專利名稱：一種提高瘤胃微生物蛋白產量的天然產物制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種促進瘤胃微生物特別是細菌的生長，顯著提高瘤胃微生物蛋白產量的天然產物制劑的制備方法。
背景技術：
瘤胃微生物在反芻動物營養代謝中具有極其重要的作用。首先作為飼料主體的結構性和非結構性碳水化合物，只有經過瘤胃微生物作用，才能轉化成可被反芻動物利用的能量物質如揮發性脂肪酸，反芻動物以這種方式獲得所需能量的70% 80%。其次，瘤胃微生物可以把采食的低質量植物蛋白轉變成高質量微生物菌體蛋白，瘤胃提供的菌體蛋白占反芻動物所需蛋白質的 40% 60% (Welch J G, Hooper A P. Ingestion of feed and water[M]//Church D C.The ruminant animal digestive physiology and nutrition. Prospect Heights, Iuinois =Waveland Press, Inc，1993 :108-116.)。此外，瘤胃微生物還合成多種維生素和促生長物質，在保證反芻動物健康和正常生長發育方面發揮著重要作用。因此，促進瘤胃微生物生長，增加瘤胃菌體蛋白產量，對于改善反芻動物的生產性能具有重要意義。影響瘤胃微生物生長和菌體蛋白合成的主要因素有飼料氮源(肽、氨基酸、氨等)、飼料碳源(結構性和非結構性碳水化合物)、礦物質(常量和微量元素)、維生素以及瘤胃內環境(pH、滲透壓等)等(Clark J H, Klusmeyer T H, Cameron M R. Microbial protein synthesis and flows of nitrogen fractions to the duodenum of dairy cows[J], J Dairy Sci,1992,75 :2304-2323 ；Hoover W H, Stokes S R. Balancing carbohydrates and proteins for optimum rumen microhial yield [J]. J Dairy Sci, 1991，74 :3630-3644.),對這些影響因素進行合理優化，可以不同程度地促進瘤胃微生物的生長和菌體蛋白的合成，其中增加蛋白質飼料攝入量是最有效的方法。然而蛋白質飼料的缺乏和昂貴，極大地限制了該方法的實際應用，促使人們開發和應用非蛋白質氮源飼料。目前國內外廣泛應用的非蛋白質氮源飼料是尿素。尿素的氮含量為46%，Ikg尿素相當于2. 88kg粗蛋白質(趙云煥.提高反芻家畜對尿素的利用率[J].信陽農業高等專科學校學報，2000，10 (3) :12-14.)。反芻動物的瘤胃微生物可以將尿素中非蛋白氮轉化為菌體蛋白質，在日糧蛋白質不足的情況下，補充尿素能使奶牛產奶量提高10%，使青年牛增重提高24. 3% (王進寬.反芻動物尿素中毒的防治[J].畜牧獸醫雜質，2010，四(1) 127，129.)。尿素雖然可以在一定程度上提高瘤胃菌體蛋白產量，但其適口性差，并且在瘤胃內水解速度較快與能量飼料發酵速度不同步，導致氮的利用率不高(張明峰.美國飼草飼料生產生產及加工工業發展特點和趨勢[J].草原與草坪，1994(4) 15-19 ；Bloomfiled R A. Kinetics of urea metabolism in sheep. Journal of Animal Science,1960,19 1248.)，飼喂不當還會引發家畜的高血氨癥，造成急性中毒，死亡率很高(王進寬.反芻動物尿素中毒的防治[J].畜牧獸醫雜質，2010，四(1) :127，129;張宗森劉得元.反芻動物尿素中毒的防治措施[J].現代農業科技，2008，7:184.)，因此尿素作為非蛋白氮源飼料在實際應用中受到很大限制。開發能促進瘤胃微生物生長和菌體蛋白合成的安全、高效的天然產物，替代尿素，有助于克服尿素的毒副作用和代謝缺陷，改善反芻動物的生產性能，推進反芻動物的健康養殖。
