專利名稱：半滑舌鰨家系構建及優良家系選育方法
技術領域：
本發明屬于水產養 殖領域中的魚類良種選育方法，是一種能在半滑舌鰨優良品系 選育中應用的家系構建和選育方法。
背景技術：
半滑舌鰨(Cynoglossus semiliaevis)是我國特有的一種名貴經濟海水魚類，屬 于近海溫水性底層魚類，我國沿海均有分布，以黃海、渤海為多。半滑舌鰨由于其味道鮮美、 肉質細嫩、營養豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極高，養殖前景非常廣闊。半滑舌鰨 是目前海水魚類養殖的主要品種之一，其養殖產量目前近萬噸，價格昂貴，市場價達到200 元/1000克左右，半滑舌鰨養殖業目前每年的產值約為20億元人民幣。但是，隨著半滑舌鰨養殖業的快速發展，一些問題相繼出現。由于長期近親繁殖， 導致半滑舌鰨人工繁殖的苗種生長速率下降、抗病能力降低，病害發生頻繁，導致半滑舌鰨 養殖魚苗和魚種大量死亡。影響半滑舌鰨的主要病害目前發現的主要包括細菌性和病毒性 疾病，而由鰻弧菌引起的細菌性疾病是危害半滑舌鰨較大的一種疾病。每年因病害導致半 滑舌鰨養殖業損失數億元人民幣。盡管采取傳統的防病措施如使用抗菌素類等藥物有一 定效果，但這些藥物易于使病原菌產生抗藥性，同時對養殖環境也產生污染，特別是在魚體 內積累，對人類的健康具有潛在危害，因而在實際生產中的應用越來越受到限制。因此，培 育生長速度快、抗病能力強的半滑舌鰨優良品系成為半滑舌鰨養殖業中亟待攻克的重要課 題。鑒于半滑舌鰨的養殖潛力和潛在的經濟社會效益，近年來，我國科技工作者對半 滑舌鰨生殖調控、性別控制和養殖技術進行了大量研究，主要包括采用人工控制光照和水 溫的方法刺激半滑舌鰨親魚成熟和自然產卵，該項技術于2002年獲得成功，并生產出了半 滑舌鰨苗種。另外，研究表明，半滑舌鰨雌性個體和雄性個體，在生長速率上存在明顯差別， 其雌性個體比雄性個體大2-4倍(中國水產科學研究院黃海水產研究所，孟田湘等，1988)， 半滑舌鰨魚苗經過1年養殖后，雌性個體可長到500-750克，而雄性個體則只有50-150克。 由于雄性個體生長過慢，影響了商品魚的質量，降低了半滑舌鰨的養殖產量，增加了養殖成 本，因而嚴重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養殖產業的發展，鑒于此，近年來，國內學者對 半滑舌鰨雌核發育和性別控制技術進行了系統研究。如篩選出半滑舌鰨雌性特異分子標 記的研究(中國水產科學研究院黃海水產研究所，Chen SL et al.，2007)，建立了分子標記 輔助性別控制技術(Chen SL et al.，2008)，將半滑舌鰨魚苗的雌性比例由不到50%提高 到70%左右；另外，還建立了半滑舌鰨人工雌核發育技術(Chen SL et al.，2009)，從而部 分解決了半滑舌鰨雄性生長緩慢的問題。但通過這些技術難以解決半滑舌鰨種質退化和病 害頻發的問題，而家系選育則是進行抗病高產良種選育的主要手段之一。但到目前為止，有 關半滑舌鰨家系建立及其快速生長和抗病力強優良家系篩選方面的研究尚未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種半滑舌鰨家系構建及抗病快速生長家系篩選的方法，為 半滑舌鰨抗病及高產新品種培育提供技術方法，為魚類養殖業提供抗病及高產新品種選育 的技術手段。本發明技術內容如下包括一、半滑舌鰨群體選育；二、半滑舌鰨家系構建；三、 半滑舌鰨抗病家系及生長快速家系的篩選。