專利名稱：昆蟲病原真菌轉酸性海藻糖酶基因菌株及制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因菌株及其制備方法和用途，尤其涉及昆蟲病原真菌轉基因菌株 及其制備方法和用途。
背景技術：
害蟲防治是農業生產的重要組成部分。化學農藥在防治有害生物和保障農業增產 方面起了積極作用。但化學農藥大量長期使用引起了一系列的環境和食品安全問題。由于 微生物生物防治具有安全和可持續控制的優點，一直受到人們的廣泛關注。其中，昆蟲病原 真菌是昆蟲病原微生物中最大的一個類群，自然死亡昆蟲的60%由其引起，是自然界控制 昆蟲種群數量的重要因素之一。昆蟲病原真菌主要通過體壁侵染昆蟲，在害蟲持續控制及 維護物種多樣性方面具有特殊優勢。目前真菌殺蟲劑已作為化學農藥的替代產品或補充制 劑防治多種有害昆蟲。然而，與其他微生物農藥一樣，真菌農藥存在殺蟲較慢、防效不穩定 等缺點，這極大限制了其廣泛應用。提高昆蟲病原真菌殺蟲速度對擴大其應用范圍、減少化 學農藥使用、保護生態環境具有重要意義。提高昆蟲病原真菌殺蟲劑殺蟲速度措施主要有(1)通過制劑研究為真菌提供適 宜的微環境，促進真菌快速生長與侵染；(2)通過菌株篩選獲得高殺蟲活性的菌株；(3)通 過菌株改良獲得高殺蟲活性的菌株。殺蟲真菌制劑研究成果對促進殺蟲真菌產業化與應用 起到推動作用，特別是殺蟲真菌油懸浮劑的出現，顯著降低殺蟲真菌環境濕度依耐性，使得 殺蟲真菌應用范圍從森林等蔭蔽區域擴大到干旱、高溫區域。但是，由于昆蟲病原真菌侵染 昆蟲是兩者相互作用的過程，即便在適宜的環境條件下，真菌侵染昆蟲直至昆蟲死亡，仍需 要較長的時間。通過菌株篩選已獲得針對多種不同昆蟲的一系列具有高殺蟲活性的昆蟲病 原真菌菌株，其中國內外登記注冊的真菌農藥已有100多種，由于自然菌株是經過長期與 寄主昆蟲相互作用進化形成，與寄主昆蟲在自然界中達到平衡，所以從大量菌株篩選具有 高殺蟲活性的昆蟲病原真菌菌株費時、費事。目前，在昆蟲病原真菌致病機制研究的基礎上 利用基因工程手段改良菌株成為提高昆蟲病原真菌殺蟲活性的重要途徑。昆蟲病原真菌侵染寄主昆蟲主要有3個過程①分生孢子附著在寄主表皮；②穿 透昆蟲表皮入侵到昆蟲體內；③在昆蟲體內利用昆蟲營養生長繁殖并分泌毒素直至昆蟲得 病死亡。迄今為止，對昆蟲病原真菌致病機制的研究成果主要集中在真菌穿透寄主表皮過 程中產生的一些水解酶類，并分離鑒定多個與致病相關的基因，如蛋白酶Prl、幾丁質酶等。 St Leger(1996)通過轉基因技術成功的將Prl基因轉入綠僵菌(Metarhizium)，獲得高毒 力的綠僵菌工程菌株。該工程菌株在煙草天蛾的血淋巴中組成性超表達后激活酚氧化酶系 統，引起幼蟲黑化，導致昆蟲死亡時間縮短25%，取食量下降40%。2005年Fang等人成功 將昆蟲病原真菌毒力因子-幾丁質水解酶Bbchitl基因構建在gpd組成性啟動子下游轉入 白僵菌基因組中，獲得超表達工程菌株。工程菌株對蚜蟲的毒力明顯增強與野生菌株相 比，工程菌株對蚜蟲的致死劑量降低50%，致死時間縮短50%。Fang等人(2007)將家蠶的 BmChBD融合到Bbchitl中獲得的雜交幾丁水解酶，這個雜交幾丁水解酶(Bbchitl-BmChBD)的基因與組成性啟動子gpd (三磷酸甘油醛脫氫酶)連接后被成功轉化到白僵菌中，提高真 菌的表皮穿透能力，與野生菌株相比，工程菌株使昆蟲死亡時間縮短23%。然而，由于研究難度較大，目前對病原真菌進入昆蟲血腔后到寄主死亡前的時期 (侵入后)研究較少，而這一時期又恰是病原真菌與寄主之間生死斗爭的關鍵時期，占了 真菌侵染致病過程中絕大部分時間，縮短病原真菌昆蟲體內侵染時間能有效提高昆蟲病原 真菌殺蟲活性。Wang and St. Leger (2007)通過基因工程的方法將一種昆蟲特異性神經毒 素(來源于黃肥尾蝎)基因AajIT轉入綠僵菌，使其侵染寄主昆蟲后在昆蟲血淋巴中特異 表達；當死亡率相同時，該工程菌株防治煙草天蛾的劑量比野生型菌株降低22倍，縮短防 治埃及伊蚊時間40%以上；該工程菌株防治咖啡豆蛀蟲的劑量較野生型菌株降低15. 7倍 (Pava-Ripoll等，2008)。Thomas and Read (2007)認為由于社會心理和政治的因素，該方 法被廣泛應用還需一個較長時間。采用安全、易被人們接受的基因工程菌縮短病原真菌昆 蟲體內侵染時間成為研究熱點。我們通過研究發現，在昆蟲中海藻糖作為血液內的一種主要糖分以提供昆蟲活 動，昆蟲體內海藻糖濃度影響昆蟲的活動與行為，而昆蟲病原真菌能分泌一種海藻糖降解 酶利用昆蟲體內的海藻糖供其生長，則海藻糖降解酶是一種昆蟲病原真菌可能的致病因 子。我們進一步研究發現該海藻糖降解酶為一種酸性酶，昆蟲病原真菌侵染昆蟲后，昆蟲體 內酸性海藻糖活性上升，而昆蟲體內海藻糖濃度相應下降，這進一步表明昆蟲病原真菌酸 性海藻糖降解酶(ATM)是一種可能的致病因子，通過基因工程的手段，構建真菌ATM超表達 載體，轉化綠僵菌、白僵菌，獲得ATM超量表達的工程菌，將是一種易被人們接受的提高昆 蟲病原真菌殺蟲活性的新方法。
發明內容
