專利名稱：一種克服美洲黑楊×中國山楊雜交障礙的方法
技術領域：
本發明涉及一種克服美洲黑楊X中國山楊雜交障礙的方法。
背景技術：
楊屬樹種根據形態特征、地理分布和雜交親合力分為5派即白楊派(Leuce 或 Poplus)、黑楊派(Aigeiros)、青楊派(Tacamahaca)、大葉楊派(Leucoides)、胡楊派 (Turanga)，白楊派又分為白楊亞派、山楊亞派，但種內變異豐富，種間天然和人工雜種較多，使得楊樹不同派間或種間的親緣關系不同，親緣關系較近的楊樹之間容易雜交，而親緣關系較遠的楊樹存在雜交障礙。Willing R.R和ftror L. D. (1976年)研究了多種楊樹的種間雜交后，認為青、黑、大葉楊三派之間可配性高，容易雜交，而白楊派與其它四派可配性差，很難雜交，胡楊派亦然。但由于白楊派、黑楊派兩派間許多經濟性狀優缺點互補，因此有必要通過雜交等手段，把兩派間的優良性狀集于一體，獲得黑白楊優良雜種無性系。國內外不少育種學家對黑白楊之間雜交進行研究，國外研究的主要有Knox等(1972年)所做的美洲黑楊X歐洲山楊雜交，幾乎沒有得到種子。Guris和Melttler (1976年)做了觀個組合的楊樹雜交試驗，發現美洲山楊與黑楊、青楊雜交嚴重不親合，授粉1 后，僅有少數花粉萌發。他們還發現美洲黑楊的花粉管不能進入美洲山楊的柱頭，而是在其表面扭曲生長。R0nald(1982年) 用5種白楊作母本，做了 58個組合的楊樹派間雜交試驗，發現用原種白楊作母本的大多數組合，花粉發芽率低，而用雜種白楊作母本的組合，花粉發芽率相對較高，所得雜種在形態上介于兩親本之間，能扦插生根。Rougier (1992年)研究美洲黑楊X銀白楊，發現花粉管長到花柱底部就出現沉積現象。國內這方面的工作主要有，徐緯英(1988)用母本花粉的糖蛋白處理柱頭技術做了銀白楊X歐洲黑楊、毛白楊X歐美楊等組合的雜交，但是幼胚仍然敗育。張金風等(1999年)進行了 21個雜交組合白楊與黑楊派間雜交試驗，結果表明，白楊派與其它派雜交沒有獲得苗木。張金風等(2000年)利用黑楊與青楊的雜種作為中介親本，成功地得到了楊樹派間雜種。目前，急需一種有效地克服楊樹派間、楊樹派內種間雜交不親和性的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種克服美洲黑楊X中國山楊雜交障礙的方法。本發明所提供的方法包括如下步驟1)按照包括如下步驟的方法處理母本柱頭A)用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭；B)用所述母本的花粉水提液涂抹經步驟A)處理的所述母本的雌蕊柱頭；2)將雌蕊柱頭經過步驟1)所述方法處理的所述母本與作為父本的楊樹雜交，得到雜交種；所述母本為楊屬黑楊派楊樹；所述父本為楊屬白楊派或山楊亞派楊樹；
所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液體(提取液)。所述花粉水提液制備過程中，所述提取在20_25°C進行。可按照如下方法用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭將雌花序豎直伸入盛有液態正己烷的內徑(mm)X長度(mm)為20mmX 180mm的試管中，液態正己烷的高度為 30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是90-110mm，用正己烷的揮發氣熏雌蕊柱頭 5 IOmin0所述花粉水提液按照包括如下步驟的方法制備將所述母本的花粉用水提取 50-70min后收集不含花粉粒的液體，該液體即為花粉水提液。所述提取中所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20_30ml蒸餾水混合。所述方法中，所述母本具體可為美洲黑楊(Populus deltoides)；所述步驟A)是在所述母本的雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭。所述方法中，所述父本具體可為中國山楊(Populus davidiana)。所述方法具體可為所述提取的時間為60min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與25ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為8min。所述方法還可具體為所述提取的時間為70min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與30ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為IOmin。所述方法還可具體為所述提取的時間為50min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為5min。本發明所提供的方法可以有效地克服楊屬黑楊派與白楊派楊樹間雜交的不親和性，尤其是有效地克服了美洲黑楊(Populus deltoides)和中國山楊(Populus davidiana) 的雜交障礙，實驗證明，通過該方法獲得雜交種子的結實率高，飽滿度好，種子發芽率可達 78.2%，為楊樹遠緣雜交獲得優良雜種無性系提供了一種新的途徑。