專利名稱：一種產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物領域，具體涉及一種產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是我國農業部允許作為飼料添加劑的芽孢桿菌之一，其已被越來越多地研制成飼用微生物制劑。枯草芽孢桿菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產生抗菌素，在動物腸道內具有較強生物奪氧能力，能夠在厭氧條件下產生L-乳酸。這些特性對促進動物營養的消化吸收、提高動物的飼料轉化率和防病促進生長起到重要作用。因此在飼料中添加能夠產L-乳酸的枯草芽孢桿菌是一個十分綠色健康的選擇。目前制備枯草芽孢桿菌微生物制劑一般采用敞開式麩皮固態的傳統發酵工藝，采用自然風，自然溫度、濕度，其制備的枯草芽孢桿菌微生物制劑中，雜菌率高，活菌數波動大。
發明內容
本發明的目的是提供一種雜菌率低、活菌數高的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法。本發明的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將活化的、80%以上菌體形成芽孢的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)轉入無菌水中，形成種子培養液，其濃度為5. 0X108Cfu/ml 2.0 X 109cfu/ml ；(2)將種子培養液以3% 5%的接種量轉接到含有一級發酵培養基的發酵罐中，發酵溫度37 士 1 °C，攪拌速率200 350rpm，通氣量0. 8 0. 9V/V -min,溶氧濃度85 90%，發酵時間為8 16個小時，制成一級種子液；(3)將一級種子液以2 10%的接種量轉接到含有二級發酵培養基的發酵罐中進行二級發酵，發酵溫度37士 1°C，攪拌速率150 250rpm，通氣量0. 8 0. 9V/V · min，溶氧濃度85 90%，發酵時間12 30h，使枯草芽孢桿菌生長至對數生長期，制成二級種子液；(4)在無菌環境中，將二級種子液以3 5%的接種量接入麩皮固體培養基中，混合均勻，控制通風量為3 10換氣次數/小時，溫度30 40°C，濕度80% 90%條件下培養60 72小時，培養期間翻動麩皮固體培養基，由此制備得到產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑；所述的一級和二級發酵培養基都為每升含有MgSO4O. 4 1. Og^KH2PO4O. 5 3g、 K2HPO4O. 5 3g、NaC13 10g、蛋白胨5 20g、牛肉膏3 10g，余量為水，ρΗ7· 2士0. 3 ；所述的麩皮固體培養基為按總質量分數100%計，由麩皮48% 60%、硫酸銨0. 0. 5%、氯化銨0. 0. 5%和水39% 51%組成。所述的將活化的、80%以上形成芽孢的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)轉入無菌水中，優選是將枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基試管斜面，37°C培養 12 16小時，然后再接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基茄子瓶斜面，37°C培養至80%以上菌體形成芽孢時，再轉入無菌水中，一般在37°C培養M 30小時就可達到。所述的步驟中的培養期間翻動麩皮固體培養基優選每隔3 5小時翻動一次。經過本發明制備方法制備得到的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑經55 60°C干燥處理后，即可包裝，經成品檢測合格后，作為商品出售。本發明的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基屬于現有技術中的常規培養基，其配方為每升含有蛋白胨log、牛肉膏5g、NaCl 5g、瓊脂15g 20g，余量為水，ρΗ7· 2 7. 4。本發明的有益效果如下本發明優化了發酵培養基，將80%以上形成芽孢的菌體作為種子培養液接種到發酵培養基中，在合適的條件下進行一級和二級發酵，再以二級種子液接種到麩皮固體培養基中，控制其在合適條件下進行高密度的發酵，形成大量的芽孢，同時避免雜菌的影響。本發明有利的解決了現有技術中麩皮發酵過程中的雜菌過多、通風、散熱不均、溫度、濕度不恒定等問題，大大提高了枯草芽孢桿菌的活菌數，經檢測，按照本發明方法制備得到的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑，其每克微生物制劑含活菌數200 250億個活菌，芽孢率> 80%，雜菌率0. 5% 2%。本發明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是現有技術中經常使用的菌株，其在好多專利文獻和非專利文獻中公開了，如非專利文獻(許國煥，吳月嫦，付天璽等，微生物制劑對奧尼羅非魚生長及飼料表觀消化率的影響，中國飼料，2008. 21 26-28)，該菌株本申請人也持有，并保證自申請日起20年內向公眾提供。