本發明的目的在于提供昆蟲病原真菌轉基因菌株，本發明轉基因菌株能超量表達 同源或異源酸性海藻糖酶。本發明的另一目的在于提供上述昆蟲病原真菌轉基因菌株的制備方法，本發明方 法再現性好。本發明的又一目的在于提供上述昆蟲病原真菌轉基因菌株的用途。本發明的目的是這樣實現的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述轉基因菌株含有同源或異源酸性海 藻糖酶組成性外源基因。為了進一步提高轉基因菌株酸性海藻糖酶表達的水平，上述酸性海藻糖酶組成性 外源基因為 pBarEx-ATM 或 pBGFP-ATM。上述病原真菌為白僵菌或綠僵菌，還可以是擬青霉或輪枝菌等昆蟲病原真菌。上述昆蟲病原真菌轉基因菌株，是通過構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性 表達載體，然后建立液生分生孢子轉化體系，再進行選擇性地篩選得到的。上述構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體中的酸性海藻糖酶基因來 自含有酸性海藻糖酶基因的絲狀真菌或酵母菌；所述絲狀真菌可以是綠僵菌或白僵菌或擬 青霉或輪枝菌或曲霉或小孢子菌等含有酸性海藻糖酶基因的真菌，所述酵母菌可以是畢赤 酵母或釀酒酵母或假絲酵母等含有酸性海藻糖酶基因的酵母菌，優選為綠僵菌CQMal02。
具體地說，上述昆蟲病原真菌轉基因菌株是通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全長cDNA 核酸序列，并將其克隆到以除草劑抗性基因(Bar基因)為篩選標記的真菌表達載體pBarEx 或以苯萊特(Benomyl)抗性基因(3 -微管蛋白基因，3-Tubulin)為篩選標記的真菌表達 載體pBGFP，使ATM基因處于來自構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因的啟動子或磷 酸丙糖異構酶(tpiA)基因的啟動子與色氨酸合成酶(trpC)基因的終止子控制之下，得到 海藻糖酶基因組成性表達載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；建立利用基因槍法轉化綠僵菌或 白僵菌液生分生孢子的體系，將pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到綠僵菌、白僵菌基因組、擬 青霉或輪枝菌中；最后經過抗性篩選和聚合酶鏈式(PCR)反應法篩選得到。上述昆蟲病原真菌轉基因菌株的制備方法1、構建酸性海藻糖酶(ATM)基因組成性表達載體首先根據pBGFP構建絲狀真菌表達載體pBarEx 設計引物1 (5’ -attagacgtcgcag gtcgacagaagaatgac-3，，下劃線為 Aat II 酶切位點)與弓丨物 2 (5，-gtcggccgggcgtcgttctg ggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’ )從構巢曲霉基因組DNA中擴增色氨酸合成酶啟動 子(PtryC)序列；設計弓丨物 3 (5，_gcggccgctctagtggatctacc^gagcccagaacgacgcccggccga c-3’，與引物2反向互補系列；其中為Bar基因起始密碼子)與引物4 (5，-CgCggatCCa gcttttattagatctcggtgac-3’，下劃線為 BamHI 酶切位點)從 pCAMBIA 3300 中擴增 Bar 基 因序列；以引物1與引物4，采用融合PCR擴增PtryC控制下的Bar Cassette ；將pBGFP與 Bar Cassette分別采用AatII與BamHI雙酶切后，用T4連接酶連接構建成絲狀真菌表達載 體 pBarEx ；其次，根據綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全長cDNA核酸序列(GenBank登錄 號EF190950)設計的引物 5(5，-cc^g^atgcgcgcgactcccatg-3，，下劃線為 Clal 酶切位 點)與引物6 (5，-tcccccRRRctaaaacRctctaccctt-3，，下劃線為Smal酶切位點)，以綠僵菌 CQMal02cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出兩端分別帶有Clal與Smal酶切位 點的3303bp的ATM基因全長cDNA序列，并將其克隆到絲狀真菌表達載體pBarEx或pBGFP 的Clal和Smal位點之間，使ATM基因處于來自構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基 因的啟動子與色氨酸(trpC)基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組成性表達載體 pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表達載體用CaCl2法轉入大腸桿菌中 并進行擴增，載體大量提取的產物經Spel線性化后去磷酸，再經酚-氯仿抽提得到上述線 性化組成性表達載體；2、建立利用基因槍法轉化昆蟲病原真菌液生分生孢子的體系將1ml濃度為107個/ml的綠僵菌CQMal02或白僵菌CQBb022成熟分生孢子水懸 浮液接種于裝有100ml 1/4強度薩氏液體培養基(1/4SDA) (10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋白胨， 5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6.5)的250ml三角瓶中，28°C，250rpm振蕩培養3天，四層滅菌 紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無菌水重懸清洗2次，最后20 %無菌甘 油重懸使孢子濃度達108個/ml，分裝后-80°C保存；3、轉化與篩選轉化時取出50 ill上述液生分生孢子懸浮液與滅菌平皿中央，使其直徑達到 lcm，然后放入75%乙醇消毒的基因槍室內用于轉化；按照Bio-Rad系統提供的方法進行金粉的處理和線性載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用該系統進行微粒子 轟擊；轟擊后在超凈臺上取出孢子液，用5ml無菌水稀釋，取lOOul涂布于除草劑草丁膦 (Phosphinothricin, PPT)或苯萊特(Benomyl)篩選培養基平板上，28 °C培養；綠僵菌采 用80ug/ml PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，白僵菌篩選采用10ug/ml PPT或5ug/ ml苯萊特的查氏平板篩選，10天后挑取正常生長單菌落，在相應篩選培養基與1/4SDA 平板上交替傳代5次后提取DNA，利用特異引物對(5’ -gactgcccgc attgagaag-3'與 5 ’ -agatggaggagttggtgttg-3 ’)，經PCR驗證轉基因菌株Bar基因，或利用特異引物對 (5，-gcttactcctccttgacaccac-3，與 5，-agccgagtatggtaaccaaggg-3‘)，驗證轉基因菌株 3-Tubulin基因，得到穩定轉基因菌株。上述昆蟲病原真菌轉基因菌株在制備真菌農藥中的應用。有益效果本發明昆蟲病原真菌轉基因菌株表達海藻糖酶的效率高；本發明制備方法易操 作、重復再現性好；本發明昆蟲病原真菌轉基因菌株應用于真菌農藥中，該真菌農藥作用于 昆蟲體內時，通過轉基因菌株的超量表達酸性海藻糖酶基因，使昆蟲寄主體內酸性海藻糖 酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促進了病原真菌在寄主昆蟲體內生長，從而有效地提高 了真菌農藥如綠僵菌、白僵菌等真菌農藥的殺蟲活性。
圖1 酸性海藻糖酶(ATM)基因表達載體結構示意圖
(A)pBarEx-ATM
(B)pBGFP-ATM
圖2 綠僵菌、白僵菌ATM轉基因菌株與空載體轉化子PCR馬i證電泳圖
(A) pBarEx-ATM 載體轉化
(M)Marker
(l)Ma0E017
⑵ MaVT
(3)MaffT (CQMal02)
(4)Bb0E113
(5) BbVT
(6)BbffT(CQBb022)
(B) pBGFP-ATM載體轉化
(M)Marker
(l)Ma0E112
(2)MaffT (CQMal02)
(3)Bb0E093
(4)BbffT(CQBb022)
圖3 轉基因菌株酸性海藻糖酶(ATM)基因的表達量
A 綠僵菌酸性海藻糖酶基因的表達量；B 白僵菌酸性海藻|套酶基因的表達量
圖4 綠僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株對蝗蟲的生物活性比較
圖5 白僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株對蝗蟲的生物活性比較圖6 綠僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株侵染寄主昆蟲后，蝗蟲血 淋巴中酸性海藻糖酶活性圖7 綠僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株侵染寄主昆蟲后，蝗蟲血 淋巴中酸性海藻糖酶同功酶分析(l)MaffT(2)MaVT(3)Ma0E017(4)空白對照(棉籽油接種蝗蟲)圖8 綠僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株侵染寄主昆蟲后，蝗蟲血 淋巴中海藻糖含量圖9 綠僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株侵染寄主蝗蟲后，在蝗蟲 血淋巴中的生長量
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員可 以根據上述本發明內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。實施例1一種昆蟲病原真菌轉基因菌株的制備方法1、構建酸性海藻糖酶基因組成性表達載體# 先，卞艮 ig pBGFP(Cao YQ, Peng GX, He ZB, Wang ZK, Yin YP, Xia YX. Transformation of Metarhizium anisopliae with benomyl resistance and green fluorescentprotein genes provides a tag for genetically engineered strains. Biotechnology Letters, 2007, 29 :907_911)構建絲狀真菌表達載體 pBarEx 設計引物 1( 5，-attaRacRtcRcaRRtcRacaRaaRaatRac-3，，下劃線為 Aat II 酶切位點)與弓丨物 2(5，-gtc ggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3‘) H勾H 曲DNA 中才/“土曾 色氨酸合成酶啟動子(pTryC)序列；設計引物3(5’ -gcggccgctctagtggatctaccatgagccca gaacgacgcccggccgac-3’，與引物2反向互補系列；其中駐g為Bar基因起始密碼子)與引 物 4(5，-CRCRRatccaRcttttattaRatctcRRtRac-3，，下劃線為 BamHI 酶切位點)從 pCAMBIA 3300 (購自CAMBIA公司)中擴增Bar基因序列；以引物1和引物4，采用融合PCR擴增pTryC 控制下的Bar Cassette ；將pBGFP與Bar Cassette分別采用Aatll與BamHI雙酶切后，用 T4連接酶連接構建成絲狀真菌表達載體pBarEx。