專利名稱：一種新型生根方法在大豆轉基因技術中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及農桿菌介導的轉基因大豆再生苗生根方法，屬于大豆組織培養及轉基因研究技術領域。
背景技術：
利用外源基因進行作物遺傳改良已成為植物育種的重要手段之一。目前，外源基因的導入方法多采用農桿菌介導法和基因槍轟擊法，特別是農桿菌介導法以其方法簡單、 效率高、拷貝數少等優點已成為單、雙子葉植物轉基因育種的首選方法[Horsh R B]。大豆是公認的難轉化的植物，利用農桿菌介導的子葉節轉化系統和胚尖轉化系統在大豆遺傳轉化研究中廣泛應用，但是這兩個系統獲得的抗性芽存在生根困難的問題，經生根和煉苗兩個階段后移栽成活率非常低，分別為20%和10%左右，嚴重制約了大豆遺傳轉化的研究和發展。在農桿菌介導的大豆遺傳轉化體系中，需要用抗生素抑制農桿菌的生長，但是抗生素在抑制農桿菌的同時也不可避免地對大豆外植體的生長產生了嚴重影響，導致叢生芽生長緩慢及再生苗生根困難。在子葉節轉化系統和胚尖轉化系統中為了提高再生苗的生根率一般采用逐漸降低抗生素濃度或去除抗生素的方法，但是往往造成轉化植株生根率低和農桿菌再次生長污染轉化植株的問題，難以從根本上解決抗生素等抑菌劑對轉植株生根的影響。本研究利用農桿菌介導法進行大豆子葉節和胚尖轉化系統的摸索，首次采用了一種新型生根培養方式，即使用雙層生根培養基，上層含有抗生素，而下層不含抗生素，這樣既能保證抑制農桿菌的生長，又能大大降低抗生素對轉基因再生植株的不利影響，經農桿菌侵染后的植株移栽成活率分別達90. 70%和88. 10%。該方法的應用對提高農桿菌介導的大豆遺傳轉化效率具有重要意義，在其他植物的轉化中也有很好的借鑒作用。
發明內容
本發明的目的在于建立一套應用雙層培養培養方式提高轉基因大豆生根效率的方法。其特征為在子葉節轉化系統和胚尖轉化系統中，在生根階段采用上層附加抑菌劑， 下層不加抑菌劑的培養基，獲得了 90. 70%和88. 10%的轉化苗再生率。本發明主要技術方案如下1)農桿菌介導大豆子葉節轉化系統挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時，然后接種到萌發培養基中4-6天，切取子葉節外植體，用含有目的基因的農桿菌侵染子葉節，共培養3-5天，將外植體接種到分化篩選培養基中進行不定芽誘導，不定芽長到2. 0-3. Ocm時切下接種到雙層生根培養基中進行生根；2)農桿菌介導大豆胚尖轉化系統挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時，無菌水浸泡過夜，切取胚尖，去除真葉，用含有目的基因的農桿菌侵染胚尖，共培養3-5天，將外植體用含有抑菌劑的無菌水沖洗后接種到分化篩選培養基上，不定芽長到2. 0-3. Ocm時切下接種到雙層生根培養基中進行生根；3)雙層生根培養基下層的制備首先配制1/2MS+0. 4g/L MES+30g/L蔗糖+植物凝膠2g/L+pH 5. 8培養基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA，將培養基分裝于IOOmL三角瓶中，每瓶50mL左右，室溫冷卻使其凝固，下層制作完成；4)雙層生根培養基上層的制備首先配制1/2MS+0. 4g/L MES+蔗糖30g/L+植物凝膠2g/L+pH 5. 8培養基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA+200mg/L頭孢霉素+100mg/L 羧芐青霉素，緩慢倒入3所制備的下層培養基上，使其形成2-3mm薄層，室溫冷卻，上層制作完成；5)不定芽的生根培養切取1和2中長到2. 0-3. Ocm的不定芽，對距離底部0.5cm 以下表皮進行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養基中，劃傷部位全部進入下層培養基；6)煉苗移栽15天左右對長出根的小苗進行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養基，移栽到裝有蛭石的培養缽里，用hoagland營養液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。