專利名稱：一種節水型海參養殖方法
技術領域：
本發明屬于海參類養殖技術領域，特別涉及一種提高海參成活率和免疫力，促 進海參快速生長、改善水質、節水節能、綠色低碳的海參無公害養殖新方法。
背景技術：
海參，學名仿刺參(Apostichopus japonicus)，具有很高的食用價值，名列“八
珍”之中。我國年消費干海參約達5000噸，供求缺口巨大。為此，我國在90年代掀起 了刺參養殖的熱潮。隨著海參養殖的逐年遞增，養殖密度過大，養殖容量超載以及養殖環境的惡 化，海參疾病也在頻繁爆發，常見的是養成期的腐皮病，腫嘴病等。目前，海參疾病的 預防和治療主要靠抗生素藥浴的方法來處理。長期使用抗生素，不僅使病原菌抗藥性增 加，疾病更頻繁發生，過量的抗生素和化學藥品的使用也造成海參體內的抗生素殘留超 標，影響海參的商品品質，對人的使用安全造成威脅。其它類化學類消毒劑的使用嚴重污染水質，破壞環境。中草藥雖然能夠具有無 藥物殘留、經濟效益高的優點，但見效慢，短期內解決不了流行性疾病。另一方面，目前海參的養殖模式需要大量的換水和頻繁的倒池，不僅浪費了人 力物力資源，污染水環境，而且大量的用水容易引起海岸帶海水入侵，導致土地鹽堿 化，給生態環境造成了危害。按照常用的方法對廢水進行處理，循環使用，則需要較高 的投資，增加了養殖成本。因而尋求一種更高效、更經濟的辦法來提高海參的成活率和免疫力，顯得極為 迫切。“綠色養殖”不但克服了抗生素濫用帶來的副作用，還能夠改善水質，增強苗 種免疫力，提高海參的成活率和質量，促進海參生長，成為近年來國家的重大需求。目 前，用蛭弧菌游泳體來進行海參養殖的方式在國內外尚未見報道。已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業還是在(海洋) 水產養殖等領域，蛭弧菌的應用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell(1978) 研究發現，蛭弧菌及對動物及人的細胞不具侵染性[Lenz R.W.，Hespell R.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology, 1978, 119(3) 245-248]。在國內，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細胞的作用，發現它對 魚類細菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌BDH2102對魚 類細胞及病原菌的作用。微生物學通報，2006，33(1) 7-11]。
發明內容
為克服上述現有養殖技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種節水型的 海參養殖方法；該方法通過在飼料和水體中添加蛭弧菌游泳體菌液實現，具體包括養殖 水源選擇，池水的處理，飼料的處理，換水周期的控制，其特征按照養殖生態學原理， 海洋生物的生長環境要求，生物之間的相互關系及無公害養殖標準，人工創造養殖環境，減少投入成本，改善水質，提高海參免疫力，促進海參快速生長，提高經濟效益。本發明的目的通過下述方案實現一種節水型的海參養殖方法，包括以下操作 步驟(1)取海域無污染的海水作為養殖用水；養殖用水經砂濾、沉淀后，注入養殖 池；養殖池中放置經過消毒的波紋板(用于海參的附著生長)；(2)在養殖池中加入蛭弧菌游泳體菌液，并加大曝氣，攪拌均勻，使池水中的蛭 弧菌游泳體的濃度達10 107pfu/mL ；(3)向養殖池中投放海參苗；(4)養殖期間正常曝氣，控制水溫在15 30°C，池水的鹽度保持在23%。
30%。，日投餌量為海參體重的質量百分數的3 5%，餌料在投入前，用濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡15 30min ；每隔5 40天換掉池水(全池)一 次，每次換(全池)水后加入蛭弧菌游泳體菌液，使池水中的蛭弧菌游泳體菌液濃度達到 10 107pfu/mL。步驟(1)所述養殖池在注入養殖用水之前清洗消毒干凈；所述養殖池中3m2 4m2布置1個散氣石(用于充氣)。步驟⑵和(4)所述加入蛭弧菌游泳體菌液的方法為用養殖池中的池水稀釋菌 液后，均勻潑灑全池。步驟(2)所述加大曝氣的曝氣量為90 100L/h/m3 ；步驟(4)所述正常曝氣的 曝氣量為70 80L/h/m3。步驟(3)所述投放海參苗在水溫15 30°C時按照以下標準海參苗規格為400 頭/kg時，投放密度為600頭/m2;海參苗規格為200頭/kg時，投放密度為400尾/m2; 海參苗規格為100頭/kg時，投放密度為300尾/m2。步驟(4)所述餌料為配合餌料，每天投餌兩次；每隔5 7天采用虹吸法進行養 殖池底的吸污。步驟⑵和⑷所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.Strain) BDMOl，所述蛭弧菌 于2008年4月28日保藏于湖北省武漢市珞珈山武漢大學內的中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCC NO M 208066。