其次，根據綠僵菌CQMal02(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 存，CGMCC菌株號0877，在中國科學院微生物研究所可以購買到)酸性海藻糖酶基因全長 cDNA 核酸序列(GenBank 登錄號EF190950)設計的引物 1 (5’-CCATCGATATGCGCGCGACTCCCA TG-3’，下劃線為 Clal 酶切位點)與引物 2 (5，-TCCCCCGGGCTAAAACGCTCTACCCTT-3，，下劃線 為Smal酶切位點)，以綠僵菌CQMal02cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出兩端 分別帶有Clal與Smal酶切位點的3303bp的ATM基因全長cDNA序列，并將其分別克隆到絲狀真菌表達載體pBarEx或pBGFP的Clal和Smal位點之間，使ATM基因處于來自構巢曲 霉3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因的啟動子與色氨酸(trpC)基因的終止子控制之下，分 別得到海藻糖酶基因組成性表達載體pBarEx-ATM(見附圖1A)或pBGFP_ATM(見附圖1B)， pBarEx-ATM或pBGFP-ATM載體用CaCl2法分別轉入大腸桿菌中并進行擴增，載體大量提取 的產物經Spe I線性化后去磷酸，再經酚-氯仿抽提得到濃度為500-1000 ug/ml的上述線 性化組成性表達載體，0D260/280在1. 80-1. 85之間。以pBarEx空白載體為對照。2、建立昆蟲病原真菌液生分生孢子轉化體系將100 u 1的綠僵菌CQMal02或白僵菌CQBb022分生孢子水懸浮液(濃度為107個 /ml)分別接種于裝有100ml 1/4強度薩氏液體培養基(1/4SDA) (10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋 白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6. 5)的250ml三角瓶中，28°C，250rpm振蕩培養3-4天，四 層滅菌紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無菌水重懸清洗2次，最后20 % 無菌甘油重懸使孢子濃度達108個/ml，50 u 1/管分裝后-80°C保存。3、轉化與篩選轉化時取50iU分生孢子懸液于滅菌60mm平皿中央，使其直徑達1cm，然后 放于70%乙醇滅菌基因槍室內。按照Biolistic PDS-1000/he Particle Delvery System(Bio-Rad)系統提供的方法進行金粉的處理和線性載體pBarEx_ATM或pBGFP-ATM的 包埋，并利用該系統，以1350psi氣壓，27. 5英寸汞(Hg)真空度進行微粒子轟擊。以pBarEx 空白載體為對照。轟擊后取出樣品，在超凈臺上取出孢子液，用5ml無菌水稀釋，取lOOul 涂布于除草劑草丁膦(phosphinothricin，PPT)或苯萊特(Benomyl)篩選培養基平板上 26 °C -28°C培養10天左右。綠僵菌與白僵菌篩選培養基分別為含有濃度為80Ug/ml、10Ug/ml PPT或含有濃度 為 5ug/ml 苯萊特(Benomyl)的查氏培養基(2g/l NaN03, lg/1 K2HP04, KC1 0. 5g/l，0. 5g/ lMgS04,0. 01g/l FeS04，30g/l蔗糖，15-20g/l瓊脂，pH自然)。10天后挑取正常生長單菌落， 在相應篩選培養基與1/4SDA平板上交替傳代4次，選取菌落仍然能夠正常生長的穩定轉基 因菌株。同時采用 PCR 方法，以引物對(5，-gactgcccgc attgagaag-3，與 5，-agatggagga gttggtgttg-3，)驗證轉基因菌株 Bar 基因或以引物對(5，-gcttactcctccttgacaccac-3， % 5' -agccgagtatggtaaccaaggg-3‘ )liftt Tubulin轉化篩選后分別得到含有Bar基因的ATM綠僵菌轉基因菌株與空載體綠僵菌轉化 子(Ma0E017，MaVT)與ATM白僵菌轉基因菌株與空載體白僵菌轉化子(Bb0E113，BbVT)(見 附圖2A)，和含有抗苯萊特基因的ATM綠僵菌轉基因菌株(Ma0E112)與ATM白僵菌轉基因菌 株(Bb0E093)(見附圖 2B)。為了驗證本發明提供的方法可以提高昆蟲病原真菌孢子的殺蟲活性及其機制，發 明人作了如下實驗1、利用定量PCR檢測轉基因菌株中酸性海藻糖酶(ATM)基因的表達量將綠僵菌的超表達轉基因菌株(Ma0E017)、空載體轉化子(MaVT)、出發菌株 CQMal02 (MaffT)與白僵菌超表達轉基因菌株Bb0E113、空載體轉化子(BbVT)、出發菌株 CQBb022 (BbffT)的分生孢子分別接種在1/4 SDA平板上，28°C恒溫培養12-15天；用接種鏟 輕刮下孢子粉，懸浮在滅菌的0. 