DNA)。三、重組農桿菌的獲得 用pBI-ppc轉化大腸桿菌DH5 α (購于天根生化科技有限公司)，涂板篩選培養基
7(含100mg/L卡那霉素的LB固體培養基)篩選陽性克隆；用LB液體培養基擴增重組菌，提 取質粒；然后侵染根癌農桿菌菌株EHA105(Invitron公司)感受態。獲得重組農桿菌(含 有pBI-ppc的農桿菌)。四、過表達番茄ppc基因的轉基因番茄植株的獲得1、培養無菌苗將番茄micro-tom種子用水浸泡30min，經無菌水沖洗一遍后，用75% (體積百分 含量)酒精水溶液浸泡30s，用次氯酸鈉消毒lOmin，再用無菌水連續沖洗5次后接種到 基本培養基(MS培養基+3%蔗糖+0. 25% Gerite)上，待無菌苗子葉伸展至0. 5-lcm時將 子葉用剪刀橫向剪開，一分為二。2、預培養見步驟1處理得到的無菌苗在預培養培養基(MS培養基+2. 0mg/L玉米素+0. 5mg/ L吲哚-3-乙酸)上暗培養24-48h。3、侵染用步驟三制備的重組農桿菌的菌液(0D值0.3-0. 6)侵染預培養后的植株子葉 5min。4、共培養在共培養培養基(MS培養基+2. 0mg/L玉米素+0. 5mg/L吲哚-3-乙酸+100 μ M乙 酰丁香酮)上暗培養24-48h ；5、恢復培養在恢復培養基(MS培養基+2. 0mg/L玉米素+0. 5mg/L吲哚-3-乙酸+500mg/L羧 芐青霉素)上培養7天左右；6、篩選和生根在篩選培養基(MS培養基+2. 0mg/L玉米素+0. 5mg/L吲哚-3-乙酸+500mg/L羧 芐青霉素+100mg/L卡那霉素)上進行培養；待植株長到3-5cm高時，轉入生根培養基(基 本培養基+0. 05mg/L萘乙酸+500mg/L羧芐青霉素)進行生根培養，得到候選的過表達植株 (T0 代)。7、分子鑒定用天根公司的DNA提取試劑盒提取候選的過表達植株和番茄micr0-t0m(番茄 micro-tom作為陰性對照)的RNA，反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行半定量PCR鑒定， 內參基因為Ubiquitin，ppc基因所用的引物對為ppc s和ppc as，Ubiquitin基因所用的 引物對為ubi s和ubi as。ppc s 5' -GTCGGACCGCCATACT-3‘；ppc as 5' -CTAACTCGGCATTCAC-3‘。ubi s 5' -CAGATCTTCGTCAAAACCCT-3‘；ubi as 5' -GACTCCTTCTGGATGTTGTA-3‘。結果見圖1。圖1中，M =Marker ；1 候選的過表達植株；CK 陰性對照。結果表明 Ubiquitin基因的表達量，候選的過表達植株和陰性對照中是一致的；ppc基因的表達量， 候選的過表達植株明顯高于陰性對照；所以候選的過表達植株確實為過表達植株。共得到 24株過表達植株。
五、轉空載體對照植物的獲得用pBI121代替pBI-ppc，制備轉空載體對照植株，方法同步驟三和步驟四。六、過表達番茄ppc基因的轉基因植株鑒定測量相同條件下培養均處于幼苗期的野生型植株(10株)、轉空載體對照植物(隨 機選取10株)和過表達植株(從24株中隨機選取10株)中C4代謝光合關鍵酶PEPC酶 活性和凈光合速率，鑒定過表達PPC基因的效果。1、PEPC 酶活性PEPC酶活性鑒定方法如下(1)取番茄葉片0.5g(鮮重；FW)，加Iml提取液(由水和溶質組成溶質含量 50mmol/L Tris-HCl.pH 7. 5, lmmol/L EDTA，lmmol/L MgCl2, 5mmol/L DTT，每 IOOmL 提取液 含有2g不溶性PVP)研磨，濾液于13000g離心lOmin，取上清液(提取液)測酶活性。(2)緩沖液含 50mmol/L HEPES_KOH(pH 8. 0)，10mmol/L NaHCO3, 5mmol/L MgCl2,
0.2mmol/L NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)，1. 5 unit MDH(蘋果酸脫氫酶)。(3)PEPC酶活性測定取0. Iml提取液，加入0. 8ml緩沖液中，混勻，室溫靜止 3min ；加入0. Iml 2mmol/L PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)水溶液，啟動反應，開始計時；記錄 340nm光密度在每分鐘的變化(測試溫度為30°C )，連續測定5min，每分鐘的變化的絕對值 依次為 Δ χ 、Δχ2、Δχ3、Δχ4 和 Δχ5。 6. 22為NADH的摩爾吸光系數，0. 5為樣品鮮重(g),0. 1為加樣體積(ml), 60為每 小時60分鐘。結果取10株的平均值，見圖2。野生型植株的PEPC酶活性為
1.96 μ mol · g^Fff · tT1，過表達植株的PEPC酶活性為5. 49 μ mol · g^Fff · IT1。轉基因植株 的PEPC酶活性比非轉化株均高2. 8倍；轉空載體對照植株與野生型植株的PEPC酶活性沒 有顯著差異。2、凈光合速率使用LI-6400便攜式光合測定儀測定凈光合速率(環境溫度32°C )。10株野生型植株的平均值為16. 2 CO2Umol · m_2 · s—1 ；過表達植株的平均值為 16. 78 CO2 μ mol · m_2 · s—1 ；過表達植株比野生型植株的凈光合速率高3. 6%，其中1株植株 的凈光合速率比野生型植株的平均值高9. 4% ；轉空載體對照植株與野生型植株的凈光合 速率沒有顯著差異。
權利要求
一種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所示的基因，其特征在于所述基因為如下1)或2)或3)或4)或5) 的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶活性的蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有磷酸烯醇式丙 酮酸羧化酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將權利要求 2或3所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒，優選為將序列表的序列3自5’ 末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子插入pBI121的Xba I和BamH I酶切位點之間得 到的重組質粒。
6.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述基因導入目的植物中，得到如 下(I)和/或(II)和/或(III)的轉基因植物(I)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶含量高于所述目的植物的轉基因植物；(II)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活性高于所述目的植物的轉基因植物；(III)光合效率高于所述目的植物的轉基因植物。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述基因通過權利要求4或 5所述重組表達載體導入所述目的植物中。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉 植物；所述雙子葉植物優選為番茄。
9.如權利要求6或7或8所述的方法，其特征在于所述光合效率體現為凈光合速率。
10.權利要求2或3所述基因在改良番茄種質或番茄育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其編碼基因和應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由序列1衍生的蛋白質。本發明立足于提高番茄適應非生物脅迫的能力，結合基因工程輔助育種研究，過表達番茄的C4代謝關鍵基因ppc，提高番茄對非生物脅迫的適應能力和提高番茄的光合效率，為創新番茄種質改良方法，加快番茄選擇育種進程提供科學依據。本發明將為番茄等園藝作物高光效轉基因育種提供重要的技術與理論支撐。
文檔編號A01H5/00GK101892212SQ20101019890
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者劉莉莎, 楊鵬, 溫常龍, 王玉玨, 程琳, 趙永欽, 趙立群, 郭仰東 申請人:中國農業大學