—、半滑舌鰨群體選育包括半滑舌鰨野生群體、人工養殖群體的選育。野生群體的選育是收集從渤海灣捕撈的半滑舌鰨魚苗或魚種，選擇體表沒有傷 痕，健康活力強的魚苗或魚種作為野生群體，放養在水泥池中進行養殖，當魚苗生長到12-18 厘米時，鑒定魚苗的性別后，將雌、雄魚苗分開養殖。經過2-3年養殖后，再按照的比例分 別從雌魚群體和雄魚群體中各選出個體大的40-50尾魚作為雌、雄親魚，用于家系構建。人工養殖群體的選育人工養殖群體為半滑舌鰨養殖場人工繁殖的魚苗，從山東 等地半滑舌鰨養殖場培育的魚苗中篩選出生長快的個體進行培育，選擇比例為0. 5-1%, BP 從人工養殖2-3年的10000尾半滑舌鰨雌性成魚中選擇最大個體50尾用作雌性親魚，從人 工養殖2年的2500-5000尾半滑舌鰨雄性成魚中選擇個體大的25-50尾用作雄性親魚，經 過強化培育后，作為繁殖用親魚，用于家系構建。二、半滑舌鰨家系構建從半滑舌鰨野生群體和人工養殖群體中選取性成熟的健康親魚，在每年6-9月份 通過控溫控光誘導親魚性腺發育和成熟。當雌魚腹部明顯隆起、性腺長度達到體長的約一 半時，對雌雄魚進行人工催產，獲得成熟雄魚的精液和成熟雌魚的卵子。利用來自1尾雄魚 的精液和來自1尾雌魚的卵子進行干法授精，將交配產生的受精卵放在一個具有微流水及 微充氣的網箱中進行孵化，一個網箱只放一個家系的受精卵。在魚苗即將孵化出膜時，將其 轉移到2-3立方米體積的育苗缸中進行培育，每個缸中只放一個家系的魚苗，每立方米水 體培育5000-8000尾仔魚。每次應該建立20-40個家系，每個家系應該培育500-1000尾魚 苗用于抗病和高產家系的篩選。三、半滑舌鰨抗病家系及生長快速家系的篩選。1).半滑舌鰨抗病家系的篩選當半滑舌鰨各個家系魚苗生長至10-12cm時，采用浸泡方法對各個家系魚苗進行 鰻弧菌感染，評價各家系魚苗的抗鰻弧菌病能力，感染所用的鰻弧菌菌株的培養按照常規 方法進行。首先進行預感染實驗確定菌液半致死濃度，預感染實驗用的魚苗，為來自10個 家系的相同數量魚苗的混合群體，每個家系取50-100尾魚苗混合在一起。預感染時，將培 養好的菌液用生理鹽水稀釋成濃度為2. 0-3. OOD的菌液，將上述菌液用新鮮海水稀釋成不 同的濃度(稀釋50、100、200、300、400、600倍)，將混合魚苗隨機分成6組，每組80-150尾 魚苗，將每組80-150尾混合家系魚苗放在一個濃度菌液的海水中浸泡3-5小時后，6組魚苗 放在6個不同菌液濃度的海水中浸泡感染，感染時水溫控制在21-23°C，感染后將魚苗轉到 微流水及微充氣的海水中飼養，在隨后的15-20天內計算各個濃度組的魚苗死亡率，將引 起40-60%魚苗死亡的菌液濃度確定為半致死濃度。按照半致死濃度進行正式感染實驗，感染方法同預感染實驗。不同家系分別進行 感染，每個家系每次感染50-100尾魚苗，重復實驗1次。感染用魚養殖在0. 3-lm3的玻璃鋼水槽中。感染后，每天對各個家系魚苗的狀態及死亡數量進行觀察記錄，測量死亡個體的 全長及體重。在感染后20-30天，記錄所有家系的魚苗存活數量，測量存活魚苗的全長和體 重。根據參加感染魚苗的數量以及感染后的存活數量，計算各個家系的魚苗存活率，評價各 家系的抗病性能。將成活率在55%以上的家系定義為抗病力強的家系，成活率在40-55% 的家系定義為抗病力較強家系，成活率在20-40%的家系定義為抗病力一般的家系，成活率 在20%以下的家系定義為抗病力差的家系。