專利名稱：：通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物轉基因技術，尤其涉及一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素antegrin)β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，屬于細胞工程領域。
背景技術：
：口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的羊、豬等偶蹄類動物發生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動物衛生組織將其列為A類烈性傳染病之首。一旦暴發，必須撲殺感染及接觸感染的動物，不僅會造成巨大的直接經濟損失，而且嚴重危害畜牧業的健康發展以及相關產品的對外貿易，對國家的政治、經濟具有深遠的影響。目前，大多數流行FMD的國家以計劃免疫為主的措施預防FMD。盡管新型疫苗不斷涌現，但傳統滅活疫苗仍是預防FMD的基礎。FMDV變異快，血清型多，且不同血清型疫苗之間沒有交叉保護，故通過疫苗免疫的單一手段很難控制和根除FMD。因此，科學家們在注重疫苗研發的同時，開始關注病毒受體在病毒感染過程中的作用，期望通過敲除、沉默或封閉病毒的關鍵受體阻斷病毒的感染，進而達到控制和根除FMD的目的。病毒受體是能夠被病毒識別并與之結合，進而導致病毒感染的宿主細胞表面分子，是病毒宿主特異性和組織嗜性的關鍵因素。FMDV體外感染的受體包括整合素(Integrin)及硫酸乙酰肝素(HSPk)。一些FMDV弱毒及細胞培養適應毒株可利用HSPk感染體外培養的細胞(O'Dormell等，2008)，但HSPk可能只作為一種附屬分子增強其它受體的效率，尚無證據表明其在FMDV野毒株感染細胞過程中起作用(Monaghan等，2005)。整合素αν亞家族成員中ανβ1、ανβ3、ανβ6及ανβ8是FMDV感染體外細胞的表面受體(Gutierrez-Rivas等，2008；Berryman等，2005Jackson等，2000；Goodwin等，2009；Ruiz-Saenz等，2009Johns等，2009)，其中整合素受體β6亞基是啟動FMDV強毒自然感染的關鍵性β受體亞基，原因在于(I)FMDV主要經上呼吸道感染動物，在口咽或相關淋巴組織的上皮細胞起始復制后迅速擴散到口部和蹄部的上皮細胞。在4種整合素受體中，只有ανβ6僅限于FMDV組織嗜性的上皮細胞表面持續且高水平的表達(Berryman等，2005；Monaghan等，2005；Brown等，2006)，感染病毒的上皮細胞可同時檢測出ανβ6和病毒抗原(0'Dormell等，2009)。(2)體外合成的ανβ6可與所有血清型的FMDV結合(Ferris等，200，并且親和力最強(Burman等，2006)，這不僅提高了FMDV的感染率(DiCara等，2008；Duque等，2004)，而且也使β6亞基成為FMDV整合素受體中利用率最高的β亞基(Duque等，2003)。(3)不僅FMDV非敏感細胞轉染β6亞基基因后可被病毒感染(Jackson等，2000)，而且抗β6抗體可抑制受體與病毒間的結合并阻斷病毒感染(Νεζ等，2007Jackson等，2000)。轉基因動物的制作方法主要有逆轉錄病毒法、受精卵原核顯微注射法、精子載體法、ES細胞技術和轉基因體細胞核移植技術等，其中受精卵原核顯微注射法和轉基因體細胞克隆是目前世界各國科學家比較常用的家畜轉基因技術。轉基因體細胞克隆技術是基因組修飾技術與動物體細胞核移植技術有機結合而產生的一種新的轉基因動物制作技術，它部分地克服了傳統轉基因動物外源基因整合率低、大動物生產成本高的技術瓶頸，代表當前轉基因動物制作的主流方向，利用該方法已經相繼克隆出轉基因牛、山羊和豬等。基因打靶是在胚胎干細胞和同源重組技術基礎上產生的，是改變生物體遺傳信息的轉基因技術，包括通過同源重組將外源基因/修飾的自身基因定點整合到受體細胞基因組(knockin)及將宿主細胞特定基因區段敲除(knockout)。該技術在小鼠轉基因中被廣泛應用，但是，由于大動物沒有公認的家畜ES干細胞系而無法在ES干細胞水平上進行基因打靶，1997年多莉羊的誕生為體細胞基因打靶制備轉基因動物開辟了新的途徑。用體細胞介導的基因打靶技術制備轉基因動物突出的優點是(1)可以避開復雜的ES細胞技術；(2)可以不經過嵌合體中間步驟；C3)可以控制轉基因動物性別；(4)能夠在體細胞體外培養水平進行整合篩選和基因打靶，因而可以顯著降低制備轉基因動物，特別是轉基因家畜的成本，在生物
