專利名稱：甘蔗試管苗的瓶外生根方法
技術領域：
本發明涉及一種植物試管苗的培養方法，特別是甘蔗試管苗的培養方法。
背景技術：
目前生產上所應用的無性繁殖作物多年種植后都會受到各種病害(細菌或病毒) 的侵染，造成產量和品質下降，如馬鈴薯、紅薯、果樹等，因此國外農業生產先進的國家都十 分重視無性繁殖作物種苗的脫毒問題。甘蔗是無性繁殖作物，病害危害相當嚴重。在生產上，甘蔗新品種種植多年后易遭 受病原物的反復侵染危害，一些細菌性病害和病毒性病害的病原物不斷在種莖中積累。危 害甘蔗生產的主要病害有鳳梨病、黑穗病、花葉病、黃葉病和宿根矮化病等，其中花葉病、黃 葉病、宿根矮化病是目前生產上傳統防治方法難以控制或去除的病害，會導致甘蔗植株變 矮、莖變細小、節間變短，使甘蔗減產、蔗糖分下降，干旱時感病率可達100% (Gillaspie, A. G. etal. 1989)。巴西李增生(Lee T. S. G.)博士報道，健康甘蔗良種在生產上種植5年后 都會100%感染宿根矮化病，且干旱蔗區更加嚴重。宿根矮化病一般會導致甘蔗節間變短、 植株變矮、產量和糖分下降，產量下降幅度達10 30%。甘蔗宿根化病、花葉病等病害雖 然對甘蔗生產影響很大，但防治手段極為有限，目前國內外普采用的方法之一是利用莖尖 組織培養方法生產脫毒健康種苗，甘蔗健康種苗增產幅度達到15%以上。由于健康種苗生 產環節多和各環節對環境條件的要求高，健康甘蔗種苗生產成本居高不下，制約了甘蔗健 康種苗的大范圍推廣種植，目前甘蔗健康種苗的售價一般為0. 6 1元/株，以每畝種植 1800 2000株/畝計算，每畝種苗成本為1080 2000元/畝，為使用種莖種成本的4. 5 8. 33倍。因此簡化甘蔗試管苗培養程序，降低生產成本，是解決制約甘蔗健康種苗大規模生 產推廣的最有效途徑。試管苗瓶外生根技術是近幾年研究成功的一項先進的組培生根技術。該技術的關 鍵是將試管苗的生根階段中的生根和馴化結合起來，省去了試管苗瓶內生根的傳統程序。 該技術的應用不僅減少了一次無菌操作步驟，節約了培養室空間，又簡化了健康種苗生產 程序，降低了生產成本，提高了生產效率。有研究證實，試管苗生產的生產成本可降低35 75%。隨著組培工廠化育苗的發展，國內外對蘋果、金線蓮等一大批植物試管苗瓶外生根技 術及其生根機理進行了廣泛的研究，并且開始應用于生產，取得了很大成功。公開文獻也報 道了甘薯、月季花、羅漢果、歐李等植物的試管苗瓶外生根方法，但目前甘蔗健康種苗生產 中主要利用試管苗瓶內生根方法誘導試管苗生根，然后移植苗圃，國內外有關甘蔗試管苗 瓶外生根技術研究還未見有報道，也未有甘蔗試管苗瓶外生根成功報道的例子。
發明內容
本發明的目的是為了簡化甘蔗試管苗生產程序，提供一種適應于甘蔗良種試管苗 快速繁殖和甘蔗健康種苗生產，達到降低甘蔗試管生產成本，提高生產效率，為甘蔗試管苗 瓶生根和苗圃移植管理的甘蔗試管苗的瓶外生根育苗的方法。
傳統的甘蔗試管苗生產程序為無菌培養體系建立——增殖擴繁——試管內生 根一一一級苗圃——二級苗圃——移栽大田；本發明的甘蔗試管苗生產程序無菌培養體系建立——增殖擴繁——試管苗單株 或不叢穴植苗圃進行瓶外生根和育苗——移栽大田；從上述可見，與傳統的甘蔗試管苗生產程序比較，本發明省略了甘蔗試管苗生產 工藝中的瓶內生根和甘蔗試管苗叢植等二個環節，直接將完成增殖擴繁培養的甘蔗試管苗 單株或單穴移植苗圃。(1)省略室內無菌生根程序，結果是減少了培養室的占用空間、配制 生根培養基的原料投入、轉管生根培養基的勞動力投入和能源投入和室內生根培養所需要 的勞動力、能源和時間等資源投入；(2)省甘蔗試管一級苗圃叢栽育苗，甘蔗試管苗單株或 單穴移植減少了苗圃占地面積、生產一級苗所需要原料和勞動力投入和省略了甘蔗試管苗 從一級苗圃移植到二級苗圃所需要的返青期從而縮短了移植周期，達到簡化生產程序和降 低生產成本的目的。