BDMOl由蛭弧菌BDJOl (保藏編號為CCTCC M 208011)進行紫外誘變得到，對其進行負染后于電子顯微鏡下形態觀察蛭弧菌BDMOl 呈單細胞，弧形，大小為1.7X1.0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為3.5μιη;將其以雙層平板 法于28°C培養三天可形成直徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。所述蛭弧菌蛭質體菌液按照以下方法制備得到接種0.5mL濃度為107cfo/mL嗜 水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.172) 于營養肉湯液體培養基中，26 30°C培養20h，培養液經5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀用ImL生理鹽水懸浮后，加入至DNB液體培養基中，再接入ImL含 103pfu/mL蛭弧菌BDMOl的菌液，于28 °C培養36 48h，培養液在4°C下經6000 8000rpm離心15 20min后，將含蛭弧菌游泳體的上清經16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0.2mol/L pH值為7.2 7.6的磷酸 鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO9CfuAnL的蛭弧菌游泳體菌液。所述DNB液體培養基是將營養肉湯0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物O.lg溶于IOOOml蒸餾水中，調節pH值至7.2 7.6。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果發展無公害養殖，提高海參的免疫力，促進海參的快速生長，降低生產成本， 提高經濟效益，是我國海水養殖業發展的必由之路；蛭弧菌能改善海參胃腸道環境，提 高免疫力，促進海參生長，且對海參類無毒性作用，對人類無致病性。蛭弧菌的生活史可分為脫離宿主細菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體狀態和在 宿主細菌內生長發育的蛭質體狀態。蛭弧菌游泳體侵入宿主時，在宿主細胞壁上產生一 個孔隙，當蛭弧菌侵入到宿主的周質空間后孔隙重新封閉。游泳體失去鞭毛，和宿主細 胞一起被稱為“蛭質體”。接下來，宿主周質空間水解，蛭弧菌細胞變長，并分裂成多 個短節段，長出鞭毛，通過釋放溶解性酶從宿主細胞中脫離出來，重新形成游泳體。游泳體蛭弧菌侵入宿主細菌的過程非常快，一般幾秒鐘內即可完成。相對于蛭 弧菌蛭質體而言，雖然存在著制備繁瑣、不易保存的弱點，但用游泳體蛭弧菌控制和消 除致病或潛在致病菌起效快、活力強。用游泳體蛭弧菌浸泡飼料，并在池水中潑灑一定 濃度的游泳體蛭弧菌菌液，既能促進海參的生長，提高免疫力，又能控制致病菌，凈化 水質，且最長可40天換(全池)水一次，從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和大量養 殖廢水排放污染環境，節省人力物力，為人類提供安全、綠色、無公害的水產品，提高 養殖戶的收入。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于 此。本發明的具體實施地點為山東某海參養殖場，海參種類為仿刺參(Apostichopus japonicus)。實施時間為4個月。試驗地海域的水源水質符合中華人民共和國國家標準 漁業水質標準(GBl 1607-89)要求，海水經過砂濾、沉淀處理后進入養殖池，符合農業 部《無公害食品海水養殖用水水質》(NY5052-2001)要求。海參的養殖池建在養殖大棚 內，挑選體質健康、個體大小均勻的幼參，平均體長3 5cm，采用隨機區組試驗設計， 按照60 80頭/m2的養殖密度投入池中。平均分為A-D 4個試驗組，B、C、D每個 試驗組有 8 個小組，分別為 Bi、Cl、Dl; B2、C2、D2 ；、B3、C3、D3 ； B4、C4、 D4 ； B5、C5、D5 ； B6、C6、D6 ； B7、C7、D7 ； B8、C8、B8 ； B1-D8 每小組再分為 4組，即Bl-I Β1-4··· 8-1 D8-4，每組2個重復。試驗的處理如下A組正常流水，投喂配合飼料飼料(工廠生產的養殖方式)B組在水中潑灑蛭弧菌游泳體菌液，使水體中蛭弧菌游泳體濃度分別達到 10、ΙΟ3、105、107pfo/mL，投喂配合飼料；C組投喂濃度為10、ΙΟ3、105、107pfo/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡后的配合 飼料；D組在水中加入蛭弧菌游泳體菌液，使菌體濃度分別達到10、ΙΟ3、105、 107pfu/mL,同時分別投喂濃度為10、ΙΟ3、105、107pfu/mL的蛭弧菌游泳體菌液浸泡后 的配合飼料； Bi、Cl、Dl組每5天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B2、C2、D2組每10天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B3、C3、D3組每15天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B4、C4、D4組每20天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B5、C5、D5組每25天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B6、C6、D6組每30天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B7、C7、D7組每35天換(全池)水--次，換水后I■新加菌