技術領域：
具廣闊前景。盡管體細胞體外培養傳代的有限性是體細胞基因打靶研究的難點并且成功率低，但是近年來體細胞基因打靶研究也獲得了一些突破性進展。2000年，McCreath等首次將α-抗胰蛋白酶(AAT)基因定位整合到綿羊胎兒成纖維細胞的al原膠原基因座上，獲得了AAT較高表達水平的轉基因克隆綿羊。隨后，國內外科學家相繼利用體細胞克隆和基因打靶手段研制出不同的轉基因動物。Yu等Q006)報道利用基因打靶技術獲得敲除了朊病毒一個PrP基因位點的體細胞克隆山羊，經過3個月觀察這些基因敲除羊沒有異常表現。Richt等Q007)利用基因打靶技術滅活牛的PRNP基因，獲得生長發育正常、存活2年以上的轉基因牛，它們能夠很好地抵抗瘋牛病的傳染。參考文獻1.BerrymanS,ClarkS,MonaghanP,JacksonΤ.EarlyEventsinIntegrinαVβ6-MediatedCellEntryofFoot-and-MouthDiseaseVirus,JVirol.,2005,79(13):8519-34.2.BurmanA,ClarkS,AbresciaNG,FryEE,StuartDI,JacksonT.SpecificityoftheVPlGHloopofFoot-and—MouthDiseasevirusforalphavintegrins,JVirol.,2006,80(19):9798-810.3.BrownJK,McAleeseSM,ThorntonEM,PateJA,SchockA,MacraeAl,ScottPR,MillerHR,CollieDD.(2006).Integrin_alphavbeta6,aputativereceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,isconstitutivelyexpressedinruminantairways,JHistochemCytochem.,54(7):807-16.4.DicaraD,BurmanA,ClarkS,BerrymanS,HowardMJ,HartIR,MarshallJF,JacksonT..Foot-and-mouthdiseasevirusformsahighlystable,EDTA—resistantcomplexwithitsprincipalreceptor,integrinalphavbeta6implicationsforinfectiousness,JVirol.,2008,82(3):1537-46.5.DuqueHandBaxtB.Foot-and-mouthdiseasevirusreceptors-comparisonofbovinealpha(V)integrinutilizationbytypeAand0viruses,JVirol.,2003,77(4):2500-11.6.DuqueH，LaRoccoM，GoldeWT,BaxtB.Interactionsoffoot-and-mouthdiseaseviruswithsolublebovinealphaVbeta3andalphaVbeta6integrins，JVirol.，2004，78(18):9773-81.7.FerrisNP,AbresciaNG,StuartDI,JacksonT，BurmanA，KingDP，PatonDJ.Utilityofrecombinantintegrinalphaνbeta6asacapturereagentinimmunoassaysforthediagnosisoffoot-and-mouthdisease，JVirolMethods.，2005，127(1):69-79.8.GoodwinS，TuthillTJ，AriasA，KillingtonRA，andRowlandsDJ.Foot-and-mouthdiseasevirusassembly!processingofrecombinantcapsidprecursorbyexogenousproteaseinducesself-assemblyofpentamersinvitroinamyristoyIation-dependentmanner.JVirol.，2009，83(21):11275-82.9.Gutierrez-RivasMiPulidoMR，BaranowskiE,SobrinoF,SaizM.Tolerancetomutationsinthefoot-and-mouthdiseasevirusintegrin-bindingRGDregionisdifferentinculturedcellsandinvivoanddependsonthecapsidsequencecontext,JGenVirol.