本發明的具體技術步驟如下甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其生產程序如下(1)無菌培養體系建立；(2)增殖 擴繁；(3)無根試管苗單株或小叢穴植苗圃進行瓶外生根和育苗；(4)移栽大田。以上所述的無菌培養體系建立包括兩種途徑，第一種途徑是將經滅菌處理和脫毒 處理的甘蔗幼嫩心葉經誘導培養和分化培養得到的甘蔗叢生芽培養體系；第二種途徑是將 經滅菌處理和脫毒處理的甘蔗腋芽或莖尖分化培養得到的甘蔗叢生芽培養體系。上述中，誘導培養和分化培養的培養方法和培養基與目前甘蔗試管苗的培養方法 和培養基都是相同的，本技術領域的技術人員都清楚，此處不用詳細描述。以上所述的增殖擴繁是在增殖培養基中的甘蔗試管苗增殖培養基為 MS+6-BAl-2mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖30g/l，在進行增殖培養的最后一個培養周期時，將增 殖培養基中的6-BA和NAA替換為赤霉素(GA)，即使用培養MS+GA1 3mg/L+蔗糖30g/l培 養14-16天，濃度為1 3mg/L，培養條件，如光照、溫度和濕度條件與增殖培養條件相同。總的來說，要求根據生產種苗數和甘蔗試管苗質量要求來確定增殖培養時間，一 般來講甘蔗試管增殖周期不超過10個增殖周期，每個周期時長為13-16天，13-16天后要更 換新鮮增殖培養基，以保證甘蔗試管苗增殖速度和試管質量。增殖擴繁以后需要煉苗，所述的煉苗條件是赤霉素處理培養14-16天后，即將甘 蔗試管苗整瓶轉移至培養室外進行煉苗，煉苗在普通室內進行，其環境條件與普通室內的 環境條件相同。煉苗時，開瓶蓋存放，煉苗時間3 5天，煉苗時要注意瓶內有足夠的水份 或液體培養基，不能干枯。煉苗以后是栽培基質和種植盤準備栽培基質為田園土，同甘蔗實生苗的栽培基 質。將經過一定時間堆放或曬過的田園土粉碎，然后將細土裝填滿塑料育苗盆育苗孔洞，裝 完土后淋透水種植盆，以備用。將經過煉苗后的甘蔗試管苗用自來水洗干凈培養基，剪去披散葉片及尾部1/3 1/2的葉片，并且盡可能將叢生甘蔗試管苗分成單株或小叢(< 5株)，再過一次淡的高錳 酸鉀溶液(濃度為1 2000，浸泡5分鐘)或者用0.5%的多菌靈溶液消毒3 5分鐘，滴 干水后，整齊放到塑料框內準備移植育苗盆。洗苗以后需要育苗大棚搭建，育苗大棚的規格為6X20 30米的大棚，大棚高度2 2. 3米，夏季育苗天面無需蓋薄膜，四周蓋薄膜防風，棚頂蓋單層90%的遮陽網，棚內搭 小拱棚蓋塑料薄膜，以便保濕，育苗盆置于育苗大棚內。大棚四周要求挖排水溝，確保排水 良好。上述的甘蔗試管苗的瓶外生根，是將甘蔗試管苗單株或小叢移植于育苗盆孔穴 內，種植后盡快用多菌靈溶液淋定根水，并盡快搭小拱棚覆蓋薄膜保濕。大棚外面蓋遮陽 網，小拱棚內溫度達到25°C，將叢生試管苗分成單株或小叢，接著單株或小叢穴植于育苗 盆，于育苗大棚拱小拱棚，小拱棚蓋塑料薄膜保溫保濕，育苗小拱棚溫度25°C以上，濕度 90 100%，大棚蓋遮陽網，移植時間25 30天。注意移植后10天內，濕度保持在90 100%，光照強度控制在450 16000LUX ；移植后10-15天，揭開小拱棚兩頭塑料薄膜，棚內 濕度保持在80%左右；移植后15天，揭開小拱棚塑料薄膜；移植后25 30天，即可撤去育 苗大棚天面遮陽網，讓甘蔗試管苗在自然光照、溫濕度下生長。