專利名稱：一種螃蟹體液的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種動物體液的提取方法，特別是一種螃蟹體液的提取方法。
背景技術：
貝類麻痹性毒素(簡稱PSP毒素)是由毒甲藻或產毒微生物產生，通過食物鏈蓄積于貝類或一些魚類以石房蛤毒素為基本骨架的一類衍生化合物。由于PSP毒素分布范圍廣，由麻痹性毒素導致的食物中毒發生頻率高，目前已經被列入貝類安全監控的常規檢測指標。有學者嘗試通過化學藥物或者免疫學方法尋找解毒藥物，遺憾的是，到目前為止， 尚未找到理想的解毒藥物。本發明的發明人所在課題組以火紅皺皮蟹、鈍齒短槳蟹和方形大額蟹等潮間蟹為研究材料對其進行了抗毒性研究，發現這些潮間蟹體液均有不同程度的抗毒效果，有較好的研究開發前景。目前對螃蟹體液的研究尚無任何報道，這在一定程度上阻礙了相關研究的進展。
發明內容
本發明的目的是提供一種螃蟹體液的提取方法，為螃蟹體液的開發利用提供成熟的提取方法和技術。本發明的技術方案一種螃蟹體液的提取方法，包含如下步驟(1)體液抽取用注射器針頭插入螃蟹活體內，抽取螃蟹活體內體液，得抽取液；(2)抗凝處理抽取完畢，立即將抽取液放入預先加有抗凝劑溶液的體液接收容器中，充分混合，得到混合液；(3)過濾除雜處理將混合液過濾、離心，得澄清液；(4)儲存液處理向澄清液中加入磷酸緩沖液， 混合均勻后，得到螃蟹體液儲存液并置于冷藏室保存，如果長時間不用可置于條件下保存備用。所述螃蟹活體是指從水體中捕獲、具有生命體征的螃蟹個體。所述抗凝劑溶液是以乙二胺四乙酸鹽或草酸鹽中的任何一種作為抗凝劑所配置而成的水溶液。所述抗凝劑溶液以乙二胺四乙酸鹽作為抗凝劑時，根據步驟(1)所得抽取液體積， 調整的乙二胺四乙酸鹽抗凝劑溶液添加量，使乙二胺四乙酸鹽在步驟(2)所得混合液中的濃度在4 mmol/L 20 mmol/L范圍。所述抗凝劑溶液以草酸鹽作為抗凝劑時，根據步驟(1)所得抽取液體積，調整草酸鹽抗凝劑溶液添加量，使草酸鹽在步驟(2)所得混合液中的濃度在2 mmol/L 10 mmol/L 范圍。所述過濾是指用濾紙、絹布和棉花中的任何一種過濾介質濾除步驟(2)所得混合液中的泡沫和雜質。所述離心是指在轉速4000 rpm/min 8000 rpm/min條件下，離心機離心2 min 10 min，使不溶物顆粒沉降后，去除沉淀物。
所述儲存液處理是指向每升澄清液中加入IOOml濃度為100 mmol/L 500 mmol/ L的磷酸緩沖液，使所得螃蟹體液存儲液中磷酸鹽濃度在10 mmol/L 50 mmol/L范圍。所述磷酸緩沖液是指用相等濃度的磷酸二氫鹽溶液和磷酸鹽溶液互相混合，調整磷酸二氫鹽溶液和磷酸鹽溶液的添加量，使其混合后的PH值在5. 5 7. 5范圍后，得到的磷酸緩沖液。所述乙二胺四乙酸鹽為乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀中的一種；所述草
酸鹽為草酸鈉、草酸鉀中的一種。所述螃蟹體液儲存液的保存條件為暫存于0°C 4°C冷藏室或在一 80°C _20°C 下長期保存。本發明相對于現有技術的有益效果是本發明的螃蟹體液提取方法操作簡單、不需昂貴設備，采用本發明方法提取所得到的螃蟹體液蛋白質含量高、雜質少。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍。實施例一
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以乙二胺四乙酸二鈉作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的 20 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的1體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時乙二胺四乙酸二鈉抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為10 mmol/L ；
3、過濾除雜處理用濾紙作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速4000 rpm/min條件下離心5 min，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為100mmol/L，pH為6. 5的磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為10 mmol/L，混合均勻后暫存于0°C冷藏室冷藏。實施例二
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以乙二胺四乙酸二鉀作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的 20 mmol/L乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的4體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為4 mmol/L ；
3、過濾除雜處理用絹布作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速6000 rpm/min條件下離心2 min，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、螃蟹體液儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為300mmol/L, pH為5. 5 的磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為30 mmol/L，混合均勻后暫存于4°C冷藏室冷藏。實施例三1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以乙二胺四乙酸二鈉作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的 40 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的1體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時乙二胺四乙酸二鈉抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為20 mmol/L ；
3、過濾除雜處理用濾紙作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速8000 rpm/min條件下離心8 min,使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、螃蟹體液儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為200mmol/L, pH為6. 0 磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為20 mmol/L，混合均勻后暫存于2°C冷藏室冷藏。實施例四
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以乙二胺四乙酸二鉀作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的 40 mmol/L乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的1. 5 體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為16 mmol/L ；
3、過濾除雜處理用棉花作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速5000 rpm/min條件下離心10 min，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、螃蟹體液儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為500mmol/L, pH為7. 5 的磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為50 mmol/L,混合均勻后于_40°C條件下保存備用。實施例五