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、美洲黑楊X中國山楊的雜交實驗1、實驗材料本實施例所用的母本和父本分別為母本美洲黑楊遼寧楊(PopulusXLiaoningnsisZ.Wang et H.D.Chen cv. nov) (陳鴻雕，潘成良，劉志成，等.新雜交種遼寧楊、遼河楊、蓋楊的選育，林業科技通訊， 1995(11) :16-18，公眾可從遼寧省楊樹研究所獲得)，為楊屬(Populus)黑楊派楊樹；父本中國山楊(Populus davidiana)(邢亞娟.中國山楊與美洲山楊雜交種新品系選育研究[D]，東北林業大學，2005，公眾可從遼寧省楊樹研究所獲得)，為楊屬(Populus)白楊派山楊亞派楊樹。2、實驗方法與操作步驟本實驗共設計5種雜交的處理方法，分別如下處理1是對照，常規授粉；處理2 是母本花粉水提液點涂母本雌蕊柱頭后正常授粉；處理3是正己烷有機溶劑熏母本雌蕊柱頭后正常授粉；處理4是用正己烷有機溶劑熏母本雌蕊柱頭后再用母本花粉水提液點涂柱頭，然后正常授粉；處理5是用正己烷有機溶劑點涂母本雌蕊柱頭后正常授粉。每個處理2 根花枝共9個花序，分3次重復。觀測每個處理所獲得的種子數、種子飽滿度、千粒重及發芽率等。操作方法如下1)花枝的采集與花粉的收集2月份采集美洲黑楊遼寧楊和中國山楊的雄花枝入溫室，切枝水培，室溫控制在 15-25°C，相對濕度為50-70%。散粉前套袋隔離，分別收集花粉，收集的花粉放入消毒的培養皿里(培養皿上貼上標簽，注明品種、日期等)，然后將培養皿放入干燥器中干燥M小時， 密封后放入0-4°C冰箱中的干燥器內備用。在收集花粉時將美洲黑楊遼寧楊雌花枝入溫室， 切枝水培，室溫控制在25°C左右，相對濕度為50-70%。美洲黑楊遼寧楊花芽膨大后即套袋隔離，水培至雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時進行雜交試驗。2)雜交處理1 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，按常規方法進行正常授粉，即用毛筆粘少量收集的父本中國山楊花粉輕輕抖動，將花粉灑在母本的雌蕊柱頭上，授粉時毛筆不能觸及柱頭，授粉量不宜過多，用放大鏡觀察授粉后的柱頭上均勻密布花粉即可(授粉時間最好在上午10時前后)。授粉次數在三日內連續進行，一
天一次。處理2 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，用毛筆尖蘸取美洲黑楊遼寧楊花粉水提液，輕輕地點涂于雌蕊柱頭，點涂均勻，放置0. 5-1. 0小時后待水取液干后，然后按處理1的方法進行授粉。處理3 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，將美洲黑楊遼寧楊雌花序伸入盛有正己烷的內徑(mm) X長度(mm)為20mmX 180mm的試管中，試管內液態正己烷的高度為30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是 90-110mm。用正己烷揮發的氣體熏雌花柱頭8min后按處理1的方法進行正常授粉，期間用手握住試管下部以促進揮發。處理4 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，將美洲黑楊遼寧楊雌花序豎直伸入盛有液態正己烷的內徑(mm) X長度(mm)為20mmX180mm 的試管中，試管內液態正己烷的高度為30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是 90-110mm，用正己烷的揮發氣熏雌蕊柱頭Smin后，再用毛筆尖蘸取美洲黑楊遼寧楊花粉水提液，輕輕地點涂于雌蕊柱頭，點涂均勻，放置0. 5-1. 0小時后待花粉水提液干后，按照處理1的方法進行授粉。處理5 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，用毛筆尖蘸取正己烷輕輕點涂在雌蕊柱頭上，放置0. 5-1. 0小時后待正己烷液干后，按照處理1 的方法進行授粉。
上述美洲黑楊遼寧楊花粉水提液的制備方法如下20-25°C條件下，按Ig母本美洲黑楊遼寧楊花粉與25ml蒸餾水的比例混合并進行充分攪拌，靜置30min，再充分攪拌靜置，反復2次，然后以定性濾紙過濾，所得淺黃色濾液即為花粉水提液，經檢測，該花粉水提液中不含花粉粒。3)雜交后的培養授粉后繼續水培，室內溫度控制在15-25°C、濕度控制在50-70%，每兩天換1次水，直至蒴果變黃或有裂嘴果粒時，用有透明窗的羊皮紙袋將果穗套上，待蒴果開始飛絮后，收集種子在溫室內進行播種育苗，播種容器采用72孔或1 孔規格的穴盤，播種土壤用高溫滅菌的腐質土，1穴1粒種子，不用覆土，保持土壤濕潤，待小苗長出3片真葉后移到室外，每天澆水2-3次，保持土壤濕潤，待幼苗長出5-8片真葉后移入大田。4)雜交后代的表型觀測當雜種苗平均株高為50cm時，用形態學標記的方法對雜種苗的特征進行觀測，主要觀測葉形以及葉邊緣、葉基部、葉柄及芽的特征等。3、試驗結果美洲黑楊與中國山楊雜交，經不同方法處理后，所獲得的雜交種子數、種子飽滿度、千粒重及發芽率觀測結果見下表。表1.不同處理獲得的雜交種子調查表