所述的育苗棚管理有以下幾個環節(1)濕度和光照強度管理假植后7 10天，管理工作關鍵是保持濕度，在早晚可 以打開一會小拱棚以換氣，其余時間一般都要蓋住保濕，根據實際情況，每天換氣煉苗時間 可逐漸延長，讓小苗慢慢適應環境條件。如果天氣晴朗，晴天陽光較強，早上9點左右至下 午5點左右，要蓋遮陽網，調節光照強度。早晚陽光較弱時，打開遮陽網，適當接受陽光，促 進小苗生根、生長。陰雨天全天打開遮陽網，以保證有充足的光照。根據育苗盆土的干濕情況決定再次澆水與否。一般在5 9月間，由于氣溫較高， 日光強烈，每天應澆水2次以上。(2)施肥和除草一般甘蔗試管種植10天后，試管苗平均根數達到2 4條，平均 根長2 3厘米，大約15天后即可施肥，隔天用千分之五的磷酸二氫鉀+尿素的液體肥噴 苗葉面，施肥前結合除草，連續噴施3 5次。移植20天后，隔天以0. 的復合肥水加少量尿素澆施蔗苗，幾次以后濃度可適 當增大到0.5%。(3)剪葉促壯苗和分蘗在整個苗期的管理過程中，適時剪去1/3 1/2的葉片， 以促進叢苗多分蘗及壯苗，同時保持蔗苗生長整齊一致。(4)移植大田待苗生長到25cm左右，可定植大田；定植時應剪去1/2的葉片，減 弱蒸騰作用。甘蔗試管苗瓶外生根過程到此結束。本發明的有益效果1、利用本發明的上述方法，省略了培養室內無菌培養生根程序，無根甘蔗試管苗 在育苗盆和合適光溫水氣條件下即可生根，甘蔗試管苗生根培養操作和培養條件由繁變 簡，省略培養基配制、高壓滅菌、超凈工作臺無菌轉管和培養室恒溫恒濕培養等復雜的工作 環節；無根甘蔗試管苗瓶外移植生根，操作簡單，在自然環境下操作，對環境條件無復雜要 求，容易滿足。2、本發明在甘蔗試管苗瓶外生根育苗過程中，甘蔗試管苗直接單株或單穴移植， 省略了甘蔗試管苗從一級苗圃移植生根和培育步驟，省略了甘蔗試管苗從一級苗圃移植到 二級苗圃所需要的返青期從而縮短了移植周期，達到簡化生產程序和降低生產成本的目的3、利用本發明的方法進行甘蔗試管苗瓶外生根育苗圃管理，不僅簡化了培養程序 而且降低了生產成本，主要表現在(1)省略室內無菌生根培養和一級苗圃叢栽移植等二個生產環節，節約了培養室和育苗圃空間；(2)節約甘蔗試管苗無菌生根培養和一級苗圃 移植管理所需的勞動力、原料材料和能源投入；(3)簡化甘蔗試管苗生產程序，縮短生產周 期，節約了時間成本。本發明能解決目前甘蔗健康種苗生產生根環節工作繁雜和甘蔗試管 苗單株生產成本高的問題。4、本發明的甘蔗試管苗瓶外生根苗圃移植育苗方法，適用于甘蔗愈傷組織再生植 株、腋芽組培苗和甘蔗莖尖脫毒健康種苗無根苗的瓶外生根移植、育苗。5、本發明在總結植物試管苗瓶外生根技術研究成功經驗的基礎上，根據甘蔗試管 苗的植物學特征特性，設計甘蔗試管苗瓶外生根技術研究方案，研究影響甘蔗試管苗瓶外 生根主要因素，開發應用于生產實踐的甘蔗試管苗瓶外生根技術，簡化了試管苗生產程序， 大大降低了生產成本，提高了生產效率。
圖1是本發明甘蔗試管苗瓶外生根流程簡圖。從圖看到本發明甘蔗試管苗瓶外生根過程是首先在增殖培養基中加入赤霉素 (GA)培養14-16天，主要目的是促進甘蔗試管苗長高和甘蔗試管苗基部膨脹和節的發育； 然后甘蔗試管苗在溫室下開瓶蓋煉苗；煉完苗后，用自來水沖洗干凈甘蔗試管苗，并將叢生 試管苗分成單株或小叢；接著單株或小叢穴植于育苗盆，于育苗大棚拱小拱棚，小拱棚蓋塑 料薄膜保溫保濕，大拱棚蓋遮陽網，晴天光照強時，小拱棚同時蓋遮陽網；移植10 15天 后，揭小拱棚塑料薄膜，并開始淋稀釋液肥或葉面肥；移植25 30天后，揭大棚遮陽網，育 苗圃管理同常規甘蔗試管苗苗圃育苗管理，直至甘蔗試管苗移植大田。