01% Tween 80 (w/v)溶液中混勻，四層擦鏡紙過濾后用血 球計數板計數，配制IX 108個/ml的孢子懸液；按(v/v)的接種量接種于海藻糖為唯一碳源的基本鹽液體培養基(ICM)中(1.0g/l KH2P04,0. 5g/l MgS04,1. Og/1 KCl，2g/l 硫酸 銨，10g/l海藻糖，10g/l MES，初始pH 6.0)中，28°C，250rpm振蕩培養，每天取3ml培養液， 4°C 12000g離心收集菌絲。按Promega總RNA提取試劑盒說明書提取菌株總RNA，按Promega 反轉錄酶說明書以隨機引物反轉錄成第一鏈cDNA，以此為模板，用引物7(5’ -tccttgatgg ctattccgc-3’ )禾口弓丨物 8(5，-gcgccgacccattttgtgattc-3’ )進行定量 PGR 檢測 ATM 基因 的表達，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpdA)基因為參照，見附圖3。從附圖3A可以看出，在海藻糖酶誘導培養基ICM中培養2-4天，綠僵菌ATM超 表達轉基因菌株(Ma0E017)的ATM基因表達水平都顯著高于出發菌株CQMal02(MaWT) (p <0.01)，為出發菌株(MaWT)的1.7-2. 3倍，而綠僵菌空載體轉化子(MaVT)與出發菌株 (MaWT) ATM基因表達水平無顯著差異(p > 0. 05)。與此相似，從附圖3B可以看出，在海藻 糖酶誘導培養基ICM中培養2-4天，白僵菌ATM超表達轉基因菌株(Bb0E093)的ATM基因 表達水平上都顯著高于與出發菌株(BbWT) (p < 0. 01)，而白僵菌空載體轉化子(BbVT)與出 發菌株Bb022 (BbWT)的ATM基因表達水平無顯著差異(p > 0. 05)。這說明轉ATM基因的綠 僵菌與白僵菌菌株中都能超量表達ATM基因，而空載體序列不影響ATM基因的表達。2、綠僵菌轉基因菌株殺蟲活性本實驗以綠僵菌CQMal02菌株的寄主昆蟲東亞飛蝗為實驗材料，測定綠僵菌轉基 因菌株殺蟲活性。將活化的CQMal02與其轉基因菌株孢子用滅菌水配成濃度為1 X 105個孢子/ml的 孢子懸浮液，均勻涂在直徑為9cm的1/4SDAY平板上(100 yl/皿)，26°C培養15d，完全產 孢。將孢子刮下后放在干燥器中干燥后用棉籽油渦旋分散，靜置10-15min，吸取中層孢子油 懸浮液，采用新鮮煤油(透明)稀釋測定濃度，根據濃度將配好的孢子油懸浮液用棉籽油梯 度稀釋至 1. 6 X 105，8 X 105，4 X 106，2 X 107，1 X 108 和 5 X 108 個孢子 /ml 備用。選取羽化后3-4天的東亞飛蝗健康雄蟲，用微量移液槍吸取5 ill的綠僵菌孢 子油懸浮液，在蝗蟲前胸背板下點滴接種后放入生測籠中，調節溫度26-28°C，相對濕度 40-70%，每天更換新鮮麥苗或人工飼料，并觀察、記載各處理的死蟲數。以棉籽油接種為空 白對照(control)。根據蝗蟲每天死亡累計蟲數采用DPS軟件統計LT5(I、LT9(I，結果見附圖4 與表1。從附圖4與表1可以看出，綠僵菌空載體轉化子(MaVT)與出發菌株(MaWT)接 種蝗蟲后存活率無明顯差異，但接種5天后顯著高于綠僵菌ATM轉基因菌株(Ma0E017) (p < 0. 01)；接種后7天，Ma0E017處理組蝗蟲存活率小于10%，而MaVT與MaWT處理組存活率 都約為60%。另外，MaWT LT5。較Ma0E017處理組推遲1.2天(18. 8%)，而LC5Q為Ma0E017 處理組的約15倍(附表1)。這些說明ATM超表達綠僵菌轉基因菌株較出發菌株對寄主昆 蟲蝗蟲的生物活性明顯提高。附表1綠僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株對蝗蟲室內防治效果比
較 3、白僵菌轉基因菌株殺蟲活性本實驗以白僵菌CQBb022菌株的寄主昆蟲玉米螟為實驗材料，測定白僵菌轉基因 菌株殺蟲活性。按上面方法配制濃度為至1. 6 X 105，8 X 105，4 X 106，2 X 107，1 X 108和5 X 108個孢 子/ml的白僵菌CQBb022孢子油懸浮液。選取3齡玉米螟幼蟲，放入墊有濾紙的直徑為9cm 培養皿中，置于噴霧塔(BURKARD)載物臺中央固定，調節氣壓為lOpsi，用50iU不同處理處 理白僵菌孢子油懸浮液噴霧后將培養皿轉入生測室，調節溫度25-28°C，放入玉米葉。接種 后，每12小時觀察一次觀察并記載各處理的死蟲數。根據死亡后身體是否變硬判斷為玉米 螟是否為白僵菌侵染致死。以棉籽油接種為空白對照(control)。根據玉米螟每天死亡累 計蟲數采用DPS軟件統計LT5(i、LT90O結果見附圖5與表2。從附圖5與表2可以看出，白僵菌空載體轉化子(BbVT)與出發菌株 CQBb022 (BbffT)接種蝗蟲后存活率無明顯差異(p > 0. 05)，但在接種4天后顯著高于白僵 菌ATM轉基因菌株BbOEl 13 (p < 0. 01)，接種后7天，當BbOEl 13玉米螟存活率小于5 %，而 BbffT與BbVT處理組存活率分別為47. 9%與56. 3%。BbWT對照組LT5(1較Bb0E093處理組 推遲約0. 