B8、C8、D8組每40天換(全池)水-一次，換水后I■新加菌Bl-U Cl-U Dl-I'"DS-I 投放的菌液濃度為 10pfo/mL ；B 1-2、C1-2、01-2夂08-2投放的菌液濃度為10^\1/11^;Bl-3、C1-3、01-3夂08_3投放的菌液濃度為1(^份/11^;Bl-4、C1-4、Dl-4... D8-4 投放的菌液濃度為 107pfu/mL ；所用飼料符合中華人民共和國農業行業標準《無公害食品漁用配合飼料安全限 量》(NY5072-2002)的規定。試驗期間，每日投喂2次，早上、晚上各一次。試驗結 束測量海參的生長指標、免疫指標及微生物情況。1、海參生長指標的測定方法如下喂養4個月后，統計最終每口池子所存活的海參數目，分別從每口池子各隨機 抽取100頭海參，用游標卡尺測量其體長(mm)，電子天平測其重量(g)，計算以下參 數(1)成活率(% ) = Nt/N。X 100% ；(2)增重率(％ ) = (WrW0) W0X 100% ；(3)體長增長率(% ) = (LrL0)/L0X 100% ；式中N。為試驗開始時海參總頭數；Nt為試驗結束時海參總頭數；W。為試驗開 始時海參體重；Wt為試驗結束時海參體重；L。為試驗開始時海參體長；Lt為試驗結束時 海參體長；2、海參的免疫指標的測定堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用Krazel(1982)磷酸苯二鈉 法，從海參的腹面口后1/3穿刺抽取血液，置于離心管中，于4°C，3000r/min離心 IOmin,取上清，即為海參的血清。置于冰盒中保存。酸性磷酸酶(ACP)的測定采用磷酸苯二鈉法。以每IOOmL血清在37°C與底物 磷酸苯二鈉作用60min，產生Img酚者定義為一個酶活力單位。堿性磷酸酶(AKP)的測定采用磷酸苯二鈉法。以每IOOmL血清在37°C與底物 磷酸苯二鈉作用15min，產生Img酚者定義為一個酶活力單位。3、水質的測定氨態氮用次溴酸納氧化法測定(GB12763.4-91)；亞硝酸鹽氮用重氮-偶氮光度法測定(GB12763.4-91)4、弧菌總數的測定用TCBS培養基檢測弧菌總數具體步驟為用磷酸緩沖鹽(PBS)對所取水樣進行10稀釋，至10_4。取原液和各濃度的稀釋液(10—1、10_2、10_3、10_4)0.5mL，涂布于TCBS固體培養基上，菌落計 數，計算水體中的弧菌總數。海參的生長指標、免疫活性指標及水質情況的測定結果見表一 表四從表中 可以看出，A組成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP) 最高分別達到 82.14 %、830.56 274.65 0.031U/mL、0.034U/mL，弧菌總數為 6.78X IO2CFUAnL ；與工業生產的A組相比，C、D、E組的成活率、增重率、體長增 長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)活性都有明顯的升高，而弧菌總數明顯降 低。說明在常規的養殖方式下，不換水會影響海參的成活率、增重率、體長增長率、酸 性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活力。在相同的換水周期下，隨著蛭弧菌游泳體 的濃度升高，成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力在逐漸的升 高，弧菌總數明顯降低；說明蛭弧菌游泳體的濃度越高，海參的免疫力越強，成活率越 高，患病機率越小。Bl-I Β8-1··· 1_4 D8-4之間的成活率、增重率、體長增長率、 酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、弧菌總數幾乎無明顯差異，說明在水中或者是 在飼料中添加濃度為10 107pfo/mL蛭弧菌游泳體菌液，5-40天換(全池)水一次，對 海參的育苗成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、弧 菌總數影響不大，均可達到提高成活率和免疫力，促進生長的目的。經過測定，A組水池中的各項水質測定值均高于試驗組B、C、D組的。其中， A組氨態氮的檢測結果為0.279mg/L，高于B組的0.124 0.211mg/L、C組的0.129 0.234mg/L、D組的0.096 0.199mg/L ； A組的亞硝酸鹽氮的檢測結果為0.077mg/L，高 于 B 組的 0.025 0.057mg/L、C 組的 0.030 0.061mg/L、D 組的 0.018 0.035mg/L。 由以上結果分析可知，應用濃度為10-107pfU/mL蛭弧菌游泳體菌液可有效改善養殖水體 環境，調節水中氨態氮、亞硝酸鹽氮的含量，從而提供有利于海參生存的水體環境，并 且在水體和飼料中同時添加，效果最佳。由此可見，無論在水中還是在飼料中添加濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌游泳 體菌液，40天換(全池)水一次，都能夠達到提高海參的免疫力和成活率，促進生長，且 可控制水中弧菌數量，改善水質。在水中和飼料中同時添加，效果更佳。即能夠節約地 下水資源，保護環境，又能夠節省成本，提高經濟效益，促進養殖業的快速發展。表一海參的生長指標、免疫指標及弧菌總數的測定
