專利名稱：一種中山杉品種302的組織培養繁殖方法
技術領域：
本發明具體涉及一種中山杉品種302 (Taxodium hybrids ‘Zhongshansha302，)的組織培養的繁殖方法，屬于木本植物種苗繁殖的技術領域。
背景技術：
ψ Lij ^ (Taxodium hybrids iZhongshansha' ),(Taxodiaceae), I^Mt^M (Taxodium)種間雜交優良無性系的總稱，由落羽杉(T. distichum)、池杉(T. ascendens)、 墨西哥落羽杉(T. mucronatum)三個樹種種間雜交培育而成。半常綠高大喬木，主干突出， 樹冠圓錐形或傘狀卵形，緊湊豐滿。樹葉密集，羽狀復葉，條形，長0. 6 1. O厘米，螺旋狀散生在小枝上，不成二列。雌雄異花，同株。雌球花著生在新枝頂部，單個或2 3個簇生，成熟時呈球形，長3. 5 5. Omm。雄球花著生在小枝上，成熟時呈橢圓形，長3. O 5. Omm。花期 4月下旬，球果熟期10月。中山杉一年四季的枝葉顏色比較豐富，呈現綠——紅(枝)—— 黃——紅(葉)的顏色變化趨勢。中山杉無性系品種較為豐富，主要有一代品種中山杉302 ；二代品種中山杉118、 149和146 ；三代品種“雜交墨杉”中山杉502。中山杉為速生樹種，耐水濕、耐鹽堿、抗風性強，病蟲害少，生長速度快，為優良的鹽堿地綠化樹種。其中一代品種中山杉302，由南京中科院植物研究所陳永輝等用落羽杉早和墨西哥落羽杉 雜交，獲得雜種優良無性系中山杉302，該植物品種于2002年通過國家林業局林木品種審定委員會審定，成為全國首批通過國家審定的16個林木良種之一，并且已經作為本領域的常規技術術語以及常規的試驗材料在本領域廣泛應用。然而，有關中山杉及落羽杉屬植物，尤其涉及中山杉302的快速繁殖研究，國內外報道較少。目前研究主要集中在扦插繁殖上，而扦插繁殖受母本材料來源的限制很大。母本材料具有大量插穗，是扦插快繁生產的前提條件，這對于雜交選育的木本植物新品種來說，顯然是不現實的。因此，通過組織培養繁殖是解決中山杉新優無性系擴繁的首選途徑。落羽杉屬及相近屬樹種的組織培養繁殖研究非常少。許秀玉等以墨西哥落羽杉的幼苗為起始外植體，研究其離體培養及再生體系的建立，得出了誘導培養基、伸長培養基和生根培養基(墨西哥落羽杉離體培養及再生體系的建立，林業科學，2007年第43卷第10期，40-44頁)，但是該方法成活率低，僅僅為20%左右。樓文阜等以東方杉大樹基部當年生的幼嫩萌枝為外植體，進行了組織培養技術研究，得出了芽增殖、芽伸長和生根培養基，及煉苗方法，然而由于東方杉和中山杉培養繁殖等方面存在較大的差異，發明人將其應用與中山杉并不合適，其增殖率很低，不能滿足需求(東方杉的組織培養繁殖技術研究，上海農業學報，2007年第23卷第2期，17-23頁)。 陸小青等選用中山杉302的枝條扦插定向栽培技術來育苗，并未研究中山杉的組織培養繁殖方法(中山杉302、401優良無性系定向栽培技術，林業實用技術，2006年第6期)。發明專利CN101347099A公開了一種落羽杉的離體快速增殖方法，但是該方法選用成熟種子并且通過復雜工藝取得成熟胚，取材方式復雜，培養過程繁瑣，并且僅僅適用于落羽杉種系的增殖，而不能通過簡單地改動照搬用于中山杉種系。
目前關于中山杉的組織培養快繁研究在國內外尚屬空白，本發明提供了一種中山杉302組織培養的繁殖方法，其操作簡單快捷，大大提高了增殖率和增殖速度，從而能夠解決了中山杉302在城市園林綠化、水源涵養、水土保持、綠色景觀通道、生態建設等方面需求。
發明內容