圖1是實施例1中一級發酵中的枯草芽孢桿菌生長曲線圖；圖2是實施例1中二級發酵中的枯草芽孢桿菌生長曲線圖。
具體實施例方式以下是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1 從枯草芽孢桿菌的凍干種上挑取一環菌體接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂試管斜面培養基中，37°C培養16小時；再將試管斜面種子轉接到牛肉膏蛋白胨瓊脂茄子瓶斜面培養基中，37°C培養M小時，經檢測，其80%以上形成芽孢。用無菌水將茄子瓶上成熟菌泥刮洗下來，裝入250ml三角瓶，振蕩使菌體均勻，形成種子培養液，其濃度為1. 2 X 109CfU/ml。所述的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基的配方為每升含有蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、瓊脂 15g 20g，余量為水，ρΗ7· 2 7. 4，121°C高壓滅菌20min。將種子培養液以5%的接種量轉入裝有一級發酵培養基的30L種子罐中進行發酵培養，裝液量70 %，發酵溫度37 士 1 °C，攪拌速率200rpm，通氣量0. 8 0. 9V/V · min,溶氧濃度85 90%，自接種后每池取樣一次測600nm的吸光值，用未接種的培養基作為空白對照，制作枯草芽孢桿菌生長曲線圖(圖1)，由曲線可知枯草芽孢桿菌在8 Ia1菌數急劇增加，表明菌體已經到達對數生長期，取用發酵時間為8小時的菌液制成一級種子液；將一級種子液以10%的接種量，轉接入裝有二級發酵培養基的300L發酵罐中進一步擴大培養，裝液量70 %，發酵溫度37 士 1°C，攪拌速率250rpm，通氣量0. 8 0. 9V/V -min,溶氧濃度85 90%,自接種后每池取樣一次測600nm的吸光值，用未接種的培養基作為空白對照，制作枯草芽孢桿菌生長曲線圖(圖2)，由曲線可知枯草芽孢桿菌在12 2 菌數急劇增加，表明菌體已經達到對數生長期，因此取用該時期的菌液得到二級種子液，本實施例中選取的是發酵時間為16小時的菌液作為二級種子液。所述的一級和二級發酵培養基均為，每升含有 MgSO4 0. 5g，KH2PO4 lg, K2HPO4 lg, NaCl 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，余量為水，ρΗ7· 0，將上述物質溶于水中，再121°C高壓滅菌20min。接種前，先打開培養房的臭氧發生器以及紫外燈開關，培養房面積25m2，消毒 30min，制備無菌環境，在此無菌環境中將二級種子液以3%的接種量接種到麩皮固體培養基中，混合均勻，控制麩皮固體培養基中的通風量為10換氣次數/小時，溫度30 40°C， 濕度為80 90%的條件下培養60小時，培養期間每隔3小時翻動麩皮固體培養基料一次，由此而制得產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑。所述的麩皮固體培養基，每千克含有麩皮 500g，硫酸銨4g，氯化銨2g，水494g。其配置方法為將氯化銨和硫酸銨先用水溶再與其余固體原料混合，攪拌均勻。然后在旋轉蒸煮鍋或蒸飯機，壓力，溫度分別為1. 05 1. 3Kg/ cm3，121 125°C條件下，滅菌30 40min，冷卻至40 50°C分裝淺盆，每盆5公斤，備用。一、活菌數和雜菌率的檢測1、平板菌落計數法1. 1、稱取本實施例的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑IOg作為樣品，放入盛有 90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，搖床200rpm振蕩20min，靜置20 30S，制成樣品懸液。1. 2、用Iml無菌吸管吸取ImL樣品懸液，放入盛有9mL滅菌水的試管中，充分振搖使混合均勻，即制成1 100均勻稀釋液。1.3、用ImL無菌吸管吸取1 100稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌水試管內，振搖試管，混合均勻，做成1 1000的稀釋液。另取ImL滅菌吸管，按上述操作順序，
做10倍遞增稀釋液，分別制成10_4、10_5、10_6......10_9梯度稀釋液，如此每遞增稀釋一次，
即換用1支ImL滅菌吸管。1.4、選擇2-3個適宜稀釋度(一般取10-6、10-7、10_8)，用滅菌10(^1^微量移液器， 各取0. ImL接種于已制備好的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基平皿內，每個稀釋度做3個平板，用無菌推棒均勻涂于整個表面。1.5、將平皿倒置于37 °C 士 1°C恒溫培養箱內培養4 士池后，選取菌落數在 30-300之間的平板計數。2、枯草芽孢桿菌菌落形態形態特征菌體呈桿狀，菌落表面粗糙不透明，有褶皺，污白色或微黃色，菌落不規則圓形。3、菌落計數