發明內容
技術問題本發明針對上述問題提供了一種新的天然產物制劑，添加該制劑可顯著促進瘤胃微生物生長，提高瘤胃微生物菌體蛋白產量。技術方案實現本發明的技術方案是采集鳳仙花(Impatiens balsamina)成熟植株枝葉，置50°C干燥箱內烘至恒重， 粉碎后過0. 25mm篩，制成鳳仙花植物干粉。取含三十烷醇65%、二十八烷醇30%、二十四烷醇和二十六烷醇5%的天然普利醇，配制成濃度為IOppm的普利醇水溶液。按鳳仙花植物干粉1 普利醇水溶液2(g/mL)的比例，將鳳仙花植物干粉用IOppm 的普利醇水溶液浸泡，充分攪拌制成濕料，置70°C干燥箱內烘干，壓碎混勻后轉至50°C烘箱再烘，直至恒重，制成鳳仙花-普利醇天然產物制劑。將恒重干稻草、玉米和黃豆粉碎，過0.5mm篩，按2 1 0. 3比例混合配成人工飼料。從裝有永久瘤胃瘺管的成年黃牛體內采集瘤胃液，在厭氧操作袋中四層紗布過濾，制成瘤胃接種液。向40只250mL培養瓶中分別注入67mL瘤胃接種液，并加入1. 5g人工飼料，再用人工唾液將每瓶的培養物體積調至200mL，然后將40只培養瓶分成4組，每組10只，按培養物體積的一定比例(g/mL)，分組添加鳳仙花-普利醇天然產物制劑，添加量分別為0、0. 2 %、 0. 4%和0. 8%，其中0添加量的10只培養瓶為對照組，其它為不同添加量的試驗組。加好料的40只培養瓶用純隊飽和后密封，于39°C的搖床上充分混合后，再在培養瓶密封蓋上插入完全排空的20mL注射器，組成人工瘤胃裝置，在39°C恒溫培養箱中培養。分別在12、18、24h提取發酵液樣品，采用嘌呤法測定樣品中的微生物蛋白質含量，采用比色法測定氨態氮濃度；同時提取各時間點培養液樣品的微生物基因組DNA，使用 RT-qPCR技術檢測細菌、真菌、古菌和原蟲的相對數量。有益效果微生物蛋白質和氨態氮檢測表明，添加0.2%鳳仙花-普利醇天然產物制劑，可使 12hU8h和Mh的微生物蛋白質產量均值分別提高23. 45%,40. 23%和54. 16%，氨態氮則分別平均降低30. 12%,36. 37%和46. 68% ；添加0. 4%鳳仙花-普利醇天然產物制劑，使 12h、18h和24h的微生物蛋白質產量均值分別提高了 33. 31%,52. 05%和59. 92%，氨態氮分別平均減少了 27. 13^^36.61%和41. 39% ；添加0. 8%的鳳仙花-普利醇天然產物制劑，使相同時間段的微生物蛋白產量均值分別提高40. 16%,59. 12%和79. 72%，氨態氮分別平均下降 41. 15%,52. 15%和 55. 38%。RT-qPCR檢測結果顯示，添加鳳仙花_普利醇天然產物制劑可顯著促進瘤胃微生物生長，與對照相比，瘤胃細菌、真菌和原蟲數量平均提高約一個數量級，其中0.8%添加量的效果最好；與此相反，鳳仙花-普利醇天然產物制劑明顯降低了瘤胃古菌的數量。可見， 鳳仙花-普利醇天然產物制劑對瘤胃中的古菌有一定的抑制作用，而對瘤胃中的其它微生物則有顯著的促進作用。鳳仙花是一種極易栽培的傳統中草藥植物，兼具觀賞價值，普利醇系采用分子蒸餾技術從蜂蠟中提取的純天然產物。利用鳳仙花植物干粉和普利醇制成的鳳仙花-普利醇制劑不添加任何人工合成物質，是一種純天然產物制劑，用來代替尿素改善反芻動物的生產性能將具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式采集鳳仙花成熟植株枝葉，置50°C干燥箱內烘至恒重，粉碎后過0. 25mm篩，制成鳳仙花植物干粉。