專利名稱：一種調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種調控植物花藥開裂相關蛋白 TaAOC及其基因和應用。
背景技術：
現代農業生產中，人們廣泛利用雜種優勢來改良品種。雜種優勢是指兩個遺傳組成不同的親本雜交產生的雜種一代在生活力、生長勢、繁殖力、抗逆性、產量和品質上比其雙親優勢的現象。雜種優勢利用被認為是今后小麥生產水平大幅度提高的主要途徑。雄性不育是植物界一種普遍存在的現象。雄性不育(male sterility)是指植物因不能產生有功能的花粉囊、花粉或者雄配子而導致的不育。其主要特征是雄蕊發育異常， 包括兩種情況1.不能產生正常的花粉、雄配子；2.花粉育性正常但花藥開裂異常不能及時散粉。雄性不育植株的雌蕊通常發育正常，能接受正常花粉而受精結實。茉莉酮酸酯類(Jasmonates，JA)做為植物應答外界生物或非生物脅迫以及調控植物生長發育過程的一種重要的植物激素，在植物體內廣泛存在。MeJA做為茉莉酮酸酯類的甲基酯類化合物與1962年首次從素馨的精油中被分離出來(Demole et al.，1962)。然而20年后人們才真正發現了 MeJA和它的自由酸類化合物茉莉酸(JA)的生理效應。自 JA等化合物的芳香激發效應及其做為生長調控因子分別與1980和1981年得到描述、鑒定及分離后(Ueda，KatO，1980 ；Dathe et al.，1981)，篩選抑制根生長發育的突變體成為與JA 信號有關研究的主要內容。Vick和Zimmermarm于1984年闡明了 JA的代謝合成途徑。植物體內存在六種調控酶參與JA代謝途徑。六大調控基因共同維系JA代謝途徑的暢通，其中任何一個基因的表達出現異常均會影響JA或MeJA的最終生成，而植物體內適當的內源 JA或MeJA水平是均衡整個植物生長發育過程以及幫助植物應激外界刺激的必要保證。丙二烯氧化物環化酶(AOC)特異性催化丙二烯氧化物轉化成0PDA，是一種可溶性蛋白酶，分子量為 45000 (Hamberg M.，1988)。Simpson TD 和 Gardner HW 發現 AOC 酶活性在正在發育的大豆種子種皮內活性最高，說明種子在發育過程中同化吸收JA主要依靠種皮完成(Simpson TD和Gardner HW, 1995) 1997年Ziegler J等從干燥的玉米種子中純化出AOC酶，并發現該酶活性不受二價離子影響并且不受其產物反饋調控，該酶專一催化酶促環化反應將4，5-環氧樹脂-1，3，7-辛三烯結構插入脂肪酸鏈，使雙鍵生成于3號碳原子位置并在6、7號碳原子位置形成環氧化物。隨后通過PCR獲得從番茄中獲得了 AOC基因的全長cDNA序列，但該序列編碼區所表達的蛋白并不具有AOC酶活性，而截取5’端的蛋白卻顯示出AOC酶活性，這表明編碼區翻譯出了額外的氨基酸以至于破壞了該酶的正常功能，最后還發現當番茄葉片受到外部機械損傷時AOC基因mRNA水平會被誘導上升(Ziegler J 等，1997 ;Ziegler J 等，1999 ;Ziegler J 等，2000)。2000 年 Hause B 等探索了 AOC 酶在番茄各個組織中的含量和酶活，發現AOC mRNA在莖、幼嫩葉片、幼嫩的花中含量較低，而在花芽、花柄和根含量較高(Hause B，2000)。YamadaA等在紅樹中表達轉導的番茄AOC基因能提高紅樹在鹽脅迫環境下的抗性(YamadaA，200 。Stenzel I等發現AOC活性受系統素和JA正向誘導并使JA的水平提高，隨后他們在生態型哥倫比亞擬南芥中分離了四個AOC家族基因的全長cDNA，發現都具有AOC酶活性，并且受到外界機械損傷和外源JA兩種處理的正向調控(Stenzel I等，2003)。Maucher H等在大麥中擴增出長717bp的AOC cDNA，對應的氨基殘基攜帶一個推測的線粒體定位信號序列，該基因定位于染色體MKMaucher H等， 2004)。Kong F等通過免疫雜交技術分析了 JA代謝途徑中三個調控酶L0X、A0S、A0C在牽牛中的水平發現AOC蛋白被活化開始于外源theobroxide處理30min內并伴隨著JA水平的升高(Kong F等，2005)。2006年Hofmarm E等描述了擬南芥中A0C2酶蛋白的晶體結構并闡明了 AOC催化12，13-E0T生成OPDA的酶促反應動力學原理(Hofmann E等，2006)。2008 年Jiang K等從天仙子中克隆到了天仙子AOC(HnAOC)，并通過RT-PCR分析該基因的表達水平在不同的脅迫環境和外界誘導物的情況下受誘導，其中以MeJA的誘導最為顯著(Jiang K等，2008)。Pi Y等從喜樹中克隆到CaAOC基因，實時定量PCR分析該基因在鹽和低溫脅迫下的表達水平受誘導；利用農桿菌將CaAOC轉染煙草，所得的轉基因植株在低溫條件比野生型抗性更強(Pi Y等，2009)。前人的研究表明AOC基因在JA途徑中催化下游關鍵的一步將12，13-E0T環化生成0PDA，而OPDA是生成JA的唯一前體，AOC的重要性不言而喻。AOC基因在旱、鹽、冷脅迫及機械損傷等外界刺激下的表達水平受到誘導，說明該基因通過JA途徑間接參與到了植物各種對環境的應激反應當中，是維持植物正常的生理活動必不可少的。但是，目前還未有小麥中AOC的相關報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC。本發明的另一目的是提供編碼上述調控植物花藥開裂相關蛋白的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供上述調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC在調控植物育性方面的應用。本發明的另一目的是提供一種調控植物花藥開裂的方法。