3. 1、稀釋度的選擇3. 1. 1、應選擇平均菌落在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。3. 1.2、若有兩個稀釋度。其生長的菌落數均在30-300之間，則視兩者之間如何來決定若其比小于或等于2，應報告其平均數；若大于2，則報告其中較小的數字。3. 1. 3、若所有稀釋度的平均菌落數均大于300。則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。3. 1. 4、若所有稀釋度平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。3. 2、菌落計數及鑒別3. 2. 1、根據被檢產品的菌種的菌落特征與雜菌區分開來。必要時進行革蘭氏染色或芽孢染色，顯微鏡下觀察。有效枯草芽孢桿菌菌落以外的其他菌落為雜菌菌落數。3. 2. 2、應選擇平均菌落在30-300之間的稀釋度的平板，隨機挑取5個目標菌落按 《伯杰氏細菌系統鑒定手冊》第八版、《常見細菌系統鑒定手冊》進行生理生化鑒定。若結果符合表1特征表 權利要求
1.一種產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將活化的、80%以上菌體形成芽孢的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)轉入無菌水中，形成種子培養液，其濃度為5. 0X108Cfu/ml 2. 0X109cfu/ml ；(2)將種子培養液以3% 5%的接種量轉接到含有一級發酵培養基的發酵罐中，發酵溫度37 士 1°C，攪拌速率200 ;350rpm，通氣量0. 8 0. 9V/V ·π η，溶氧濃度85 90 %， 發酵時間為8 16個小時，制成一級種子液；(3)將一級種子液以2 10%的接種量轉接到含有二級發酵培養基的發酵罐中進行二級發酵，發酵溫度37士 1°C，攪拌速率150 250rpm，通氣量0. 8 0. 9V/V · min，溶氧濃度85 90%，發酵時間12 30h，使枯草芽孢桿菌生長至對數生長期，制成二級種子液；(4)在無菌環境中，將二級種子液以3 5%的接種量接入麩皮固體培養基中，混合均勻，控制通風量為3 10換氣次數/小時，溫度30 40°C，濕度80% 90%條件下培養 60 72小時，培養期間翻動麩皮固體培養基，由此制備得到產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑；所述的一級和二級發酵培養基都為每升含有MgSO4 0. 4 1. 0g、KH2PO4 0. 5 3g、 K2HPO4O. 5 3g、NaCl 3 10g、蛋白胨5 20g、牛肉膏3 10g，余量為水，ρΗ7· 2士0. 3 ；所述的麩皮固體培養基為按總質量分數100%計，由麩皮48% 60%、硫酸銨 0. 0. 5%、氯化銨0. 0. 5%和水39% 51%組成。
2.根據權利要求1所述的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法，其特征在于， 所述的將活化的、80%以上形成芽孢的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)轉入無菌水中是將枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基試管斜面，37°C培養12 16小時，然后再接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基茄子瓶斜面，37°C培養至80%以上菌體形成芽孢時，再轉入無菌水中。
3.根據權利要求1所述的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法，其特征在于， 所述的步驟中的培養期間翻動麩皮固體培養基是每隔3 5小時翻動一次。
全文摘要
本發明公開了一種產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑的制備方法。它是將種子培養液經過一級和二級發酵，再轉接到麩皮固體培養基中，在合適的條件下發酵，而制得的。本發明優化了發酵培養基，將80％以上形成芽孢的菌體作為種子培養液接種到發酵培養基中，在合適的條件下進行一級和二級發酵，再以二級種子液接種到麩皮固體培養基中，控制其在合適條件下進行高密度的發酵，形成大量的芽孢，同時避免雜菌的影響。本發明有利的解決了現有技術中麩皮發酵過程中的雜菌過多、通風、散熱不均、溫度、濕度不恒定等問題，大大提高了枯草芽孢桿菌的活菌數，經檢測，按照本發明方法制備得到的產乳酸枯草芽孢桿菌微生物制劑，其每克微生物制劑含活菌數200～250億個活菌，芽孢率＞80％，雜菌率0.5％～2％。
文檔編號A23K1/16GK102334606SQ201110207358
公開日2012年2月1日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者劉海龍, 吳月嫦, 張麗, 江永明, 王珺, 董小林, 許國煥, 郭慧青, 郭瑩姿, 陳亞劍 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東碧德生物科技有限公司