具體實施例方式通過以下具體實施實例，可以進一步了解本發明，但以下實例不用來限定本發明 的范圍。實施例1本發明人是廣西科學基金“甘蔗試管苗瓶外生根技術研究”項目(桂科回 0991012)的主持人和國家支撐計劃課題“高產高效甘蔗良種繁育及栽培技術研究與示范” 課題(2007BAD30B04)協助主持人，本項目擬在總結試管苗瓶外生根技術研究的基礎上，根 據甘蔗試管苗的植物學特征特性，設計甘蔗試管苗試驗研究方案，開展影響甘蔗試管苗瓶 外生根因素及瓶外生根機理研究，研究培養基的激素種類及濃度水平與瓶外生根的關系。1、試驗材料試驗材料為新臺糖22號無根試管苗，由廣西甘蔗研究所生物室提供。2、試驗方法技術路線用MS+GA(赤霉素)+蔗糖30g/l液體培養基培養14-16天，然后在室溫 下煉苗3 4天，接著洗苗分單株和調查赤霉素對甘蔗試管苗生長的影響，穴植種植盆，每 處理60穴，分三個重復。瓶外生根環境條件溫度25°C以上，移植10天內，濕度保持在90 100%，光照500 10000LUX，移植10天后，調查存活率和生根情況，并揭塑料薄膜，在自然 濕度條件下生長培育。(1)赤霉素對甘蔗試管苗生長影響
試驗培養基為MS基本培養基+GA (赤霉素)+蔗糖30g/l，設4個處理，對照為常規 增殖基MS基本培養基+6-BA+蔗糖30g/l (見表1)。每個處理20瓶，培養14-16天后轉移 到室溫煉苗3 4天，接著調查赤霉素對甘蔗試管苗生長的影響。表1試驗處理設計 (2)赤霉素處理對甘蔗試管苗生根的影響經不同赤霉素濃度處理培養的甘蔗試管苗洗凈后，移植種植盆，每處理60穴，每 個重復20穴，重復三次。移植12天后，調查每個重復的存活株數量，并從每個處理隨機抽 取10穴調查平均根長和平均每株苗的根數量。3、結果分析(1)赤霉素對甘蔗試管苗生長影響表2赤霉素處理對甘蔗試管苗生長的影響 試驗結果表明(見表2)，赤霉素培養對甘蔗試管苗伸長和節的發育有明顯的促進 作用，尤其是添加赤霉素4mg/l的處理對株高和節的生長有明顯的作用，個別節間長度達 到1 4cm，其次是添加赤霉素3mg/l和2mg/l兩個處理；與對照相比，添加赤霉素lmg/1處 理的株高高于對照，差異顯著達到水平，但基部節的數量與對照沒有顯著差異。(2)赤霉素處理對甘蔗試管苗生根的影響表3赤霉素處理對甘蔗試管苗存活率的影響 與對照相比，赤霉素處理存活率均為對照的2倍以上(見表3)，差異達到顯著 差異水平，其中三處理(lmg/l，2mg/l和3mg/l)的存活率均達到83%以上，因此赤霉素處理 對甘蔗試管苗移植存活率影響十分顯著，能顯著促進甘蔗試管苗生根和提高存活率，其中 以處理濃度1 3mg/l為最好。表4赤霉素處理對甘蔗試管苗根生長的影響 赤霉素處理對甘蔗試管苗生根數量和根的長度都有影響(見表4)，但與對照相 比，三個處理lmg/l，2mg/l和3mg/l每株根數量多于對照，但沒有達到顯著差異水平； 赤霉素處理的平均根長都比對照的長1. 2cm以上，但也沒有達到顯著差異水平，這說明 赤霉素處理對甘蔗試管根的數量和根的伸長沒有明顯的影響。4、結論與討論(1)經文獻檢索，甘蔗試管苗瓶外生根技術國內外還未有研究成功報道。本文試驗 結果表明，甘蔗試管苗瓶外生根是可行的，且可以獲得較高存活率，如在培養階段用赤霉素 處理R0C22試管苗，其存活率達到80 90%，赤霉素處理濃度以1 3mg/l為最好，可以獲 得較高的存活率，且促進R0C22試管苗根的生長和提高生根率。(2)甘蔗是無性繁殖作物，種莖節部是芽和根原基著生的地方，赤霉素處理促進了 甘蔗試管苗伸長和基部節間的發育，同時促進了甘蔗試管苗腋芽的生長和根原基的發育， 甘蔗試管苗根原基的形成和伸長是甘蔗試管苗瓶外生根成功的關鍵前提條件，本試驗結果 表明，R0C22無根試管苗適經當濃度赤霉素處理，試管苗植株高度、存活率、節數量、根長和根的數量都會增加。