本發明提供了一種調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC，來源于雜交小麥品種京麥 7號(京審麥2009003)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MAAPPSSVSV RAGASVSAKL TPRQAARAGF GGRVSVSSGR KCGGPVRASLFSPKPAVAMD60ARPTKVQELH VYELNERDRE SPAYLRLSAK QSQNALGDLV PFTNKVYNGSLDKRIGITAG 120ICILIQHVPE RNGDRYEAIY SIYFGDYGHI AVQGPYLTYE ESYLAVTGGSGVFEGAYGQV180KLNQIVFPFK IFYTFYLKGI PDLPKELLCA APVPP SPTVE PTPAAKATEPHACLSNFID239本發明的蛋白由239個氨基酸殘基組成，具有1個酰胺化作用位點、1個N-糖基化作用位點、一個CK2磷酸化位點、4個N-豆蔻酰化作用位點、7個蛋白激酶C磷酸化位點、2個酪氨酸激酶磷酸化位點、一個網格蛋白螺旋重復基序及一個丙二烯氧化物環化酶(allene oxide cyclase, A0C)保守域。
為了使蛋白TaAOC便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
標簽殘基序列Poly-Arg5-6 (通常為5個)RRRRRPoly-His2-10 (通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根據本發明所公開的SEQ ID NO. 1序列，本發明的轉錄因子TaAOC可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。本發明的編碼上述調控植物花藥開裂相關蛋白的基因TaAOC，其表達受茉莉酸途徑的誘導，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示catcatccgttagccgtcgccaccaccaccagtccagcaccatggcagcgcccccctcct60
CCgtgtCCgtcagggccggcgcgtccgtctcggcgaagctgacccctcgccaggccgcga120
gggctgggttcggtggcagggtcagcgtcagctcgggcaggaagtgcggcggccccgtgc180
gggcgtcgctcttctcgcccaagcccgctgtggccatggacgcgaggccgaccaaggtgc240
aggagctgcacgtctacgagctcaacgagcgcgaccgcgagagccccgcgtacctccggc300
tgagcgccaagcagagccagaacgcgctcggcgacctcgtccccttcaccaacaaggtgt360
acaacgggagcctggacaagcggatcgggatcacggcggggatctgcatcctgatccagc420
acgtgccggagcgcaacggcgaccgctacgaggccatctacagcatctacttcggcgact480
acggccacatcgccgtgcaggggccctacctcacctacgaggagtcctacctcgccgtca540
ccggcggctccggcgtcttcgagggcgcctacggccaggtcaagctcaaccagatcgtct600
tccccttcaagatcttctacaccttctacctcaagggcatccccgacctgccaaaggagc660
tgctctgcgcggcgcccgtcccgccctcccccaccgtcgagcccacgcccgccgccaagg720
ccaccgagccacacgcatgcctcagcaacttcatagactagctaccttagcttagcccaa780
aatatctattattgctcctgctagtagttgaacttgcgtgCgtgt825 其中，5’末端第42至761位脫氧核糖核苷酸為TaAOC基因的開放閱讀框(0RF)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示atggcagcgcccccctcctccgtgtccgtcagggccggcgcgtccgtctcggcgaagctg60
acccctcgccaggccgcgagggctgggttcggtggcagggtcagcgtcagctcgggcagg120
aagtgcggcggccccgtgcgggcgtcgctcttctcgcccaagcccgctgtggccatggac180
gcgaggccgaccaaggtgcaggagctgcacgtctacgagctcaacgagcgcgaccgcgag240
agccccgcgtacctccggctgagcgccaagcagagccagaacgcgctcggcgacctcgtc300
cccttcaccaacaaggtgtacaacgggagcctggacaagcggatcgggatcacggcgggg360
atctgcatcctgatccagcacgtgccggagcgcaacggcgaccgctacgaggccatctac420
agcatctacttcggcgactacggccacatcgccgtgcaggggccctacctcacctacgag480