本發明的優點和效果如下大豆是公認的難轉化的植物，利用農桿菌介導的子葉節轉化系統和胚尖轉化系統在大豆遺傳轉化研究中廣泛應用，但是這兩個系統獲得的抗性芽存在生根困難的問題，以常用的農桿菌介導的子葉節轉化系統和胚尖轉化系統為例，前者的生根率一般在20%左右，而后者則只有10%左右。針對大豆轉化植株生根困難、移栽成活率低這個限制因素， 近年來有人采用嫁接法獲得了較高的成活率，但該方法要求同時培養適齡實生苗以及操作要求技術性強，這無疑增加了大豆遺傳轉化的工作量，而且難以普及應用。而本項發明，應用雙層培養的方法，將不同來源的轉化不定芽接種到雙層生根培養基中，獲得了較高的植株生根率，成功克服了大豆遺傳轉化中抗性芽不易生根的難題。應用雙層生根培養基的優勢非常明顯首先，提高了轉化植株的成活率。應用雙層培養基進行生根的不定芽，生根率一般在90%左右，且根系發達須根多，不老化，移栽成活率接近100%，這與子葉節系統低于20%胚尖系統低于10%的成活率相比有大幅度的提高；其次，采用本方法獲得的生根植株，移栽后恢復生長迅速，不用經過黑暗避光期，所以縮短了轉化植株的生長周期，且簡化了管理過程，降低了轉化成本。總之，應用雙層培養基進行生根的技術，方法簡單易行，克服了農桿菌轉化法中轉化植株生根困難的技術難題，大大提高了農桿菌介導的大豆遺傳轉化植株生根率，為進一步提高大豆遺傳轉化效率提供了的技術支持。另外，本方法對農桿菌介導的其他植物的遺傳轉化也有很高的借鑒作用。
具體實施例方式實施例一利用子葉節轉化的不定芽采用雙層培養基生根法獲得再生植株1-應用材料1)植物材料大豆品種為冀豆16，由河北省農科院糧油作物所購買；2)菌株和質粒農桿菌菌株為EHA105 (市場購買)，載體為pCAMBIA3301 (市場購買)，篩選標記基因為bar基因；
2-不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時；2)無菌大豆種子接種到萌發培養基中B5+30g/L蔗糖+7. Og/L瓊脂+0. 4g/L MES, pH5.8，23°C，光照培養5天；3)子葉節外植體的獲得待子葉變綠時用手術刀將其子葉分開，去除真葉，保留 0. 5cm左右的下胚軸，然后順著脈絡方向輕劃5-7刀，約3-4mm長，0. 5mm深；4)農桿菌培養從農桿菌EHA105平板中挑取單菌落接種到50mL YEB培養基中， 培養24-30h,待菌液0D600值達0. 8-1. 0時，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；幻制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養基重懸，1/10B5+3. 9g/ L MES+0.25mg/LGA3+l. 67mg/L 6_BAP+20g/L 蔗糖 +400mg/L Lysteine+154. 2mg/L DTT+200 μ mol/L 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；6)侵染及共培養取切好的子葉節放入侵染液中，黑暗侵染30分鐘，然后接種到固體共培養基中黑暗培養5-7天；7)誘導芽分化共培養結束后將子葉節接種到分化培養基中，B5+30g/L蔗糖 +7. Og/L 瓊脂 +0. 4g/L MES+1. 67mg/L 6-BAP+O. 2mg/L IBA, pH 5. 8，23°C，光照培養 14 天， 在此期間切除早期分化的不定芽；8)不定芽的篩選將子葉節轉接到篩選培養基上進行篩選，B5+30g/L蔗糖 +7. Og/L 瓊月旨 +0. 4g/L MES+0. 5mg/L GA3+1. Omg/L ZT+0. lmg/L IAA+50mg/L Asn+50mg/ LGln+400mg/L Cef+lOOmg/L Cb+0. 6mg/L Basta, pH 5. 8，每兩周繼代一次；9)生根當不定芽長至2_3cm即可切下接種到雙層生根培養基中進行生根；3-不定芽生根及其生根苗移栽1)切下2-3cm的健壯不定芽，對距離底部0. 5cm以下表皮進行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養基中，劃傷部位全部進入下層培養基；2)煉苗移栽對培養15天左右長出根的小苗進行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養基，移栽到裝有蛭石的培養缽里，用hoagland營養液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至土壤中。