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以草酸鉀作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的10mmol/L草酸鉀抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的1體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時草酸鉀抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為5mmol/L ；
3、過濾除雜處理用濾紙作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速4000 rpm/min條件下離心3 min，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為100mmol/L，pH為6. 5磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為10 mmol/L，混合均勻后暫存于;TC冷藏室。實施例六
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以草酸鈉作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的10mmol/L草酸鈉抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的4體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時草酸鈉抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為2mmol/L ；3、過濾除雜處理用棉花作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速5000 rpm/min條件下離心％ η，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為200mmol/L，pH為7. 5的磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為20 mmol/L，混合均勻后暫存于0°C冷藏室。實施例七
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以草酸鈉作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入1體積的20mmol/L草酸鈉抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的1體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時草酸鈉抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為lOmmol/L ；
3、過濾除雜處理用濾紙作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速8000 rpm/min條件下離心6min，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為400mmol/L, pH為7. 0的磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為40 mmol/L，混合均勻后于-20°C條件下保存備用。實施例八
1、螃蟹體液抽取一手拿起將螃蟹活體，另一手將注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕拉動注射筒芯桿，使螃蟹體液流入注射筒內，得抽取液；
2、抗凝處理以草酸鉀作為抗凝劑，在體液接收容器中預先加入2體積的20mmol/L草酸鉀抗凝劑溶液；在螃蟹體液抽取完畢后，立即將抽取得到的2體積的抽取液加入接收容器內，充分混合均勻，此時草酸鉀抗凝劑在螃蟹體液中的濃度為5mmol/L ；
3、過濾除雜處理用絹布作為過濾介質濾除螃蟹體液中的泡沫和雜質，并用離心機在轉速7000 rpm/min條件下離心lOmin，使不溶物顆粒沉降，并去除沉淀物，得到澄清液；
4、儲存液處理向每升澄清液中加入100毫升濃度為500mmol/L, pH為6. 5的磷酸緩沖液，使螃蟹體液儲存液中磷酸鹽濃度為50 mmol/L,混合均勻后于_80°C條件下保存備用。
權利要求
1.一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于，包含如下步驟(1)體液抽取用注射器針頭插入螃蟹活體內，抽取螃蟹活體內體液，得抽取液；(2)抗凝處理抽取完畢，立即將抽取液放入預先加有抗凝劑溶液的體液接收容器中，充分混合，得到混合液；(3)過濾除雜處理將混合液過濾、離心，得澄清液；(4)儲存液處理向澄清液中加入磷酸緩沖液，混合均勻后，得到螃蟹體液儲存液。
2.根據權利要求1所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述抗凝劑溶液是以乙二胺四乙酸鹽或草酸鹽中的任何一種作為抗凝劑所配置而成的水溶液。
3.根據權利要求1所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于以乙二胺四乙酸鹽作為抗凝劑時，根據步驟(1)所得抽取液體積，調整乙二胺四乙酸鹽抗凝劑溶液添加量，使乙二胺四乙酸鹽在步驟(2)所得混合液中的濃度在4 mmol/L 20 mmol/L范圍。
4.根據權利要求1所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于以草酸鹽作為抗凝劑時，根據步驟(1)所得抽取液體積，調整的草酸鹽抗凝劑溶液添加量，使草酸鹽在步驟 (2)所得混合液中的濃度在2 mmol/L 10 mmol/L范圍。
5.根據權利要求1所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述過濾是指用過濾介質濾除步驟(2)所得混合液中的泡沫和雜質。
6.根據權利要求1所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述離心是指在轉速4000 rpm/min 8000 rpm/min條件下，離心機離心2 min 10 min，使不溶物顆粒沉降后，去除沉淀物。
7.根據權利要求1所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述步驟(4)儲存液處理是指向每升澄清液中加入IOOml濃度為100 mmol/L 500 mmol/L的磷酸緩沖液，使所得螃蟹體液存儲液中磷酸鹽濃度在10 mmol/L 50 mmol/L范圍。
8.根據權利要求1-7中任一項權利要求所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述磷酸緩沖液是指用相等濃度的磷酸二氫鹽溶液和磷酸鹽溶液互相混合，調整磷酸二氫鹽溶液和磷酸鹽溶液的添加量，使其混合后的PH值在5. 5 7. 5范圍，得到的磷酸緩沖液。
9.根據權利要求1-8中任一項權利要求所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述乙二胺四乙酸鹽為乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀中的一種；所述草酸鹽為草酸鈉、草酸鉀中的一種。
10.根據權利要求1-9中任一項權利要求所述的一種螃蟹體液的提取方法，其特征在于所述螃蟹體液儲存液的保存條件為暫存于0°c 4°C冷藏室或在一 80°C 一 20°C下長期保存。
全文摘要
本發明公開了一種螃蟹體液的提取方法，屬于生物技術領域。本發明方法是用注射器針頭插入螃蟹活體內，輕輕抽取螃蟹活體內體液，然后將抽取液立即放入預先加有乙二胺四乙酸鹽抗凝劑溶液或草酸鹽抗凝劑溶液的容器中，調整抗凝劑溶液添加量，使抗凝劑在抽取液中的濃度在一定范圍，充分混合后，用過濾介質過濾，再以4000rpm/min～8000rpm/min的轉速，離心2min～10min，得澄清液，最后向澄清液中加入pH在5.5～7.5范圍的磷酸緩沖液，得螃蟹體液存儲液，將螃蟹體液存儲液暫存于0℃～4℃冷藏室或在－80℃～－20℃下長期保存備用。本發明方法操作簡單、不需昂貴設備，螃蟹體液蛋白質含量高、雜質少。
文檔編號A01K61/00GK102440206SQ20111029920
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者姜沛宏, 林華娟, 秦小明, 章超樺 申請人:廣東海洋大學