2)、半滑舌鰨快速生長家系的篩選當半滑舌鰨各個家系魚苗生長至全長為10-12cm時，從每個家系未感染的魚苗中 選取200尾，采用熒光顏料標記不同家系的魚苗，標記后的魚苗混養在35-40m3的水泥池 中。在養殖8-15個月后收集各家系魚苗進行全長和 體重測量。每個家系的魚苗采樣60-100 尾進行測量，計算各個家系全長和體重的平均數。利用日增重率(養殖期間增加的重量/實 際養殖時間)評價不同家系的生長性能。日增重率越大，其生長速度越快、生長性能越好。 將日增重率在0. 25以上的家系確定為快速生長家系，日增重率在0. 2-0. 25之間的家系確 定為較快生長家系；日增重率在0.2以下的家系確定為生長速度一般的家系。本發明與已有技術對比其特點是本發明采用群體選育和種內雜交技術建立家系，然后采用人工感染途徑從大量的 家系中篩選出抗鰻弧菌病的家系，通過生長比較篩選出生長快的家系，這些優良家系魚苗 可直接進行推廣應用，或用于半滑舌鰨高產抗病優良品種的培育。本發明具有針對性強、選育效率高、操作簡單、效果明顯等特點，建立的半滑舌鰨 優良家系篩選方法為半滑舌鰨高產抗病優良品種培育開辟了新的技術途徑，適宜在其它養 殖魚類上進行推廣應用，對養殖魚類高產抗病良種培育具有重要意義和應用價值。
具體實施例方式
下面通過半滑舌鰨家系的構建及快速生長和抗病家系的篩選，對本發明的技術內 容進行詳細敘述本發明技術內容如下包括一、半滑舌鰨群體選育；二、半滑舌鰨家系構建；三、 半滑舌鰨抗病家系和生長快速家系的篩選。一、半滑舌鰨群體選育包括半滑舌鰨野生群體、人工養殖群體的選育。野生群體的選育是收集從渤海灣捕撈的半滑舌鰨魚苗或魚種，選擇體表沒有 傷痕，健康活力強的魚苗或魚種作為野生群體，放養在水泥池中進行養殖，當魚苗生長到 12-18厘米時，鑒定魚苗的性別后，將雌、雄魚苗分開養殖。經過2-3年養殖后，再按照 的比例分別從雌魚群體和雄魚群體中各選出個體大的40-50尾魚作為雌、雄親魚，用于家 系構建。人工養殖群體的選育人工養殖群體為半滑舌鰨養殖場人工繁殖的魚苗，從山東 等地半滑舌鰨養殖場培育的魚苗中篩選出生長快的個體進行培育，選擇比例為0. 5-1%, BP 從人工養殖2-3年的10000尾半滑舌鰨雌性成魚中選擇最大個體50尾用作雌性親魚，從人 工養殖2年的2500-5000尾半滑舌鰨雄性成魚中選擇個體大的25-50尾用作雄性親魚，經 過強化培育后，作為繁殖用親魚，用于家系構建。本發明是從2003年10月開始，大量收集從渤海灣捕撈的半滑舌鰨魚苗或魚種進行養殖，共收集和養殖了 8000多尾野生魚苗，當這些魚苗生長到13厘米以上時，鑒定魚苗 的性別后，將雌、雄魚苗分開養殖，經過3-4年的人工養殖，于2007年從中篩選出快速生長 的雌性成魚40多尾和雄性成魚40多尾，放養在不同水泥池中進行養殖，用于人工催產和家 系構建。人工養殖群體為從山東等地半滑舌鰨養殖場養殖的人工繁殖的10000多尾雌性魚 苗中篩選出生長最快的雌性成魚50多尾，和從5000多尾雄性魚苗中篩選出雄性成魚50多 尾，用于人工催產和家系構建。經過強化培育后達到性成熟，挑選個體大、無外傷、性腺發育 良好，具有活力的個體作為繁殖用魚。二、半滑舌鰨家系構建 利用篩選出的半滑舌鰨野生群體和人工養殖群體作為基礎群體，采用種內雜交的 方法建立半滑舌鰨家系。從半滑舌鰨野生群體和人工養殖群體中選取性成熟的健康親魚， 在每年6-9月份通過控溫控光誘導親魚性腺發育和成熟。當雌魚腹部明顯隆起、性腺長度 達到體長的約一半時，對雌雄魚進行人工催產，獲得成熟雄魚的精液和成熟雌魚的卵子。