種子數(粒)飽滿度千粒重(g)發芽率(％)處理1530. 1840處理298不飽滿0. 2645. 0處理3156不飽滿0. 2566. 4處理4252飽滿0. 38578. 2處理581不飽滿0. 27910. 0由上表得知，美洲黑楊與中國山楊雜交各處理均獲得了種子，但所獲得的種子數及品質差別達顯著水平，處理4所獲得的種子數及品質比其他幾個處理都要好。對處理4得到的雜種苗進行特征觀測的結果為雜種苗中，150株苗木葉為卵圓形，基部截形，邊緣鋸齒較大而淺，但不具半透明邊，葉背白色，葉柄圓柱形，芽被絨毛，呈父本特征，另47株苗木葉為菱狀卵形，先端長漸尖，基部楔形，邊緣具圓鋸齒，并有半透明狹邊，兩面皆為綠色，葉柄長而側扁，芽有粘質，呈母本特征，觀測結果表明雜交得到的種子均為美洲黑楊遼寧楊與中國山楊的雜交種，從而說明處理4是克服美洲黑楊與中國山楊間雜交障礙的最佳方法。實施例2、美洲黑楊X中國山楊的雜交實驗1、實驗材料本實施例所用的母本和父本分別為
母本美洲黑楊遼寧楊(PopulusXLiaoningnsis Z.Wang et H.D.Chen cv. nov) (陳鴻雕，潘成良，劉志成，等.新雜交種遼寧楊、遼河楊、蓋楊的選育，林業科技通訊， 1995(11) :16-18，公眾可從遼寧省楊樹研究所獲得)，為楊屬(Populus)黑楊派楊樹；父本中國山楊(Populus davidiana)(邢亞娟.中國山楊與美洲山楊雜交種新品系選育研究[D]，東北林業大學，2005，公眾可從遼寧省楊樹研究所獲得)，為楊屬 (Populus)白楊派山楊亞派楊樹。2、實驗方法與操作步驟本實驗共設計5種雜交的處理方法，分別如下處理1是對照，常規授粉；處理2 是母本花粉水提液點涂母本雌蕊柱頭后正常授粉；處理3是正己烷有機溶劑熏母本雌蕊柱頭后正常授粉；處理4是用正己烷有機溶劑熏母本雌蕊柱頭后再用母本花粉水提液點涂柱頭，然后正常授粉；處理5是用正己烷有機溶劑點涂母本雌蕊柱頭后正常授粉。每個處理2 根花枝共9個花序，分3次重復。觀測每個處理所獲得的種子數、種子飽滿度、千粒重及發芽率等。操作方法如下1)花枝的采集與花粉的收集2月份采集美洲黑楊遼寧楊和中國山楊的雄花枝入溫室，切枝水培，室溫控制在 15-25°C，相對濕度為50-70%。散粉前套袋隔離，分別收集花粉，收集的花粉放入消毒的培養皿里(培養皿上貼上標簽，注明品種、日期等)，然后將培養皿放入干燥器中干燥M小時， 密封后放入0-4 °C冰箱中的干燥器內備用。在收集花粉時將美洲黑楊遼寧楊雌花枝入溫室， 切枝水培，室溫控制在25°C左右，相對濕度為50-70%。美洲黑楊遼寧楊花芽膨大后即套袋隔離，水培至雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時進行雜交試驗。2)雜交處理1 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，按常規方法進行正常授粉，即用毛筆粘少量收集的父本中國山楊花粉輕輕抖動，將花粉灑在母本的雌蕊柱頭上，授粉時毛筆不能觸及柱頭，授粉量不宜過多，用放大鏡觀察授粉后的柱頭上均勻密布花粉即可(授粉時間最好在上午10時前后)。授粉次數在三日內連續進行，一
天一次。處理2 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，用毛筆尖蘸取美洲黑楊遼寧楊花粉水提液，輕輕地點涂于雌蕊柱頭，點涂均勻，放置0. 5-1. 0小時后待水取液干后，然后按處理1的方法進行授粉。處理3 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，將美洲黑楊遼寧楊雌花序伸入盛有正己烷的內徑(mm) X長度(mm)為20mmX 180mm的試管中，試管內液態正己烷的高度為30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是 90-110mm。用正己烷揮發的氣體熏雌花柱頭IOmin后按處理1的方法進行正常授粉，期間用手握住試管下部以促進揮發。處理4 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，將美洲黑楊遼寧楊雌花序豎直伸入盛有液態正己烷的內徑(mm) X長度(mm)為20mmX180mm 的試管中，試管內液態正己烷的高度為30-40mm，雌花序的頂端距正己烷液面的垂直距離是 90-110mm，用正己烷的揮發氣熏雌蕊柱頭IOmin后，再用毛筆尖蘸取美洲黑楊遼寧楊花粉水提液，輕輕地點涂于雌蕊柱頭，點涂均勻，放置0. 5-1. 0小時后待花粉水提液干后，按照處理1的方法進行授粉。處理5 當母本美洲黑楊遼寧楊的雌花開放，雌蕊柱頭發亮具有分泌汁液時，用毛筆尖蘸取正己烷輕輕點涂在雌蕊柱頭上，放置0. 5-1. 0小時后待正己烷液干后，按照處理1 的方法進行授粉。