4-結果1)共選取43個不定芽進行生根，有39株生長出發達根系，移栽后成活39株，生根率達到90. 70%，移栽成活率達到100% ；2)雙層培養基生根技術明顯提高了不定芽的生根率及移栽成活率，克服了子葉節系統生根難的問題；3)應用本技術可以明顯縮短轉化周期，移栽后不用經過避光培養，移栽苗恢復生長迅速，長勢旺盛；4)提取轉化材料TO代以及TI代幼嫩葉片DNA進行PCR擴增，初步證明外源基因已整合到大豆基因組中。實施例二 利用胚尖轉化的不定芽采用雙層培養基生根法獲得再生植株I-應用材料1)植物材料大豆品種為五星2號，由河北省農科院糧油作物所購買；
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2)菌株和質粒農桿菌菌株為GV3101 (市場購買)，載體為pCAMBIA1300 (市場購買)，篩選標記基因為hpt基因；2-不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時；2)外植體的獲得取滅菌后的大豆種子用無菌水浸泡過夜，去掉子葉，將真葉去除干凈，收集胚尖，接種到預培養基中，MS+30g/L蔗糖+0. 4g/L MES+3. 5mg/L 6-BAP+7.0% 瓊脂，23°C光照，預培養30h;3)農桿菌培養從農桿菌GV3101平板中挑取單菌落接種到50mL YEB培養基中， 培養24-30h,待菌液0D600值達0. 8-1. 0時，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；4)制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養基重懸，l/2MS+20g/L蔗糖+0. Sg/ LMES+6mg/L 6-BAP+200 μ mol 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；5)外植體侵染及共培養將預培養后變綠的胚尖放進侵染液中，黑暗培養15小時，然后轉入固體共培養基中，黑暗條件下培養3-5天；6)恢復培養將共培養后的胚尖用含有抗生素的無菌水清洗后接種到恢復培養基中，MS+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/L Cb+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES，pH 5. 8，培養 5-7 天；7)芽伸長轉入到篩選培養基:MS+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/LCb+6mg/L hyg+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES, pH 5. 8，每 10-15 天繼代一次；8)當不定芽長到2-3cm時，進行生根；3-不定芽生根及其生根苗移栽1)切下2-3cm的健壯不定芽，對距離底部0. 5cm以下表皮進行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養基中，劃傷部位全部進入下層培養基；2)煉苗移栽對培養15天左右長出根的小苗進行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養基，移栽到裝有蛭石的培養缽里，用hoagland營養液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。4-結果1)共選取42個不定芽進行生根，有37株生長出發達根系，移栽后成活36株，生根率達到88. 10%，移栽成活率達到97. 30% ；2)雙層培養基生根技術明顯提高了不定芽的生根率及移栽成活率，克服了胚尖轉化系統生根難的問題；3)應用本技術可以明顯縮短轉化周期，移栽后不用經過避光培養，移栽苗恢復生長迅速，長勢旺盛；4)提取轉化材料TO代以及TI代幼嫩葉片DNA進行PCR擴增，初步證明外源基因
已整合到大豆基因組中。
權利要求