gagtcctacc tcgccgtcac cggcggctcc ggcgtcttcg agggcgccta cggccaggtc 540aagctcaacc agatcgtctt ccccttcaag atcttctaca ccttctacct caagggcatc 600cccgacctgc caaaggagct gctctgcgcg gcgcccgtcc cgccctcccc caccgtcgag 660cccacgcccg ccgccaaggc caccgagcca cacgcatgcc tcagcaactt catagactag 720本發明還提供了包含上述調控植物花藥開裂相關蛋白基因TaAOC的重組載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，優選將調控植物花藥開裂相關基因TaAOC構建到pBI121載體CaMV 29A啟動子之后的McI和SpeI酶切位點之間，得重組質粒pBI35S-TaA0C ；或者將調控植物花藥開裂相關基因TaAOC構建到pAHC25 載體CaMV 29A啟動子之后的BamHI和&icl酶切位點之間，得重組質粒pAHC_TaA0C。植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA 加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端， 如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用TaAOC構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子 ⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。本發明還提供了上述調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC在調控植物育性方面的應用，優選其在調控植物花藥開裂方面的應用。本發明還提供了一種調控植物花藥開裂的方法，所述方法包括將上述調控植物花藥開裂相關基因TaAOC導入植物中并表達的步驟。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的TaAOC 的編碼基因導入植物細胞，可獲得提高植物花藥開裂比例的轉基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、小麥、新疆偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發明以雜交小麥品種京麥7號(京審麥200900 為試驗材料，得到茉莉酸調控途徑中調控花藥開裂的相關蛋白TaAOC及其編碼基因TaAOC，并將基因TaAOC導入小麥光溫敏不育系BS366，能夠顯著提高花藥開裂率及結實率，從而通過基因工程方法驗證其功能。該基因與植物育性相關，能提高植物花藥開裂率和結實率，對于提高糧食產量及二系雜交小麥理論的發展具有十分重要的理論和實際意義。
圖1茉莉酸代謝途徑育中調控花藥開裂的相關蛋白TaAOC編碼基因的cDNA克隆凝膠圖，以雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)為模板，PCR擴增TaAOC的cDNA片段， 1，2，雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)的TaAOC基因片段；M，DL2000 marker (100， 250，500,750,1000,2000,3000,5000bp)。圖2RT-PCR半定量分析凝膠圖，A，B為凝膠圖，C，D為凝膠圖的IOD值分析。以小麥光溫敏不育系BS366活體花藥在0d、ld、2d、3d、4d、5d五個處理時間點的cDNA作為模板， 用JA途徑相關基因半定量特異引物進行PCR，在處理的5天中MeJA處理后的表達量比空白對照要高，受到MeJA的正向調控。圖3為轉基因小麥的獲得，A，通過基因槍法獲得轉基因的小麥愈傷，B，篩選、分化后獲得的再生植株生根培養；C，轉基因小麥植株的PCR檢測，有帶的為陽性植株。圖4為TaAOC基因引起的花藥開裂情況，Al，京冬8正常植株的花藥開裂情況，A2， 京冬8轉基因植株的花藥開裂情況；Bi，小麥光溫敏不育系BS366正常植株的花藥開裂情況，B2,小麥光溫敏不育系BS366轉基因植株的花藥開裂情況。
具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。實施例1 小麥茉莉酸代謝途徑中調控花藥開裂相關基因TaAOC的cDNA克隆與半定量分析取雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)的花藥，用Trizol法提取花藥的總 RNA。應用 5，RACE 試劑盒(5，RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18374-058)和 3，RACE 試劑盒(3，RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL,CAT. NO. 18373-019)獲得 TaAOC 基因，其序列全長為8451Λ。用Trizol法提取雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)花藥的總RNA，用 superscript II (購自invitrogen公司)反轉錄酶反轉錄獲得到cDNA。根據TaAOC基因編碼區序列設計引物Pl和P2。以反轉錄得到的cDNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR擴增。引物Pl和P2的序列如下Pl :5，-CATCATCCGTTAGCCGTCGC-3，P2 5' -ACACGCACGCAAGTTCAACTAC-3‘對PCR產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為0. 