9天，而LC5Q為Bb0E093處理組的約13倍。這些說明白僵菌ATM超表達轉基因 菌株較出發菌株對寄主昆蟲玉米螟的生物活性明顯提高。附表2白僵菌ATM轉基因菌株、空載體轉化子與出發菌株對蝗蟲室內防治效果比 較 4、感病蝗蟲體內酸性海藻糖酶活性、海藻糖含量與綠僵菌生長量將綠僵菌CQMal02出發菌株、ATM轉基因菌株Ma0E017與空白轉化子MaVT孢子用 大豆色拉油懸浮，配成2X 107個孢子/ml的油懸浮液，接種蝗蟲后3、4、5、6天每處理取出 10只蝗蟲，停食2小時，將蝗蟲放置于冰上10分鐘，然后蝗蟲后腿內側關節膜采血。蝗蟲 血淋巴采集后加入10%體積的無菌冰冷抗凝血緩沖液(AC buffer 0. 017M乙二胺四乙酸 (EDTA)，0. 041M檸檬酸，pH4. 8)，6000rpm離心6分鐘，分別收集上清與沉淀。以棉籽油接種 后的蝗蟲血淋巴為空白對照(Control)。酸性海藻糖酶活性測定取10ul上清置于1. 5ml離心管中，加入20ul海藻糖底 物溶液[含有50mM海藻糖的Mcllvaine緩沖液(22ml 0. 1M檸檬酸+28ml 0. 2M Na2HP04 ；pH5. 6)]，在30°C條件下反應30min ； 100°C水浴10分鐘后冰浴5分鐘，4°C下14000g離心 5分鐘之后取10ul上清置于96孔酶標板中，加入200ul葡萄糖檢測試劑(北京中生)[含 0. 5mM 4-氨基安替吡啉，20mM 羥基苯璜酸(p-hydroxybenzene sulphonate)，15，000U/ 1葡萄糖氧化酶和10，000U/1過氧化物酶]在27°C下顯色40min，使用Model 550酶標儀 (Bio-rad)，于在490nm下測光吸收值。根據葡萄糖標準品做標準曲線，計算酸性海藻糖酶 活性(見附圖6)。酸性海藻糖酶同功酶分析取50ul上清液用4°C ddH20稀釋50倍后裝入超濾 管，4°C下8，000g離心脫鹽濃縮，重復3次。脫鹽濃縮液后采用寬pH范圍兩性電解質(pH 3-10)進行在水平板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(PAGE-IEF)。陰極電泳液與陽極電泳液分 別為2mM NaOH與2mMH3P04。電泳結束后，采用覆蓋膠法對凝膠中酸性海藻糖酶進行活性顯 色將10ml含有10g/l海藻糖的0. 1M檸檬酸緩沖液(pH5. 0)、50ul 1000U/ml葡萄糖氧化 酶、50ul 2500U/ml過氧化物酶、2ml 25mg/mL 3-氨基-9-乙基-咔唑(溶解在丙酮中)與 12ml 20g/l瓊脂水溶液(60°C)混合后，均勻傾倒在凝膠表面，然后將凝膠放置在37°C下進 行保溫直到出現紅棕色染色條帶。用7%的乙酸對凝膠進行固定(見附圖7)。酸性海藻糖濃度測定蝗蟲的血淋巴上清液先用Mcllvaine緩沖液稀釋3倍，然后 于100°C加熱10分鐘，4°C下14000g離心5分鐘；取20ul上清液加入2ul海藻糖酶(2. 5U/ ml, sigma)，混勻后于37°C保溫16小時。設置空白對照反應，只加2ul海藻糖酶儲藏液 (50%甘油、Tritonx-100和25mM磷酸鉀，PH 6.5)。16小時反應后，于100°C加熱10分 鐘終止反應，接著將樣品放在冰上冷卻5分鐘，然后將冷卻后的樣品lOOOOrpm離心5分鐘。 取10ul上清液加入200ul葡萄糖測定試劑(北京中生)，26°C反應40分鐘，使用Model550 酶標儀(BioRad)，于490nm的處測定光吸收值，計算蝗蟲血淋巴海藻糖含量(見附圖8)。蝗蟲體內綠僵菌DNA濃度測定利用離心后的沉淀提取DNA，以昆蟲病原真菌特異 引物 9(5，-TGGCATCTTCTGAGTGGTG-3，)和引物 10(5，-CCCGTTGCGAGTGAGTTA-3，)進行定量 PCR，以綠僵菌DNA建立的標準曲線計算出蝗蟲體內綠僵菌DNA濃度(見附圖9)。從附圖6可以看出，感病蝗蟲體內海藻糖降解酶活性隨著侵染時間的延長從的 0. 15-0. 3U/ml (接種后3天)逐漸升高到(0. 4-0. 6U/ml)(接種后6天)，都顯著高于健康 蝗蟲體內0.08U/ml的水平(p < 0.01)；另外，綠僵菌ATM轉基因菌株(Ma0E017)處理組 蝗蟲體內海藻糖降解酶活性顯著高于綠僵菌空載體轉化子(MaVT)與出發菌株(MaWT) (p < 0. 01)。由于感病蝗蟲體內較空白對照(Control)多了一個新的等電點為4. 7的海藻糖 降解酶活性條帶，該條帶與綠僵菌體外分泌的酸性海藻糖降解酶等電點一致(Zhao H，et al.，2007)，并且蝗蟲感病后其自身的海藻糖降解酶活性受到抑制(附圖7)，說明感病蝗蟲 體內海藻糖降解酶活性由蝗蟲體內綠僵菌分泌的酸性海藻糖酶量決定。附圖7也表明綠 僵菌ATM超表達轉基因菌株(Ma0E017)處理組蝗蟲體內海藻糖降解酶活性明顯高于綠僵菌 空載體轉化子(MaVT)與出發菌株(MaWT)。相應的，從附圖8可以看出，綠僵菌ATM超表達 轉基因菌株(Ma0E017)處理組蝗蟲體內海藻糖濃度顯著低于空載體轉化子(MaVT)與出發 菌株(MaWT)，生物量顯著高于綠僵菌空載體轉化子(MaVT)與出發菌株(MaWT)處理組。這 些說明ATM超表達綠僵菌轉基因菌株在寄主昆蟲體內通過超量表達ATM基因，提高寄主昆 蟲體內血淋巴中ATM的活性，增強綠僵菌利用寄主昆蟲體內血淋巴中海藻糖的能力，促進 綠僵菌在昆蟲體內生長，從而提高菌株的殺蟲活性。