1.一種新型生根方法在大豆轉基因技術中的應用，其特征是主要步驟如下1)農桿菌介導大豆子葉節轉化系統挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時，然后接種到萌發培養基中4-6天，切取子葉節外植體，用含有目的基因的農桿菌侵染子葉節，共培養3-5天，將外植體接種到分化篩選培養基中進行不定芽誘導，不定芽長到2. 0-3. Ocm時切下接種到雙層生根培養基中進行生根；2)農桿菌介導大豆胚尖轉化系統挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時，無菌水浸泡過夜，切取胚尖，去除真葉，用含有目的基因的農桿菌侵染胚尖， 共培養3-5天，將外植體用含有抑菌劑的無菌水沖洗后接種到分化篩選培養基上，不定芽長到2. 0-3. Ocm時切下接種到雙層生根培養基中進行生根；3)雙層生根培養基下層的制備首先配制l/2MS+0.4g/LMES+30g/L蔗糖+植物凝膠 2g/L+pH 5. 8培養基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA，將培養基分裝于IOOmL三角瓶中， 每瓶50mL左右，室溫冷卻使其凝固，下層制作完成；4)雙層生根培養基上層的制備首先配制1/2MS+0.4g/L MES+蔗糖30g/L+植物凝膠 2g/L+pH 5. 8培養基，高溫高壓滅菌后附加0. 5mg/L IBA+200mg/L頭孢霉素+100mg/L羧芐青霉素，緩慢倒入3所制備的下層培養基上，使其形成2-3mm薄層，室溫冷卻，上層制作完成；5)不定芽的生根培養切取1和2中長到2.0-3. Ocm的不定芽，對距離底部0. 5cm以下表皮進行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養基中，劃傷部位全部進入下層培養基；6)煉苗移栽15天左右對長出根的小苗進行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養基， 移栽到裝有蛭石的培養缽里，用hoagland營養液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。
2.按權利要求1所述的一種新型生根方法在大豆轉基因技術中的應用，其特征是利用子葉節轉化的不定芽采用雙層培養基生根法獲得再生植株，具體步驟如下應用材料1)植物材料大豆品種為冀豆16，由河北省農科院糧油作物所購買；2)菌株和質粒農桿菌菌株為EHA105(市場購買)，載體為pCAMBIA3301 (市場購買)， 篩選標記基因為bar基因；不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時；2)無菌大豆種子接種到萌發培養基中B5+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂+0.4g/LMES, pH5.8，23°C，光照培養5天；3)子葉節外植體的獲得待子葉變綠時用手術刀將其子葉分開，去除真葉，保留0.5cm 左右的下胚軸，然后順著脈絡方向輕劃5-7刀，約3-4mm長，0. 5mm深；4)農桿菌培養從農桿菌EHA105平板中挑取單菌落接種到50mLYEB培養基中，培養 24-30h,待菌液0D600值達0. 8-1. 0時，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；5)制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養基重懸，l/10B5+3.9g/LMES+0. 25mg/ LGA3+1. 67mg/L 6_BAP+20g/L蔗糖+400mg/L Lysteine+154. 2mg/L DTT+200 μ mol/L 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；6)侵染及共培養取切好的子葉節放入侵染液中，黑暗侵染30分鐘，然后接種到固體共培養基中黑暗培養5-7天；.7)誘導芽分化共培養結束后將子葉節接種到分化培養基中，B5+30g/L蔗糖+7.Og/L 瓊脂+0. 4g/L MES+1. 67mg/L6-BAP+0. 2mg/L IBA, pH 5. 8，23°C，光照培養 14 天，在此期間切除早期分化的不定芽；.8)不定芽的篩選將子葉節轉接到篩選培養基上進行篩選，B5+30g/L蔗糖+7.Og/L瓊脂 +0. 