專利名稱：一種葛根的快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬于植物克隆技術領域，更具體涉及一種葛根的快速繁殖方法，此方法適 用于葛根的脫毒快繁育苗，也可被借鑒到其他同類植物的快繁育苗。
背景技術：
野葛(/^eraria A^aia)為豆科葛屬，多年生藤本植物。葛根是藥食兩用植物，其 根、莖、葉、花都可入藥，現代醫學表明葛根中的有效成分為異黃酮類(isoflavones)物質， 其中葛根素(puerarin)含量最高。這些異黃酮類化合物具有治療急性心肌梗塞、不穩定性 心絞痛、高粘血癥、急性腦梗塞、頸椎病等疾病，對東莨菪堿和乙醇引起的記憶障礙具有對 抗作用；其食用部分主要是塊根，人們提取其淀粉加工成葛粉絲、葛糕、葛飲料、葛凍、葛酒、 葛餅干等系列產品。同時葛根的莖葉又是良好的動物飼料，而且由于葛根頑強的適應性和 生命力，又是世界各國極為重視的水土保持植物，被譽為“大地良醫“。所以葛根的種植業 近幾年發展得很快，但葛根的種子很難得到且發芽率又不高，而傳統的扦插繁殖又使得病 毒積累嚴重，病毒病已成為粉葛種性退化、產量下降、品質變劣的重要原因。因此近幾年，葛 根的組織培養技術得到迅速發展，主要集中在利用葛根的莖、葉來誘導形成愈傷組織，前人 研究表明以葛根的根、莖、葉、子葉為外植體，都可以產生愈傷組織，且每種組織愈傷組織生 長周期不一樣，分化率也不一樣，普遍認為莖桿的誘導分化率不高且容易褐化，部分學者認 為葛根的成熟葉片為誘導愈傷組織的最適宜外植體。另外，前人還研究了不同激素以及不 同激素組合對葛根各部分誘導分化的影響，結果發現誘導及芽分化率都極低。由于幼莖分 生組織代謝活性很高，不易受微生物的侵染，且莖尖分生組織帶有葉原基，較易誘導愈傷組 織的形成，因此，部分學者采用莖尖脫毒技術，研究了莖尖分生組織誘導愈傷組織，并且對 組織培養的最適培養基進行了研究。他們剝去莖尖外面的芽鱗和幼葉，切取大小0.4 - 0.6 mm帶有葉原基的分生組織為外植體，通過誘導、繼代、分化和生根培養，得到了生有少量側 根的組培苗，同時他們也對不同濃度的激素組合的影響作了研究，得到了最佳的激素組合 濃度，但對此，不同學者之間的研究結果差別很大，而且利用此種方法，需要100多天才能 得到生有側根的小苗，在生產上應用很受限制。除此之外，部分學者還嘗試借鑒蘭花的組培 經驗，利用帶有幼芽的莖段為外植體，來進行葛根無菌廟的擴繁試驗，但葛根的幼芽分化率 不是很高，因而此方法也受到限制。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種葛根的快速繁殖方法，方法易行，操作簡便，不受 季節限制，從獲取外植體到成苗所需時間短，大大縮短了葛根無菌苗的組培周期，減少了實 驗成本，采用了特定外源激素的萌動和分化誘導大大提高了分化誘導率，且幼苗的素質高， 成活率高，效率可到90%左右，可滿足生產和實驗的需求。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施 一種葛根的快速繁殖方法，其步驟是A、以葛根的整個幼芽(帶有鱗片和分化幼葉的莖節)為外植體；
B、用網紗將葛根幼芽包起放在自來水下沖洗1-2小時，用70%(體積比，以下相同)的 酒精滅菌8-12秒，無菌水沖洗2-4次，再用10% (體積比，以下相同)雙氧水滅菌10-14分 鐘，無菌水沖洗4-6次；
C、用消毒鑷子接種到MS+0. 4-0. 5mg/L2, 4_D的培養基上萌動4_5天后轉接到 "MS+0. 1-0. 2mg/L 6-BA+0. 05-0. lmg/L NAA”分化培養基上培養，在萌動后可見幼葉欲出， 接到分化培養基上4-5天后，就有幼葉抽出，莖節拉長，這時用消毒剪刀按莖節剪斷接入上 述分化培養基上進行擴繁；
D、9-11天后轉接一次進行繼代培養，依然用分化培養基，在觀-32天就可以得到無 根的無菌擴繁苗；
E、轉接到1/2MS+0. 1-0. 2mg/LNAA的生根培養基上，9_11天就可看到不定根生出， 18-22天后不定根能長到2-3厘米長，上部葉片有4或5片時就可揭開瓶蓋在溫室中煉苗 了 ；