權利要求
1.一種節水型的海參養殖方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)取海域無污染的深海水作為養殖用水；養殖用水經砂濾、沉淀和消毒后，注入 養殖池；養殖池中放置經過消毒的波紋板；(2)在養殖池中加入蛭弧菌游泳體菌液，并加大曝氣，攪拌均勻，使池水中的蛭弧菌 游泳體的濃度達10 l(fpfu/mL ；(3)向養殖池中投放海參苗；(4)養殖期間正常曝氣，控制水溫在15 30°C，池水的鹽度保持在23%。 30%。，日 投餌量為海參體重的質量百分數的3 5%，，餌料在投入前，用濃度為10 l(fpfu/mL 的蛭弧菌游泳體菌液浸泡15 30min ；每隔5 40天換掉池水一次，每次換水后加入蛭 弧菌游泳體菌液，使池水中的蛭弧菌游泳體濃度達到10 107pfu/mL。
2.根據權利要求1所述的一種節水型的海參養殖方法，其特征在于步驟(1)所述養 殖池在注入養殖用水之前清洗消毒干凈；所述養殖池中3m2 4m2布置1個散氣石。
3.根據權利要求1所述的一種節水型的海參養殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷ 所述加入蛭弧菌游泳體菌液的方法為用養殖池中的池水稀釋菌液后，均勻潑灑全池。
4.根據權利要求1所述的一種節能型海參養殖方法，其特征在于步驟( 所述加大 曝氣的曝氣量為90 100L/h/m3 ；步驟(4)所述正常曝氣的曝氣量為70 80L/h/m3。
5.根據權利要求1所述的一種節水型的海參養殖方法，其特征在于步驟C3)所述 投放海參苗在水溫15 30°C時按照以下標準海參苗規格為400頭/kg時，投放密度為 600頭/m2 ；海參苗規格為200頭/kg時，投放密度為400尾/m2 ；海參苗規格為100頭 /kg時，投放密度為300尾/m2。
6.根據權利要求1所述的一種節水型的海參養殖方法，其特征在于步驟(4)所述餌 料為配合飼料，每天投餌兩次；每隔5 7天采用虹吸法進行養殖池底的吸污。
7.根據權利要求1所述的一種節水型的海參養殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷ 所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDMOl，所述蛭弧菌于2008年4月觀日保藏于中 國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO : M208066。
8.根據權利要求1所述的一種節水型的海參養殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷ 所述所述蛭弧菌蛭質體菌液按照以下方法制備得到接種0.5mL濃度為IO7CfuAnL嗜水 氣單胞菌(Aeromonashydrophila)于營養肉湯液體培養基中，^ 30°C培養20h，培養液 經5000 8000rpm離心10 20min后，沉淀用ImL生理鹽水懸浮后，加入至DNB液 體培養基中，再接入蛭弧菌BDM01，于培養36 48h，培養液在4°C下經6000 8000rpm離心15 20min后，將含蛭弧菌游泳體的上清經16000 18000rpm離心15 20η ι后，沉淀用DNB液體培養基、水、生理鹽水或0.2mol/LpH值為7.2 7.6的磷酸 鹽緩沖液懸浮，得到濃度為IO9CfuAnL的蛭弧菌游泳體菌液。
9.根據權利要求8所述的一種節水型的海參育苗方法，其特征在于所述DNB液體 培養基是將營養肉湯0.相、酪蛋白酸水解物0. 和酵母精提物O.lg溶于IOOOrnl蒸餾水 中，調節pH值至7.2 7.6。
全文摘要
本發明公開了一種節水型的海參養殖方法。該方法包括養殖水源選擇，池水的處理，飼料的處理，換水周期的控制，按照養殖水體生態學原理，海洋生物的生長環境要求，生物之間的相互關系及無公害養殖標準，采用生物生態學的方法控制養殖環境。關鍵技術是在水體中添加蛭弧菌游泳體菌液，同時飼料也用蛭弧菌游泳體菌液浸泡，養殖期間可達到40天換掉池水一次。本發明為生物養殖方法，綠色、安全、無污染，效果顯著，能夠改善水質，促進海參攝食，提高免疫力，促進生長，并提高成活率，有極好的發展前景。對提高經濟效益和食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義。
文檔編號A01K61/00GK102017908SQ201010271009
公開日2011年4月20日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者何偉杰, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學