本發明解決的技術問題是為了提高中山杉302組織培養的增殖率和增殖速度。為了達到上述目的，本發明提供了一種中山杉品種302組織培養的繁殖方法，包括如下步驟(1)外植體的選取與消毒選取當年生頂稍作為外植體，采樣時間為當枝條由綠完全轉紅后第15天至第35天，自來水沖洗干凈后，進行消毒；(2)改良 WPM 培養基的制備用 Ca (NO3) 2. 4H20 684mg/L 和 KNO3 380mg/L 代替原WPM培養基中的K2SO4和CaCl2. 2H20,其他組分均無變化，大量元素含有NH4NO3 400mg/L、MgSO4. 7H20 370mg/L、Ca (NO3) 2. 4H20 556mg/L 和 KH2PO4 170mg/L,微量元素含有 H3BO3 6. 2mg/L、MnSO4. H2O 16. 9mg/L、ZnSO4. 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4. 2H20 0. 25mg/L 和 CuSO4. 5H200. 025mg/L，有機成分含有肌醇100mg/L、煙酸0. 5mg/L、鹽酸吡哆辛0. 5mg/L、鹽酸噻胺 1. Omg/L 和甘氨酸 2. 0，鐵鹽為 Na2. EDTA 37. 3mg/L 和 FeSO4. 7H20 27. 8mg/L。(3)不定芽的誘導取步驟(1)中處理得到的外植體，切割為0.5-1. Ocm長的莖段，將莖段接種于誘導培養基中進行不定芽的誘導，培養溫度為2016°C，首先在黑暗中培養20- 小時，然后進行正常培養20-25天；所述正常培養條件為光照時間為10-16小時 /天，光照強度為1600-2000LX ；所述誘導培養基為改良WPM培養基并添加激素玉米素、IBA 和GA3 ；所述誘導培養基中玉米素濃度為0. 5mg/L, IBA濃度為0. 2mg/L, GA3濃度為1. Omg/ L；(4)繼代增殖將步驟(3)中得到的不定芽分化出的枝條接入繼代增殖培養基中，進行繼代培養25-35天，培養溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度為 1600-2000LX ；所述繼代增殖培養基為改良WPM培養基并添加激素玉米素和IBA ；所述繼代增殖培養基中玉米素濃度為0. 3mg/L, IBA濃度為0. 2mg/L ；(5)根的誘導將步驟中所得中山杉302無根試管苗進行切割后，接入生根培養基中進行生根培養15-20天，培養溫度為20-26°C，光照時間為10-16小時/天，光照強度為1600-2000LX ；所述生根培養基為1/2MS培養基并添加激素IBA ；所述生根培養基中IBA 濃度為3. Omg/L ；(6)無菌苗的煉苗將步驟(4)所得中山杉302帶根無菌苗的培養瓶瓶蓋打開，露天培養2-3天，然后移入采用多菌靈(稀釋濃度2g/L)消毒的基質中，組培苗上方使用帶孔 PVC膜覆蓋保濕，煉苗容器采用50孔穴盤，放在通風陰涼處培養25-30d，培養到第15天將 PVC膜移除，換用折光率75%的遮陽網；所述基質成分為體積比1 1的泥炭土與珍珠巖。上述誘導培養基、繼代增殖培養基、生根培養基中均含有瓊脂6. 0-7. Og/L(優選 6. 5g/L)、蔗糖 25-35g/L (優選 30g/L)，且 pH 值為 5. 8-6. 2。步驟(1)中外植體的選取與消毒的具體過程為選取當年生莖段作為外植體，用清水沖洗干凈，用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再用自來水漂洗3-5次，然后用“安利(Amway) ”洗液震蕩漂洗30分鐘，接著用自來水流水沖洗30分鐘，84消毒液(稀釋 50倍)搖床上振蕩消毒10分鐘。流水沖洗20-30分鐘后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50-60秒，立即倒入0. 的升汞消毒12分鐘，最后用無菌水洗滌4次，每次振蕩3-5分鐘；步驟C3)中最佳的正常培養時間為20天；步驟(4)中最佳繼代增殖培養時間為30 天；步驟(5)中最佳生根培養時間為15天；步驟(6)中最佳馴苗時間為30天。本發明中山杉302組織培養的繁殖方法具有以下優點1、選取外植體時間木本植物外植體本身的生理狀況、休眠深度與植株再生是密切相關的。