趙玉芬等[5]也認為植物離體根的形成分為兩個階段，即形成根原基和 根原基的伸長及生長，這是試管苗瓶外生根的理論依據。 (3)甘蔗試管瓶外生根技術的成功開發省略了培養室內無菌培養生根程序和室外 的一級苗圃育苗等二個環節，無根甘蔗試管苗在育苗盆和合適光溫水氣條件下即可生根， 實現生根與訓化移植一步完成。甘蔗試管苗生根培養操作和培養條件由繁變簡，省略培養 基配制、高壓滅菌、超凈工作臺無菌轉管和培養室恒溫恒濕培養等復雜的工作環節；無根甘 蔗試管苗瓶外移植生根，操作簡單，在自然環境下操作，對環境條件無復雜要求，容易滿足。
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權利要求
甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其特征在于生產程序如下(1)無菌培養體系建立；(2)增殖擴繁；(3)無根試管苗單株或小叢穴植苗圃進行瓶外生根和育苗；(4)移栽大田。
2.根據權利要求1所述的甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其特征在于所述的無菌培養 體系建立包括兩種途徑，第一種途徑是將經滅菌處理和脫毒處理的甘蔗幼嫩心葉經誘導培 養和分化培養得到的甘蔗叢生芽培養體系；第二種途徑是將經滅菌處理和脫毒處理的甘蔗 腋芽或莖尖分化培養得到的甘蔗叢生芽培養體系。
3.根據權利要求1所述的甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其特征在于所述的增殖擴繁 是在增殖培養基中的甘蔗試管苗增殖培養基為MS+6-BAl-2mg/L+NAA0. lmg/L+蔗糖30g/ 1，在進行增殖培養的最后一個培養周期時，將增殖培養基中的6-BA和NAA替換為赤霉素 (GA)，即使用培養MS+GA1 3mg/L+蔗糖30g/l培養14-16天，然后普通室溫下煉苗3 5 天。
4.根據權利要求1所述的甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其特征在于所述的試管苗瓶 外生根和單株或小叢穴植于苗圃是在普通室溫下煉苗3 5天后，洗干凈甘蔗試管苗，并將 叢生試管苗分成單株或小叢穴植于育苗盆，于育苗大棚拱小拱棚，小拱棚蓋塑料薄膜保溫 保濕，育苗小拱棚內溫度25°C以上，濕度90 100%，大棚蓋遮陽網，移植時間25 30天。
5.根據權利要求1所述的甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其特征在于所述的移栽大田 是甘蔗苗育苗小拱棚移植25 30天后揭大棚遮陽網，按常規甘蔗試管苗苗圃育苗管理，澆 水、施肥、除草、剪葉，再移植大田。
全文摘要
本發明公開了一種甘蔗試管苗的瓶外生根方法，其生產程序如下(1)無菌培養體系建立；(2)增殖擴繁；(3)無根試管苗單株移植苗圃進行瓶外生根和育苗；(4)移栽大田。上述方法省略了培養室內無菌培養生根程序，甘蔗試管苗生根培養操作和培養條件由繁變簡，省略培養基配制、高壓滅菌、超凈工作臺無菌轉管和培養室恒溫恒濕培養等復雜的工作環節，無根甘蔗試管苗瓶外移植生根，操作簡單，在自然環境下操作，降低了甘蔗試管生產成本，提高了生產效率。
文檔編號A01H4/00GK101904262SQ20101022788
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者何為中, 余坤興, 劉麗敏, 劉紅堅, 盧曼曼, 李松, 汪淼, 淡明, 游建華, 翁夢苓, 陳引芝, 韋明珠 申請人:廣西壯族自治區甘蔗研究所