8-1. Okb左右的條帶，與預期結果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與 pGEM-T Easy(購自 Promega 公司)連接，參照 Cohen 等的方法(Proc Natl Acad Sci, 69 :2110)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，根據pGEM_T fesy載體上的氨卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明擴增到的TaAOC基因的開放閱讀框(ORF)為SEQ ID No. 3，即SEQ ID No. 2的自5'末端第42至761位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白質。含序列SEQ ID No. 3所示TaAOC基因的 cDNA克隆結果如圖1所示。TaAOC基因的序列在Genabnk上進行比對，BLAST分析表明，TaAOC基因編碼的蛋白與大麥中的AOC(HvAOC)酶蛋白親緣關系最近，該序列包含一個丙二烯氧化物環化酶 (allene oxide cyclase, A0C)保守域，說明該基因所編碼的蛋白具有AOC的活性。以小麥光溫敏雄性不育系BS366及常規品種京冬8為實驗材料，在小麥藥隔后期開始，用0. Immol/L,0. 3mmol/L,0. 5mmol/L的茉莉酸甲酯(MeJA)對小麥進行噴灑處理，以噴前時取樣記作0d，以后每一天噴灑一次，以活體花藥在0(1、1(1、2(1、3(1、4(1、5(1五個處理時間點的cDNA作為模板(其中常規品種京冬8作為對照組)，用JA途徑相關基因半定量特異引物進行PCR，每個基因半定量PCR結果均由軟件分析得到其IOD值，并利用SPSS進行方差分析，最后在Excel中做出柱狀圖(圖2C，D)，在處理的5天中MeJA處理后的表達量比空白對照要高，受到MeJA的正向調控。總的表達量上看，京冬8中MeJA處理后的總表達量與空白對照相比沒有顯著變化。實施例2 =TaAOC單子葉植物轉基因表達載體的構建1、重組表達載體的構建pAHC-TaAOC單子葉植物重組表達載體的構建以雜交小麥品種京麥7號(京審麥 2009003)的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用含有BamHI和McI接頭序列的特異引物進行PCR擴增；然后BamHI和McI雙酶切PCR產物，回收，將酶切產物正向插入載體pAHC25 的CaMV 29A啟動子之后的BamHI和&icl酶切位點之間，得到重組載體pAHC-TaAOC。引物序列如下AOC[BamHI] 5' -CGGGATCCTATCATCCGTTAGC-3‘AOC[SacI] 5' -CGAGCTCACGCACGCAAGTTC-3‘2、轉基因小麥的獲得與鑒定1)將上述得到的重組質粒pAHC-TaAOC通過基因槍法介導小麥光溫敏不育系 BS366及京冬8幼胚的轉基因，從而獲得到轉基因小麥的愈傷，并在生根培養基上進行生根培養(圖幻，最終獲得小麥光溫敏不育系BS366及京冬8轉基因小麥植株。2)PCR檢測轉基因小麥植株，提取轉基因小麥TO代植株基因組DNA;每株小麥提取三管，即做三個平行實驗；利用TaAOC基因全長的引物對轉pAHC-TaAOC基因的植株進行 PCR檢測，同時以克隆的目的基因作為陽性對照，未轉基因的小麥基因組DNA為陰性對照， 結果如圖3C。3)對轉基因小麥的花藥與對照進行比較(圖4)，發現轉基因植株的花藥開裂程度較對照組有較大提升，且發現轉基因小麥的花藥開裂率也有明顯提升(表幻，從而說明該基因對花藥的開裂及提高小麥育性都起到了十分重要的作用。表2花藥開裂率的基本統計
權利要求
1.一種調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO. 1 所示。
2.一種調控植物花藥開裂相關基因TaAOC，其特征在于，編碼權利要求1所述的調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC。
3.根據權利要求2所述的調控植物花藥開裂相關基因TaAOC，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 所示。
4.包含權利要求2或3所述調控植物花藥開裂相關基因的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pBI35S-TaA0C或 pAHC-TaAOC。
6.權利要求1所述調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC在調控植物育性方面的應用。
7.—種調控植物花藥開裂的方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求2或3所述調控植物花藥開裂相關基因TaAOC導入植物中并表達的步驟。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC及其基因和應用。本發明提供了一種調控植物花藥開裂相關蛋白TaAOC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發明還提供了編碼上述調控植物花藥開裂相關蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，以及包含該基因的重組載體及其應用。本發明的基因與植物育性相關，能提高植物花藥開裂率和結實率，對于提高糧食產量及二系雜交小麥理論的發展具有十分重要的理論和實際意義。
文檔編號A01H5/00GK102433310SQ20111039474
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者劉澤濤, 單福華, 向群, 唐益苗, 張立平, 張風廷, 趙昌平, 馬驊 申請人:北京市農林科學院