實施例2昆蟲病原真菌轉基因工程菌株Ma0E017孢子粉真菌農藥的制備將1ml濃度為107個/ml的綠僵菌轉基因工程菌株Ma0E017成熟分生孢子水懸 浮液接種于裝有100ml 1/4強度薩氏液體培養基(1/4SDA) (10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋白胨， 5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6. 5)的250ml三角瓶中，28°C，150rpm振蕩培養3天，準備液體菌 種；將大米在室溫(25°C )用自來浸泡4小時候后裝入蘑菇袋中，121°C滅菌30分鐘后冷卻 至25°C;按重量比為1 10的比例接種轉基因工程菌株Ma0E017液體菌種，混合均勻，28°C 下培養15天后用干燥器中用變色硅膠干燥，用80目篩網收集綠僵菌轉基因菌株Ma0E017 干孢子粉真菌農藥，4 °C密封保存。實施例3昆蟲病原真菌轉基因工程菌株Ma0E017油懸浮劑真菌農藥的配制將800g的菜籽油和200g含綠僵菌轉基因菌株Ma0E017干孢子粉放在攪拌機中 (1000-1500轉/分鐘)混合20分鐘均勻，用80目濾網過濾后配置成20%的綠僵菌油懸浮 劑真菌農藥，用油稀釋3-5倍后采用超低容量技術噴霧。實施例4昆蟲病原真菌轉基因菌株Ma0E017可濕性粉劑真菌農藥的配制將200g含500億孢子/克綠僵菌轉基因菌株Ma0E017干孢子粉、740g硅藻土、30g 脂肪醇聚氧乙烯醚、20g烷基酚聚氧乙烯醚、10g司班放在攪拌機中(1000-1500轉/分鐘) 混合20分鐘均勻，用80目濾網過篩后配制成100億孢子/克可濕性粉劑真菌農藥，使用時 用水稀釋500-2000倍后采用噴霧。
權利要求
昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述轉基因菌株含有同源或異源酸性海藻糖酶組成性外源基因。
2.如權利要求1所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述酸性海藻糖酶組 成性外源基因為pBarEx-ATM或pBGFP-ATM。
3.如權利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述昆蟲病原真 菌為白僵菌、綠僵菌、擬青霉或輪枝菌。
4.如權利要求3所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述昆蟲病原真菌轉 基因菌株，是通過構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體，然后建立液生分生孢 子轉化體系，再進行選擇性地篩選得到的。
5.如權利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述昆蟲病原真 菌轉基因菌株，是通過構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體，然后建立液生分 生孢子轉化體系，再進行選擇性地篩選得到的。
6.如權利要求4所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述構建酸性海藻糖 酶基因全長cDNA組成性表達載體中的酸性海藻糖酶基因來自綠僵菌CQMal02。
7.如權利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于所述轉基因菌株是通過PCR聚合酶鏈式反應擴增綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全 長cDNA核酸序列，并將其克隆到以除草劑抗性基因——Bar基因為篩選標記的真菌表達載 體pBarEx或以Benomy 1抗性基因——β _微管蛋白基因為篩選標記的真菌表達載體pBGFP， 使ATM基因處于來自構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA基因的啟動子或磷酸丙糖異構 酶tpiA基因的啟動子與色氨酸合成酶trpC基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組 成性表達載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；再建立利用基因槍法轉化綠僵菌或白僵菌液生分 生孢子的體系，將pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到綠僵菌、白僵菌基因組、擬青霉或輪枝菌 中；最后經過抗性篩選和聚合酶鏈式反應法篩選得到的。