上述美洲黑楊遼寧楊花粉水提液的制備方法如下20-25°C條件下，按Ig母本美洲黑楊遼寧楊花粉與30ml蒸餾水的比例混合并進行充分攪拌，靜置35min，再充分攪拌靜置，反復2次，然后以定性濾紙過濾，所得淺黃色濾液即為花粉水提液，經檢測，該花粉水提液中不含花粉粒。3)雜交后的培養授粉后繼續水培，室內溫度控制在15-25°C、濕度控制在50-70%，每兩天換1次水，直至蒴果變黃或有裂嘴果粒時，用有透明窗的羊皮紙袋將果穗套上，待蒴果開始飛絮后，收集種子在溫室內進行播種育苗，播種容器采用72孔或1 孔規格的穴盤，播種土壤用高溫滅菌的腐質土，1穴1粒種子，不用覆土，保持土壤濕潤，待小苗長出3片真葉后移到室外，每天澆水2-3次，保持土壤濕潤，待幼苗長出5-8片真葉后移入大田。4)雜交后代的表型觀測當雜種苗平均株高為50cm時，用形態學標記的方法對雜種苗的特征進行觀測，主要觀測葉形以及葉邊緣、葉基部、葉柄及芽的特征等。3、試驗結果美洲黑楊與中國山楊雜交，經不同方法處理后，所獲得的雜交種子數、種子飽滿度、千粒重及發芽率觀測結果見下表。表2.不同處理獲得的雜交種子調查表
權利要求
1.楊樹雜交育種方法，包括如下步驟1)按照包括如下步驟的方法處理母本柱頭A)用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭；B)用所述母本的花粉水提液涂抹經步驟A)處理的所述母本的雌蕊柱頭；2)將雌蕊柱頭經過步驟1)所述方法處理的所述母本與作為父本的楊樹雜交，得到雜交種；所述母本為楊屬黑楊派楊樹；所述父本為楊屬白楊派或山楊亞派楊樹；所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述花粉水提液按照包括如下步驟的方法制備將所述母本的花粉用水提取50-70min后收集不含花粉粒的液體，該液體即為花粉水提液。
3.根據權利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于所述提取中所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20-30ml蒸餾水混合。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟A)中，用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為5-lOmin。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述母本為美洲黑楊(Populus deltoides)0
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述父本為中國山楊(Populus davidiana)0
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中，所述提取的時間為60min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與25ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為8min。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中，所述提取的時間為70min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與30ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為lOmin。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中，所述提取的時間為50min、所述母本的花粉與水的配比為每克所述母本的花粉與20ml蒸餾水混合，所述用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭的時間為5min。
全文摘要
本發明公開了一種克服美洲黑楊×中國山楊雜交障礙的方法。本發明所提供的方法包括如下步驟1)按照包括如下步驟的方法處理母本柱頭A)用正己烷的揮發氣熏所述母本的雌蕊柱頭；B)用所述母本的花粉水提液涂抹經步驟A)處理的所述母本的雌花柱頭；2)將雌蕊柱頭經過步驟1)所述方法處理的所述母本與作為父本的楊樹雜交，得到雜交種；所述母本為楊屬黑楊派楊樹；所述父本為楊屬白楊派或山楊亞派楊樹；所述花粉水提液是用水提取所述母本的花粉得到的不含花粉粒的液體。本發明所提供的方法可以有效地克服楊屬黑楊派與白楊派楊樹間雜交的不親和性，實驗證明，通過該方法獲得雜交種子的結實率高，飽滿度好，種子發芽率可達78.2％，為楊樹遠緣雜交獲得優良雜種無性系提供了一種新的途徑。
文檔編號A01H1/02GK102499064SQ201110344528
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者馮連榮, 劉巍, 劉毅, 尹杰, 張興芬, 彭儒勝, 楊志巖, 王勝東, 矯麗曼, 紀純陽, 蔄勝軍, 趙繼梅, 趙鑫聞 申請人:遼寧省楊樹研究所