，2008，89(10):2531-9.10.JacksonT，SheppardD，DenyerM，BlakemoreW,KingAM.Theepithelialintegrinalphavbeta6isareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus,JVirol.，2000,74(11):4949-56.11.JohnsHL,BerrymanS，MonaghanP，BelshamGJ,JacksonT.Adominant-negativemutantofrab5inhibitsinfectionofcellsbyfoot-and-mouthdiseasevirusamplicationsforvirusentry,JVirol·，2009，83(12):6247-56.12.MonaghanP，GoldS,SimpsonJ,ZhangZ,WeinrebPH,VioletteSM,AlexandersenS，JacksonT·TheαVβ6integrinreceptorforFoot-and-mouthdiseasevirusisexpressedconstitutivelyontheepithelialcellstargetedincattle，JGenVirol.，2005，86(Pt10):2769-80.13.NiinezJIMolinaN,BaranowskiE，DomingoE，ClarkS，BurmanA,BerrymanS，JacksonT，SobrinoF.Guineapig-adaptedfoot-and-mouthdiseaseviruswithalteredreceptorrecognitioncanproductivelyinfectanaturalhost，JVirol.，2007,81(16):8497-506.14.0丨DonnellV，LaroccoΜ,BaxtB.Heparansulfate-bindingfoot-and-mouthdiseasevirusenterscellsviacaveola-mediatedendocytosis,JVirol.，2008，82(18):9075-85.15.0'DonnellV，PachecoJM，GreggD，BaxtB.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevirusintegrinreceptorexpressionintissuesfromnaiveandinfectedcattle，JCompPathol.,2009,141(2-3):98-112.16.RichtJA,KasinathanP，HamirAN，CastillaJ，SathiyaseelanT，VargasF，SathiyaseelanJ，WuH，MatsushitaH，KosterJ，KatoS，IshidaI，SotoC，RoblJM,KuroiwaY.Productionofcattlelackingprionprotein，NatBiotechnol，2007，25(1):132-138.17.Ruiz-SaenzJ,GoezY,TabaresW,Lopez-HerreraA.Cellularreceptorsforfootandmouthdiseasevirus,Intervirology,2009,52(4):201-12.18.SchniekeAE,KindAJ,RitchieWA,MycockK,ScottAR,RitchieM,WilmutI,ColmanA,CampbellKH(1997).HumanfactorIXtransgenicsheepproducedbytransferofnucleifromtransfectedfetalfibroblasts,Science,278(5346)2130-2133.19.YuGH,ChenJQ,YuHQ,LiuSG,ChenJ,XuXJ,ShaHY,ZhangXF,WuGX,XuSFandChengGX(2006).Functionaldisruptionoftheprionproteingeneinclonedgoats(J).JournalofGeneralVirology,87:10191027.