利 用來自1尾雄魚的精液和來自1尾雌魚的卵子進行干法授精，將來自一尾雄魚和一尾雌魚 交配產生的受精卵(即一個家系)放在一個具有微流水及微充氣的網箱中進行孵化，一個 網箱只放一個家系的受精卵。在魚苗即將孵化出膜時，將其轉移到2-3立方米體積的育苗 缸中進行培育，每個缸中只放一個家系的魚苗，每立方米水體培育5000-8000尾仔魚。每次 應該建立20-40個家系，每個家系應該培育500-1000尾魚苗用于抗病和高產家系的篩選。本發明中的半滑舌鰨家系建立于2008年9月和10月，主要在山東省萊州明波水 產有限公司進行家系構建和養殖。采用野生群體和養殖群體2個繁殖群體中可以擠出精液 和催產出卵子的魚作為建立家系的親本。用于建立家系的野生雄性半滑舌鰨親魚為27尾； 養殖群體雄性半滑舌鰨親魚4尾；雌性半滑舌鰨親魚共35尾。人工采集精卵干法授精，共 建立半滑舌鰨半同胞和全同胞家系35個。將這些家系魚苗分別進行養殖，其養殖按照常規 方法進行。三、半滑舌鰨優良家系的篩選1).半滑舌鰨抗病家系的篩選當半滑舌鰨各個家系魚苗生長至10-12cm時，采用浸泡方法對各個家系魚苗進行 鰻弧菌感染，評價各家系魚苗的抗鰻弧菌病能力，感染所用的鰻弧菌菌株的培養按照常規 方法進行。首先進行預感染實驗確定菌液半致死濃度，預感染實驗用的魚苗，為來自10個 家系的相同數量魚苗的混合群體，每個家系取50-100尾魚苗混合在一起。預感染時，將培 養好的菌液用生理鹽水稀釋成濃度為2. 0-3. OOD的菌液，將上述菌液用新鮮海水稀釋成不 同的濃度(稀釋50、100、200、300、400、600倍)，將混合魚苗隨機分成6組，每組80-150尾 魚苗，將每組80-150尾混合家系魚苗放在一個濃度菌液的海水中浸泡3-5小時后，6組魚苗 放在6個不同菌液濃度的海水中浸泡感染，感染時水溫控制在21-23°C，感染后將魚苗轉到 微流水及微充氣的海水中飼養，在隨后的15-20天內計算各個濃度組的魚苗死亡率，將引 起40-60%的魚苗死亡菌液濃度確定為半致死濃度。按照半致死濃度進行正式感染實驗，感染方法同預感染實驗。不同家系分別進行 感染，每個家系每次感染50-100尾魚苗，重復實驗1次。感染用魚養殖在0. 3-lm3的玻璃 鋼水槽中。感染后，每天對各個家系魚苗的狀態及死亡數量進行觀察記錄，測量死亡個體的 全長及體重。在感染后20-30天，記錄所有家系的魚苗存活數量，測量存活魚苗的全長和體重。根據參加感染魚苗的數量以及感染后的存活數量，計算各個家系的魚苗存活率，評價各 家系的抗病性能。將成活率在55%以上的家系定義為抗病力強的家系，成活率在40-55% 的家系定義為抗病力較強家系，成活率在20-40%的家系定義為抗病力一般的家系，成活率 在20%以下的家系定義為抗病力差的家系。本發明于2009年對2008年建立的半滑舌鰨家系進行了感染實驗。共感染了 18 個家系。按照上述標準，我們從18個家系中篩選出抗病力強的家系2個(家系2號和12 號)，其感染后平均存活率分別為79. 25%和56. 85%，高于其它家系。從18個家系中還獲 得抗病力比較強的家系4個(3號，10號，14號和19號)，抗病力一般的家系5個(家系6 號，7號，15號，16號和30號)，以及抗病力差的家系1個(表1)。表1 半滑舌鰨不同家系魚苗抗鰻弧菌病能力比較 2).半滑舌鰨快速生長家系的篩選當半滑舌鰨各個家系魚苗生長至全長為10_12cm時，從每個家系中選取200尾魚 苗，采用熒光顏料標記不同家系的魚苗，標記后的魚苗混養在35-40m3的水泥池中。