4g/L MES+0. 5mg/L GA3+1. Omg/L ZT+0. lmg/L IAA+50mg/L Asn+50mg/LGln+400mg/L Cef+lOOmg/L Cb+0. 6mg/L Basta, pH 5. 8，每兩周繼代一次；.9)生根當不定芽長至2-3cm即可切下接種到雙層生根培養基中進行生根；不定芽生根及其生根苗移栽.1)切下2-3cm的健壯不定芽，對距離底部0.5cm以下表皮進行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養基中，劃傷部位全部進入下層培養基；.2)煉苗移栽對培養15天左右長出根的小苗進行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養基，移栽到裝有蛭石的培養缽里，用hoagland營養液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至土壤中。
3.按權利要求1所述的一種新型培養方法在大豆轉基因技術中的應用，其特征是利用胚尖轉化的不定芽采用雙層培養基生根法獲得再生植株，具體步驟如下應用材料1)植物材料大豆品種為五星2號，由河北省農科院糧油作物所購買；2)菌株和質粒農桿菌菌株為GV3101(市場購買)，載體為pCAMBIA1300 (市場購買)， 篩選標記基因為hpt基因；不定芽的獲得1)種子消毒挑取表面光滑無裂痕的大豆種子進行氯氣熏蒸滅菌16-20小時；2)外植體的獲得取滅菌后的大豆種子用無菌水浸泡過夜，去掉子葉，將真葉去除干凈，收集胚尖，接種到預培養基中，MS+30g/L蔗糖+0. 4g/L MES+3. 5mg/L 6-BAP+7. 0%瓊脂， 23 °C光照，預培養30h;3)農桿菌培養從農桿菌GV3101平板中挑取單菌落接種到50mLYEB培養基中，培養 24-30h,待菌液0D600值達0. 8-1. 0時，3000rpm離心，IOmin,收集菌體，待用；4)制備侵染液將收集到的菌體用液體共培養基重懸，l/2MS+20g/L蔗糖+0.Sg/ LMES+6mg/L 6-BAP+200 μ mol 乙酰丁香酮，pH 5. 4 ；5)外植體侵染及共培養將預培養后變綠的胚尖放進侵染液中，黑暗培養15小時，然后轉入固體共培養基中，黑暗條件下培養3-5天；6)恢復培養將共培養后的胚尖用含有抗生素的無菌水清洗后接種到恢復培養基中， MS+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/L Cb+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES, pH 5. 8，培養 5-7 天；7)芽伸長轉入到篩選培養基MS+0.2mg/L IBA+0. 2mg/L BA+400mg/L Cef+100mg/ LCb+6mg/L hyg+30g/L 蔗糖 +7g/L 瓊脂 +0. 4g/L MES, pH 5. 8，每 10-15 天繼代一次；8)當不定芽長到2-3cm時，進行生根；不定芽生根及其生根苗移栽1)切下2-3cm的健壯不定芽，對距離底部0. 5cm以下表皮進行劃傷，將處理后不定芽接入分層生根培養基中，劃傷部位全部進入下層培養基；2)煉苗移栽對培養15天左右長出根的小苗進行移栽，將生根苗用鑷子取出，洗凈培養基，移栽到裝有蛭石的培養缽里，用hoagland營養液澆灌，保持濕度70%以上，一周后可移栽至壤土中。
全文摘要
本發明涉及農桿菌介導的轉基因大豆再生苗生根方法，屬于大豆組織培養及轉基因研究技術領域。利用農桿菌介導法進行大豆子葉節和胚尖遺傳轉化的研究，首次采用了一種新型轉化植株生根方法，即使用雙層生根培養基，上層含有抗生素，而下層不含抗生素，這樣既能抑制農桿菌的生長，又能大大降低抗生素對轉基因再生植株的不利影響，經農桿菌侵染后的植株移栽成活率分別達90.70％和88.10％。該方法的應用對提高農桿菌介導的大豆遺傳轉化效率具有重要意義，在其他植物的遺傳轉化中也有很好的借鑒作用。
文檔編號A01H4/00GK102174562SQ20111002994
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者張潔, 王冬梅, 鄭文永 申請人:河北農業大學