8.如權利要求1-7任一項所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株的制備方法，其特征在于a.構建酸性海藻糖酶基因組成性表達載體首先根據PBGFP構建絲狀真菌表達載體pBarEx 設計引物1與引物2從構巢曲霉基因 組DNA中擴增色氨酸合成酶啟動子PtryC序列；設計引物3與引物4從pCAMBIA3300中擴 增Bar基因序列；以引物1與引物4，采用融合PCR擴增PtryC控制下的BarCassette ；將 PBGFP與Bar Cassette分別采用AatII與BamHI雙酶切后，用T4連接酶連接構建成絲狀真 菌表達載體 pBarEx ；所述弓I物 1 為 5，-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3', T^'J^^J Aat II 酶切位點；所述弓I物 2 為 5，-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcgg ccgc-3，；所述弓I物 3 為 5，-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3‘, 與引物2反向互補系列，其中駐g為Bar基因起始密碼子；所述引物4為5，-CgCggatCCagC ttttattagatctcggtgac-3，，下劃線為 BamHI 酶切位點；其次，根據綠僵菌CQMal02酸性海藻糖酶基因全長cDNA核酸序列設計的引物5與引物 6，以綠僵菌CQMal02cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應擴增出兩端分別帶有ClaI與SmaI 酶切位點的3303bp的ATM基因全長cDNA序列，并將其克隆到絲狀真菌表達載體pBarEx或 PBGFP的ClaI和SmaI位點之間，使ATM基因處于來自構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA 基因的啟動子與色氨酸trpC基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組成性表達載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM ；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表達載體用CaCl2法轉入大腸桿菌中 并進行擴增，載體大量提取的產物經SpeI線性化后去磷酸，再經酚-氯仿抽提得到所述線 性化組成性表達載體；所述引物5為5’ -ccatcgatatgcgcgcgactcccatg-3',下劃線為ClaI 酶切位點；所述引物6為5，-tcccccgggctaaaacgctctaccctt-3，,下劃線為SmaI酶切位點；b.建立利用基因槍法轉化昆蟲病原真菌液生分生孢子的體系 將Iml濃度為IO7個/ml的綠僵菌CQMal02或白僵菌CQBb022成熟分生孢子水懸浮液 接種于裝有IOOml 1/4強度薩氏液體培養基的250ml三角瓶中，28°C，250rpm振蕩培養3 天，四層滅菌紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無菌水重懸清洗2次，最 后20%無菌甘油重懸使孢子濃度達IO8個/ml，分裝后-80°C保存；所述薩氏液體培養基為 10g/l葡萄糖，2. 5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6. 5 ；c.轉化與篩選轉化時取出50 μ 1所述液生分生孢子懸浮液與滅菌平皿中央，使其直徑達到lcm，然后 放入75%乙醇消毒的基因槍室內用于轉化按照Bio-Rad系統提供的方法進行金粉的處理 和線性載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用該系統進行微粒子轟擊；轟擊后在超 凈臺上取出孢子液，用5ml無菌水稀釋，取IOOul涂布于除草劑草丁膦或苯萊特篩選培養基 平板上，28°C培養；綠僵菌采用80ug/ml PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，白僵菌篩選 采用10ug/ml PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，10天后挑取正常生長單菌落，在相應 篩選培養基與1/4SDA平板上交替傳代5次后提取DNA，利用5，-gactgcccgcattgagaag-3' 與5’-agatggagga gttggtgttg-3’的特異引物對，經PCR驗證轉基因菌株Bar基因，或利用 5，-gcttactcctccttgacaccac-3，與 5，-agccgagtatggtaaccaaggg-3‘的特異弓丨物對，驗證 轉基因菌株β -Tubulin基因，得到穩定轉基因菌株。
9.如權利要求1-7任一項所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株在制備真菌農藥中的應用。
全文摘要
昆蟲病原真菌轉基因菌株，其含有同源或異源酸性海藻糖酶組成性外源基因；其是通過構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體，然后建立液生分生孢子轉化體系，再進行選擇性地篩選制得的；本發明昆蟲病原真菌轉基因菌株在制備真菌農藥中的應用。本發明昆蟲病原真菌轉基因菌株表達海藻糖酶的效率高；本發明制備方法易操作、重復再現性好；本發明昆蟲病原真菌轉基因菌株應用于真菌農藥中，該真菌農藥作用于昆蟲體內時，通過轉基因菌株的超量表達酸性海藻糖酶基因，使昆蟲寄主體內酸性海藻糖酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促進了病原真菌在寄主昆蟲體內生長，從而有效地提高了真菌農藥如綠僵菌、白僵菌等真菌農藥的殺蟲活性。
文檔編號A01P7/04GK101886046SQ201010200520
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者夏玉先, 彭國雄 申請人:重慶大學