發明內容針對上述現有技術，本發明的發明人進行了研究，研究表明，整合素β6亞基基因被替換或敲除的雜合子或純合子轉基因羊或豬，低表達或不表達口蹄疫病毒受體β6亞基，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。因此，通過敲除整聯蛋白β6亞基的方法是獲得抗FMD的轉基因羊或豬的最佳方法之一。本發明的目的是提供一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法。通過本發明的方法獲得的轉基因羊或豬低表達(雜合子)或不表達(純合子)口蹄疫病毒受體整合素β6亞基，其FMDV感染率明顯下降。本發明是通過以下技術方案實現的一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，是將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染羊或豬的胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導入羊或豬的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕羊或豬的子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉基因羊或豬。還包括以下方法雜合子轉基因羊或豬經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因羊或豬；或雜合子轉基因公畜和雜合子轉基因母畜正常交配繁殖而獲得純合子轉基因羊或豬。所述羊為綿羊或山羊等。所述羊或豬胎兒成纖維細胞為3550日齡胎兒不同組織來源的成纖維細胞，包括耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞，優選皮膚成纖維細胞。所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染羊或豬胎兒成纖維細胞方法為電轉染法、脂質體轉染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法，優選脂質體轉染法。所述脂質體轉染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于lyg/yL，DNA脂質體LTX=1:3。所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的核供體細胞核導入羊或豬的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。所述去核卵母細胞不帶有第一極體。本發明利用同源重組和體細胞克隆的方法將線性化的攜帶有突變的整合素β6亞基基因的第一次打靶載體轉染羊或豬胎兒成纖維細胞，獲得整合素β6亞基基因敲除的核供體細胞，將其細胞核導入羊或豬的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕羊或豬的子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因羊或豬。雜合子轉基因羊或豬經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因羊或豬。用本方法獲得的轉基因羊或豬低表達(雜合子)或不表達(純合子)口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因，使FMDV感染率明顯下降，具備了抗FMD的能力。本發明打破了傳統的通過免疫學手段預防FMD的思維模式，為控制和消滅羊和豬FMD開辟了新的途徑，具有較高的實用價值和廣闊的市場前景。圖1為體細胞克隆整合素β6亞基基因被敲除的轉基因羊和豬的生產流程圖。圖2為綿羊整合素β6亞基基因打靶載體的構建示意圖。圖3為整合素β6亞基基因左側同源臂重組克隆質粒酶切鑒定結果，其中，M:DLmarkerlO,OOO1:NotI/Sall酶切pRui_S_β6-Left重組載體；2:NotI/Sall酶切pRui空載體對照。圖4為整合素β6亞基基因右側同源臂重組克隆質粒酶切鑒定結果，其中，M:DLmarkerlO,OOO；1:XhoI/EcoRI酶切pMD19_Right重組載體；2:XhoI/EcoRI酶切pMD19_T空載體。圖5為整合素β6亞基基因第一次打靶載體的質粒酶切鑒定結果，其中，M:DLmarkerlO,000；1:XhoI/EcoR酶切pRui-S-β6鑒定羊右臂；2:NotI/SalI酶切pRui-S-β6鑒定羊左臂。圖6為用于β6基因發生第一次同源重組PCR鑒定方法中陽性模板質粒的酶切鑒定結果，其中，M:DLmarker10，000；1.NotI和Sail酶切pRui對照；2.NotI和SalI酶切鑒定pRui-Yang-modelο圖7為轉基因綿羊雜合子胎兒成纖維細胞PCR鑒定結果，pRui-S-β6打靶綿羊胎兒成纖維細胞后形成的單克隆，在跨Left小臂的引物Py-l，Py-2，Py-3，Py-4的引導下，PCR分別擴增3085，3344bp的片段。其中，1為陰性對照、2，3為陽性對照、4_11為未打靶成功的克隆細胞、12-15為兩組打靶成功的同源重組陽性克隆細胞。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步的說明。