F、煉苗2-3天后可取出幼苗，洗去培養基，栽入土中。注1) M S培養基為植物組培培養基，是Murashige和Skoog于1962年為煙草細 胞培養設計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含 量高，其養分的數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養和生理需要，因而適用范圍比較 廣，多數植物組織培養快速繁殖用它作為培養基的基本培養基。方法中的各培養基是自己 配制的新鮮培養基。2) mg/L為濃度單位，是毫克每升，即每升培養基中含有此激素的量。3)實驗中用到的萘乙酸(NAA)，6芐基腺嘌呤(6_BA)和2，4_ 二氯苯氧醋酸 (2，4-D)為植物組培中常用外源激素，從試劑公司購買到。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
1. 采用葛根的整個幼芽(帶有鱗片和分化幼葉的莖節)為外植體，不用經過愈傷組織 的誘導以及由愈傷再分化出幼芽的步驟，而是由幼芽外植體直接形成無菌擴繁苗，這樣大 大縮短了葛根無菌苗的組培周期，減少了實驗成本。2.幼芽在 MS+0. 4-0. 5mg/L2, 4-D 的培養基上萌動 4-5 天后轉接 MS+0. 1-0. 2mg/ L6-BA+0. 05-0. lmg/LNAA的分化培養基上培養，大大提高分化誘導率，效率可到90%左右。3. 幼芽接到分化培養基上4-5天后，就有幼葉抽出，莖節拉長，這時用消毒剪刀 按莖節剪斷接入分化培養基上進行擴繁；10天后轉接一次進行繼代培養，但依然用分化培 養基，在一個月左右就可以得到無根的無菌擴繁苗；因此幼苗的素質高，成活率高。
具體實施例方式實施例1:
一種葛根的快速繁殖方法，其步驟是
1、以葛根的整個幼芽(帶有鱗片和分化幼葉的莖節)為外植體；
2、用網紗將葛根幼芽包起放在自來水下沖洗1或2小時，用70%(體積比)的酒精滅 菌10秒，無菌水沖洗4次，再用10% (體積比)雙氧水滅菌10分鐘，無菌水沖洗5次；
3、用消毒鑷子接種到MS+0. 4-0. 5mg/L2, 4-D的培養基上萌動4或5天后轉接到"MS+0. 1-0. 2mg/L6-BA+0. 05-0. lmg/LNAA”分化培養基上培養，在萌動后可見幼葉欲出，接 到分化培養基上4或5天后，就有幼葉抽出，莖節拉長，這時用消毒剪刀按莖節剪斷接入分 化培養基上進行擴繁；
4、10天后轉接一次進行繼代培養，依然用分化培養基，在30天就可以得到無根的無 菌擴繁苗；
5、轉接到1/2MS+0.1-0. 2mg/LNAA的生根培養基上，9或10或11天就可看到不定根 生出，20天后不定根能長到2-3厘米長，上部葉片有4，5片時就可揭開瓶蓋在溫室中煉苗 了 ；
6、煉苗2-3天后可取出幼苗，洗去培養基，栽入土中。
權利要求
1. 一種葛根的快速繁殖方法，其步驟是A、以葛根的整個幼芽為外植體；B、用網紗將葛根幼芽包起放在自來水下沖洗1-2小時，用70%體積比的酒精滅菌8-12 秒，無菌水沖洗2-4次，再用10%體積比雙氧水滅菌10-14分鐘，無菌水沖洗4-6次；C、用消毒鑷子接種到MS+0.4-0. 5mg/L2, 4_D的培養基上萌動4_5天后轉接到 MS+0. 1-0. 2mg/L6-BA+0. 05-0. lmg/LNAA分化培養基上培養，在萌動后見幼葉欲出，接到分 化培養基上4-5天后，有幼葉抽出，莖節拉長，用消毒剪刀按莖節剪斷接入分化培養基上進 行擴繁；D、9-ll天后轉接一次進行繼代培養，用分化培養基，在觀-32天得到無根的無菌擴繁苗；E、轉接到1/2MS+0.1-0. 2mg/LNAA的生根培養基上，9_11天看到不定根生出，18-22天 后不定根能長到2-3厘米長，上部葉片有4，5片時就揭開瓶蓋在溫室中煉苗了 ；煉苗2-3天 后取出幼苗，洗去培養基，栽入土中。
全文摘要
本發明公開了一種葛根的快速繁殖方法，以葛根的整個幼芽為外植體，其步驟是A、用網紗將葛根幼芽包起放在自來水下沖洗，再用酒精滅菌，無菌水沖洗，再用雙氧水滅菌，無菌水沖洗；B、用消毒鑷子接種到配制好的培養基上萌動后轉接到配制好的分化培養基上培養，見有幼葉抽出，莖節拉長，剪斷接入上述配制好的分化培養基上進行擴繁；C、用分化培養基進行轉接繼代培養，得到無根的無菌擴繁苗；D、轉接到配制好的生根培養基上，上部葉片有4-5片時就揭開瓶蓋在溫室中煉苗了；E、煉苗后取出幼苗，洗去培養基，栽入土中。方法易行，操作簡便，縮短了葛根無菌苗的組培周期，減少了成本，提高了分化誘導率，幼苗的素質高，成活率高。效率可到90%。
文檔編號A01H4/00GK102144555SQ201110029788
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月27日 優先權日2011年1月27日
發明者李長福, 章焰生 申請人:中國科學院武漢植物園