在養殖 8-15個月后收集各家系魚苗進行全長和體重測量。每個家系的魚苗采樣60-100尾進行測 量，計算各個家系全長和體重的平均數。利用日增重率(養殖期間增加的重量/實際養殖 時間)評價不同家系的生長性能。日增重率越大，其生長速度越快、生長性能越好。將日增 重率在0. 25以上的家系確定為快速生長家系，日增重率在0. 2-0. 25之間的家系確定為較 快生長家系；日增重率在0. 2以下的家系確定為生長速度一般的家系。通過這種方法就可 以篩選出快速生長的家系。本發明中進行了 18個家系的生長比較實驗。經過一年多的培育，對2008年建立 并混合養殖的的18個家系魚苗的體重和全長進行了測量，獲得了各個家系魚苗的全長、體 重等性狀的平均值和標準差(表2)。其中，15號家系的平均體重和平均體長最高，28號家 系平均體長和平均體重最低。多重比較結果表明15號家系體重明顯大于其它家系。考慮 到家系建立的時間先后，利用日增重率評價不同家系的生長性能。從日增重率來看，15號家 系的日增重率最高，為0. 260，按照上述標準，將15號家系確定為快速生長家系；而6號、7 號、16號和30號等4個家系的日增重率分別為0. 217，0. 229，0. 246和0. 208，應該為生長 較快家系；而1號、3號、4號、10號、12號、14號19號、24號、27號，28號、33號和34號家 系的日增重率均在0.2以下，被確定為生長速度一般的家系。表2半滑舌鰨不同家系魚苗的體長、體重平均值、標準差和日增重率
采用上述方法，我們構建了半滑舌鰨家系，并從中篩選出抗病力強和生長快速的 家系，這些優良家系魚苗可以直接進行推廣應用，也可以用于高產抗病優良品種培育。
權利要求
一種半滑舌鰨家系構建及優良家系選育方法，其特征在于它的技術內容包括(1)、半滑舌鰨群體選育；(2)、半滑舌鰨家系構建；(3)、半滑舌鰨抗病家系及生長快速家系的篩選；(1)、半滑舌鰨群體選育包括半滑舌鰨野生群體、人工養殖群體的選育；野生群體的選育收集從渤海灣捕撈的半滑舌鰨魚苗或魚種，選擇體表沒有傷痕，健康活力強的魚苗或魚種作為野生群體，放養在水泥池中進行養殖，當魚苗生長到12-18厘米時，鑒定魚苗的性別后，將雌、雄魚苗分開養殖；經過2-3年養殖后，再按照1％的比例分別從雌魚群體和雄魚群體中各選出個體大的40-50尾魚作為雌、雄親魚，用于家系構建；人工養殖群體的選育人工養殖群體為半滑舌鰨養殖場人工繁殖的魚苗，從山東等地半滑舌鰨養殖場培育的魚苗中篩選出生長快的個體進行培育，再從人工養殖2-3年的10000尾半滑舌鰨雌性成魚中選擇最大個體50尾用作雌性親魚，從人工養殖2年的2500-5000尾半滑舌鰨雄性成魚中選擇個體大的25-50尾用作雄性親魚，經過強化培育后，作為繁殖用親魚，用于家系構建；(2)、半滑舌鰨家系構建從半滑舌鰨野生群體和人工養殖群體中選取性成熟的健康親魚，在每年6-9月份通過控溫控光誘導親魚性腺發育和成熟；當雌魚腹部明顯隆起、性腺長度達到體長的約一半時，對雌雄魚進行人工催產，獲得成熟雄魚的精液和成熟雌魚的卵子；利用來自1尾雄魚的精液和來自1尾雌魚的卵子進行干法授精，將交配產生的受精卵放在一個具有微流水及微充氣的網箱中進行孵化，一個網箱只放一個家系的受精卵；在魚苗即將孵化出膜時，將其轉移到2-3立方米體積的育苗缸中進行培育，每個缸中只放一個家系的魚苗，每立方米水體培育5000-8000尾仔魚；每次應該建立20-40個家系，每個家系應該培育500-1000尾魚苗用于抗病和高產家系的篩選；(3)、半滑舌鰨抗病家系及生長快速家系的篩選A.