下述實施例中無特別說明均為常規方法，所用試劑及藥品如無特別說明均購自Sigma公司。實施例1體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因綿羊的生產及分子生物學檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的雜合子轉基因綿羊的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的第一次打靶載體的構建整合素β6亞基基因敲除第一次打靶載體的構建如圖2所示，具體方法如下以綿羊胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pL-upper5，-ATAAGAATGCGGCCGCGCGAGAACTGAAACGGATG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶NotI的識別位點)禾口弓I物pL-lower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶SalI的識別位點)引導下，PCR克隆片段為1979bp片段，反應條件為94°C30s；94°C20s55°C20s68°C2min，25個循環；68°C5min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收1979bp片段，TA克隆至pEASY-T3(北京全式金公司)載體上，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，經藍白斑篩選后搖菌，提取質粒。酶切鑒定出含有Left片段的pT3_Left重組質粒，用NotI和MlI酶切該質粒后回收Left片段，并與經相同酶切的載體pRui連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-S-i36_Left(圖幻，該載體包含有^iteginbeta6基因第一內含子區和第三外顯子區。以綿羊胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物pR-upper5，-CCGCTCGAGAAAGAAGTGGAGGTGAACAGC-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶XhoI的識別位點)禾口弓I物pR-lower5，-CCGGAATTCTGCAGTTACAGTACTCTCCTGTC-3‘(帶下劃線的堿基為限制性內切酶EcoRI的識別位點)引導下，PCR克隆片段為5584bp片段，反應條件為94°C30s；94°C20s55°C20s68°C%iin，25個循環；68°C7min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收5584bp片段，TA克隆至pMD19-T(Takara公司)載體上，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，經藍白斑篩選后搖菌，提取質粒，酶切鑒定出含有Right片段的菌落命名為pMD19-Right(圖4)，將pMD19-Right用上面的引物進行擴增，XhoI和EcoRI酶切后回收Right片段與經相同酶切的載體pRUI-S-i36-Left連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-S-β6，通過XhoI和EcoRI,NotI和SalI分別雙酶切pRui-S-β6，檢測結果顯示Left同源臂與Right同源臂片段均已插入pRui-S-i36中(圖5)。pRui-S_i36經序列分析表明，載體上分別插入了綿羊的hteginbeta6的兩條基因片段。將載體pRui-S_06經過限制性內切酶NotI線性化，用TaKaRaDNAFragmentPurificationKitVer.2.O(TaKaRa公司)回收濃縮純化14.9kp的線性片段，將其溶解在無菌的超純水中，-20°C保存。目前GenBank中尚無羊的整合素β6亞基基因序列，只有該基因所編碼的mRNA(匪001113772)被公布，在與mRNA序列比對的同時，我們將所獲得的部分羊的整合素β6亞基因序列與牛整合素β6亞基基因序列(NW001494599)進行了比對，并對我們的pRui-S-i36打靶載體進行了分析。5’端第7-1986位核苷酸序列為推測的hteginbeta6基因第一內含子區和第二、第三外顯子區與第二、第三內含子區；第1987-2020位核苷酸序列為Loxp位點；第2021-3840位核苷酸序列為PGK-Neo序列’第3841-3874位核苷酸序列為Loxp位點；第3881-9465位核苷酸為推測的^iteginbeta6基因i^一外顯子區，i^一內含子區和十二外顯子區；第9466-11791位核苷酸序列為PGK-TK序列，見序列表1。pRui-S_i36打靶后，綿羊hteginbeta6基因的第三內含子區至第十內含子將被PGK-neo基因所替換。2.