取含三十烷醇65 %、二十八烷醇30 %、二十四烷醇和二十六烷醇5 %的天然普利醇，配制成濃度為IOppm的普利醇水溶液。按鳳仙花植物干粉1 普利醇水溶液 2(g/mL)的比例，將鳳仙花植物干粉用IOppm的普利醇水溶液浸泡，充分攪拌制成濕料，置 70°C干燥箱內烘干，壓碎混勻后轉至50°C烘箱再烘，直至恒重，制成鳳仙花-普利醇天然產物制劑。將恒重干稻草、玉米和黃豆粉碎，過0.5mm篩，按2 1 0. 3比例混合配成人工飼料。從裝有永久瘤胃瘺管的成年黃牛體內采集瘤胃液，在厭氧操作袋中用四層紗布過濾，制成瘤胃接種液。向40只250mL培養瓶中分別注入67mL瘤胃接種液，并加入1. 5g人工飼料，再用人工唾液將每瓶的培養液體積調至200mL，然后將40只培養瓶分成4組，每組10只，按培養液體積的一定比例，分組添加鳳仙花-普利醇天然產物制劑，添加量分別為0、0.2%、0. 4% 和0.8%，其中0添加量的10只培養瓶為對照組，其它為不同添加量的試驗組。加好料的 40只培養瓶用純CO2驅除頂空氣體后密封，于39°C的搖床上充分混合后，再在培養瓶密封蓋上插入完全排空的20mL注射器，組成人工瘤胃裝置，在39°C恒溫培養箱中培養。分別在12、18、24h采集發酵液樣品，用嘌呤法測定樣品中的微生物蛋白質含量， 測定結果見表3 ；使用比色法測定氨態氮濃度，測定結果見表4;同時提取各時間點培養液樣品的微生物基因組DNA，使用RT-qPCR技術檢測細菌、真菌、古菌和原蟲的相對數量，檢測結果見表5。人工唾液配制表1人工唾液原液配制表
權利要求
1.一種提高瘤胃微生物蛋白產量的天然產物制劑，其特征在于將鳳仙花植株干粉和天然普利醇水溶液按一定比例，配制成鳳仙花-普利醇天然產物制劑。
2.根據權利要求1所述的天然產物制劑，其特征在于采集鳳仙花成熟枝葉，置50°C干燥箱內烘至恒重，粉碎后過0. 25mm篩，制成鳳仙花植物干粉；取天然普利醇，配成濃度為IOppm的普利醇水溶液；按鳳仙花植物干粉1 普利醇水溶液2(g/mL)的比例，將鳳仙花植物干粉與IOppm的普利醇水溶液混勻，70°C 50°C烘至恒重，制成鳳仙花-普利醇天然產物制劑。
3.根據權利要求1和2所述的天然產物制劑，其特征在于其中天然普利醇含三十烷醇65 %、二十八烷醇30 %、二十四烷醇和二十六烷醇5 %。
4.根據權利要求1 3所述的天然產物制劑，其特征在于按瘤胃培養物體積的0.2 0.8% (g/mL)加入天然產物制劑。
5.根據權利要求1 4所述的天然產物制劑，其特征在于最佳添加量為0.8%。
6.根據權利要求1 5所述的天然產物制劑，其特征在于天然產物制劑可顯著促進瘤胃微生物特別是細菌的生長，提高瘤胃微生物蛋白質產量，并降低氨態氮含量和瘤胃古菌的數量。
7.根據權利要求1 6所述的天然產物制劑，其特征在于所述瘤胃培養物是牛瘤胃體外培養物。
全文摘要
本發明涉及一種促進瘤胃微生物特別是細菌的生長，顯著提高瘤胃微生物蛋白產量的天然產物制劑的制備方法。將鳳仙花植株干粉和天然普利醇水溶液按一定比例，配制成鳳仙花-普利醇天然產物制劑。按培養物體積0.2％～0.8％的添加量，可顯著促進瘤胃微生物特別是細菌的生長，使細菌、真菌和原蟲數量平均提高一個數量級以上，使微生物蛋白量平均提高49.12％，使氨態氮平均降低40.78％，但對瘤胃古菌具有一定的抑制作用，使其數量平均降低約一個數量級。利用鳳仙花植物干粉和普利醇制成的鳳仙花-普利醇制劑不添加任何人工合成物質，是一種純天然產物制劑，用來代替尿素改善反芻動物的生產性能將具有廣闊的應用前景。
文檔編號A23K1/18GK102389042SQ20111034476
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者丁建南, 于一尊, 印遇龍, 張國華, 張志紅, 王東升, 田曉娟, 譚支良, 黃江麗, 黃黃 申請人:江西省科學院生物資源研究所