半滑舌鰨抗病家系的篩選當半滑舌鰨各個家系魚苗生長至10-12cm時，采用浸泡方法對各個家系魚苗進行鰻弧菌感染，評價各家系魚苗的抗鰻弧菌病能力，感染所用的鰻弧菌菌株的培養按照常規方法進行；首先進行預感染實驗確定菌液半致死濃度，預感染實驗用的魚苗，為來自10個家系的相同數量魚苗的混合群體，每個家系取50-100尾魚苗混合在一起；預感染時，將培養好的菌液用生理鹽水稀釋成濃度為2.0-3.0OD的菌液，將上述菌液用新鮮海水稀釋成50、100、200、300、400、600倍不同的濃度，將混合魚苗隨機分成6組，每組80-150尾魚苗，將每組80-150尾混合家系魚苗放在一個濃度菌液的海水中浸泡3-5小時后，6組魚苗放在6個不同菌液濃度的海水中浸泡感染，感染時水溫控制在21-23℃，感染后將魚苗轉到微流水及微充氣的海水中飼養，在隨后的15-20天內計算各個濃度組的魚苗死亡率，將引起40-60％魚苗死亡的菌液濃度確定為半致死濃度；采用半致死濃度進行正式感染實驗，感染方法同預感染實驗；不同家系分別進行感染，每個家系每次感染50-100尾魚苗，重復實驗1次；感染用魚養殖在0.3-1m3的玻璃鋼水槽中；感染后，每天對各個家系魚苗的狀態及死亡數量進行觀察記錄，測量死亡個體的全長及體重；在感染后20-30天，記錄所有家系的魚苗存活數量，測量存活魚苗的全長和體重；根據參加感染魚苗的數量以及感染后的存活數量，計算各個家系的魚苗存活率，評價各家系的抗病性能；將成活率在55％以上的家系定義為抗病力強的家系，成活率在40-55％的家系定義為抗病力較強家系，成活率在20-40％的家系定義為抗病力一般的家系，成活率在20％以下的家系定義為抗病力差的家系；B、半滑舌鰨快速生長家系的篩選當半滑舌鰨各個家系魚苗生長至全長為10-12cm時，從每個家系未感染的魚苗中選取200尾，采用熒光顏料標記不同家系的魚苗，標記后的魚苗混養在35-40m3的水泥池中；在養殖8-15個月后收集各家系魚苗進行全長和體重測量；每個家系的魚苗采樣60-100尾進行測量，計算各個家系全長和體重的平均數；利用日增重率，即養殖期間增加的重量/實際養殖時間，評價不同家系的生長性能；日增重率越大，其生長速度越快、生長性能越好；將日增重率在0.25以上的家系確定為快速生長家系，日增重率在0.2-0.25之間的家系確定為較快生長家系，日增重率在0.2以下的家系確定為生長速度一般的家系。
全文摘要
一種半滑舌鰨家系構建及優良家系選育方法，它的技術內容包括半滑舌鰨群體選育，半滑舌鰨家系構建，半滑舌鰨抗病家系及生長快速家系的篩選，本發明采用群體選育和種內雜交技術建立家系，然后采用人工感染途徑從大量的家系中篩選出抗鰻弧菌病的家系，通過生長比較篩選出生長快的家系，這些優良家系魚苗可直接進行推廣應用，或用于半滑舌鰨高產抗病優良品種的培育。本發明具有針對性強、選育效率高、操作簡單、效果明顯等特點，建立的半滑舌鰨優良家系篩選方法為半滑舌鰨高產抗病優良品種培育開辟了新的技術途徑，適宜在其它養殖魚類上進行推廣應用，對養殖魚類高產抗病良種培育具有重要意義和應用價值。
文檔編號A01K61/00GK101884311SQ201010221790
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者徐營, 杜民, 楊景峰, 胡喬木, 陳松林 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所