在最佳取樣時間之前采樣，外植體培養時玻璃化現象嚴重，不利于不定芽的誘導，而在最佳取樣時間之后采樣，外植體污染率顯著增加，不利于建立無菌系。發明人通過反復試驗驗證選取當年生頂稍作為外植體，采樣時間為當枝條由綠完全轉紅后第15天至第35天，其玻璃化現象較輕，且誘導率最高。2、WPM 改良在原WPM培養基上培養時，外植體不定芽不易分化出枝梢，外植體上只爆芽而不伸長，而在MS培養基上，不定芽分化為葉芽，發育成羽狀復葉，對繼代增值沒有作用。將WPM 培養基改良后，改變了 NPK比例，用Ca (NO3) 2. 4H20 684mg/L和KNO3 380mg/L代替原WPM培養基中的K2SO4和CaCl2. 2H20,能夠顯著促進不定芽的分化及生長。3誘導之前先經過一段時間的暗培養，使外植體迅速分裂，然后光誘導培養，其萌發率能達到最好效果，另外，本申請發明人經過大量反復操作試驗得到了對中山杉302品種的最佳誘導、增殖培養基及其激素水平，即誘導培養基為改良WPM+玉米素0. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+GA3l. Omg/L ；增殖培養基為改良WPM+玉米素0. 3mg/L+IBA 0. 2mg/L ；使用其培養基及特定激素水平能夠使外植體的萌發率、誘導率達到最高水平。4、采用本發明的中山杉302培養繁殖方法，最終增殖率為102-110倍；其中采用繼代增殖培養基，增殖倍數為10倍；采用誘導培養基，不定芽誘導率為80%，平均誘導可伸長的側枝數為3. 4 ；采用生根培養基，生根率為80% _90%，平均生根數為3. 3條；煉苗成活率達到90%。
具體實施例方式外植體取樣時間篩選實施例以中山杉302枝條由綠色開始變為紅色為起始時間(完全變紅需要約7天時間)， 開始每隔7天取樣一次，至枝條完全變為紅色后第49天止(即第9次取樣)。將外植體消毒后接與誘導培養基，觀察誘導情況，統計誘導率及污染率。試驗觀察發現，前3次取樣，即枝條開始變紅至完全變紅后第7天，由于外植體材料幼嫩，在莖段腋芽隱芽處長出愈傷，并且呈玻璃化，因此誘導率非常低。隨著枝條的發育， 在第4至7次，外植體誘導情況良好，在培養基上生長正常，無玻璃化愈傷，誘導率也比較高。在枝條變紅后的第觀天開始，由于枝條老化，攜帶病菌增多，開始出現污染。在前期 (即第6、7次取樣)污染率低，影響較小。但在枝條變紅后的第42天開始，污染率無法控制，不適宜再取外植體。(參見表1)
因此，中山杉302的外植體選材時間為當枝條由綠完全轉紅后第15天至第35天， 枝條顏色變化比較容易觀察，可作為區分枝條發育情況、選取外植體的參照時間點。表1外植體取樣時間的篩選
權利要求
1.一種中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體的選取與消毒選取當年生頂稍作為外植體，采樣時間為當枝條由綠完全轉紅后第15天至第35天，自來水沖洗干凈后，進行消毒；(2)改良WPM培養基的制備用Ca(NO3) 2. 4H20 684mg/L和KN03380mg/L代替原WPM培養基中的 K2SO4 和 CaCl2. 2H20 ；(3)不定芽的誘導取步驟(1)中處理得到的外植體，切割為0.5-1.Ocm長的莖段，接種于誘導培養基中進行不定芽的誘導，培養溫度為20j6°C，首先在黑暗中培養20-26小時，然后進行正常培養20-25天；所述正常培養條件為光照時間為10-16小時/天，光照強度為 1600-20001x ；(4)繼代增殖將步驟(3)中得到的不定芽分化出的枝條接入繼代增殖培養基，進行繼代培養25-35天，培養溫度為20- °C，光照時間為10-16小時/天，光照強度為 1600-20001x ；(5)根的誘導將步驟中所得中山杉無根試管苗進行切割后，接入生根培養基中進行生根培養15-20天，培養溫度為20-^TC，光照時間為10-16小時/天，光照強度為 1600-2000Lx ；(6)無菌苗的馴化煉苗將步驟(4)所得中山杉帶根無菌苗的培養瓶瓶蓋打開，露天培養2-3天，然后移入采用多菌靈(稀釋濃度2g/L)消毒的基質中，組培苗上方使用帶孔PVC 膜覆蓋保濕，馴化容器采用50孔穴盤，放在通風陰涼處培養25-30天，培養到第15天將PVC 膜移除，換用折光率75%的遮陽網；所述基質成分為體積比1 1的泥炭土與珍珠巖；上述誘導培養基、繼代增殖培養基、生根培養基中均含有瓊脂6. 0-7. Og/L、蔗糖 25-35g/L，且 pH 值為 5. 8-6. 2。
2.根據權利要求1所述中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于步驟(3)中所述誘導培養基為改良WPM培養基并添加激素玉米素、IBA和GA3 ；所述誘導培養基中玉米素濃度為 0. 5mg/L, IBA 濃度為 0. 2mg/L, GA3 濃度為 1. Omg/L。
3.根據權利要求1所述中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于步驟中所述繼代增殖培養基為改良WPM培養基并添加激素玉米素和IBA ；所述繼代增殖培養基中玉米素濃度為0. 3mg/L, IBA濃度為0. 2mg/L0
4.根據權利要求1所述中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于步驟(5)中所述生根培養基為1/2MS培養基并添加激素IBA ；所述生根培養基中IBA濃度為3. Omg/L。
5.根據權利要求1所述中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于所述步驟(3)中的正常培養時間為20天；所述步驟(4)中的繼代增殖培養時間為30天；所述步驟( 中的生根培養時間為15天；所述步驟(6)中的馴化時間為30天。
6.根據權利要求1至5任一所述中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于所述步驟(1)中進行消毒過程為用清水沖洗干凈，用毛刷蘸少許洗衣粉將其表面刷洗干凈，再用自來水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震蕩漂洗30分鐘，接著用自來水流水沖洗30分鐘，稀釋50倍的84消毒液搖床上振蕩消毒10分鐘，流水沖洗20-30分鐘后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50-60秒，立即倒入0. 1 %的升汞消毒12分鐘，最后用無菌水洗滌4次， 每次振蕩3-5分鐘。
7.根據權利要求1至5任一所述中山杉302組織培養的繁殖方法，其特征在于所述誘導培養基、繼代增殖培養基、生根培養基中均含有瓊脂6. 5g/L、蔗糖30g/L，且pH值為6. 0。
全文摘要
本發明公開了一種中山杉品種302的組織培養的繁殖方法，該方法包括以下步驟(1)選取外植體并進行消毒；(2)將原WPM培養基進行改良；(3)將處理后的外植體切割后，進行莖段初代誘導培養；(4)將步驟(3)中所得新梢進行繼代增殖培養；(5)將步驟(4)中所得無根試管苗進行生根誘導培養；(6)對步驟(5)中得到的無菌苗進行馴化煉苗培養。采用該繁殖方法對中山杉302進行育苗，增殖率為102-110倍，且育苗時間短。
文檔編號A01G31/00GK102283126SQ20111020045
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月18日 優先權日2011年7月18日
發明者李乃偉, 李云龍, 王傳永, 陸小清, 陳永輝 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所