羊胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選用30-35日齡的綿羊胎兒，用70%酒精清洗包被綿羊胎兒的羊膜數次后，刺穿羊膜，取出綿羊胚胎，于PBS液中洗數遍，取胎兒皮膚組織，剪碎成小塊(體積小于Imm3)，再用PBS洗2遍后，加入IOmL的膠原酶和胰蛋白酶混合液37°C消化20-40min后，加入20mL含10%胎牛血清的DMEM:F12營養液分散，IOOOrpmlOmin，再加入10%胎牛血清的DMEM:F12營養液重新懸浮，細胞計數，按3.OXlO5的細胞量接種于IOOmm的培養皿中，37°C、5%CO2的培養箱中培養2-3d，待細胞生長至單層后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，液氮保存(凍存液成分為80%DMEM:F12，10%FBS和10%DMSO)，獲得羊胎兒皮膚成纖維細胞系。3.羊胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和篩選處于對數生長期的羊胎兒皮膚成纖維細胞，用Opti-MEM洗1次細胞，將載體DNA線性化后，濃縮濃度不低于1μg/μL，經脂質體LTX轉染細胞(DNA脂質體LTX=1:3)，Mh后加入700μg/mLG418和8μΜGancvilor作為篩選壓力進行篩選，每3d換液1次，IOd后用0.25%胰蛋白酶消化形成的克隆細胞，培養2-3代，期間取部分細胞進行鑒定，其余細胞液氮保存、備用。4.卵母細胞的成熟培養將取自周邊地區屠宰場的成年綿羊的卵巢，用30°C的生理鹽水清洗3遍后，用20G的針頭抽取直徑為l_5mm的卵泡，回收形態均勻、多層卵丘細胞緊密包圍的、呈現明顯放射冠的的卵丘-卵母細胞-復合體，將其用成熟液(M199培養液中添加10%FBSUOmmol/LNaHC03、10mg/mLoFSH(Ovagen,ICP,NewZealand)>lmg/mLοLH(ICP)>lmg/mLestradiol、0.ImMcysteamine、50mg/mLkanamycin)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細胞-復合體移入已在二氧化碳培養箱中至少平衡了池的成熟培養液滴中(上有液體石蠟覆蓋)，置于39°C、5%CO2的培養箱中培養17-19h，將成熟的卵母細胞放入含0.透明質酸酶的管內振蕩2-aiiin后，用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞和卵母細胞完全脫離，選擇形態完整，細胞質均勻，并排出第一極體的成熟的卵母細胞為胞質受體。5.核移植和克隆胚胎的體外培養將步驟4獲得的第一極體的卵母細胞移入操作液(M199培養液中添加10%FBS,7.5μg/mL細胞松弛素B)中，在200倍顯微鏡下用玻璃針于極體上方的透明帶切一小口，再用內徑20μm的玻璃管將第一極體及其下方的卵母細胞的染色體一并吸除，再用含20%的FBS的M199液體培養基洗3遍，置于38.5°C,5%CO2的培養箱中備用。將步驟3獲得的轉基因細胞活化至長滿單層，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮細胞，離心去上清，再加微量的營養液懸浮，用玻璃針選擇胎兒皮膚成纖維細胞的細胞核，用20μm的玻璃管將其移入去核的卵母細胞的透明帶內，然后將其放入0.3M甘露醇、0.05mMCaCl2、0.ImMMgSO4,0.5mMHEPES及0.05%FAF-BSA的溶液中，3-5min后放入融合槽內，轉動卵母細胞使供體細胞核與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.^KV/cm、脈沖時間為16msec、脈沖次數為2次的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)，IOmin后，體視鏡下鏡檢，確認供體細胞與卵母細胞膜的融合。將融合胚胎移入預先平衡好的SOFaaBSA+Smg/mlFAF-BSA溶液中，于38.5°C，5%CO2培養箱培養。放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進行下一步的激活處理，重構胚胎在early-SOF溶液培養36h后，移入HSOF+lmg/mlFAF-BSA溶液中沖洗并保留在此溶液中lOmin，然后，將其移入新鮮配置的HS0F+5μMIonomycin+lmg/mlFAF-BSA溶液中，于37°C激活^iin，迅速移入HS0F+30mg/mlFAF_BSA溶液沖洗三遍并保存在其中，從移入該溶液起計時5min后，再將重構胚胎轉到S0FaaBSA+10%FBS+2mM6-DMAP溶液中繼續培養4h。綿羊克隆胚胎體外培養體系為S0FaaBSA+8mg/mlFAFBSA(Wellsetal,1998)和lateSOF(96h前，用Esof;96h后，用LSOF，Wellsetal,1999)培養液，在39°C，7%O2,5%CO2和88%隊條件下培養，分別于對、48、和統計卵裂率、細胞期胚胎和桑椹胚發育率。在earlySOF培養邪h后，再轉移到新鮮配制的later-SOF液滴繼續培養，第7-8天時統計囊胚發育率和觀察囊胚的發育狀況。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚采用子宮手術移植移入已同期的受體綿羊的子宮內。移植后立即肌肉注射黃體酮ang/只，在移植后的第40d對受體綿羊進行B超檢測以確定受胎情況，并在移植后的第60d和90d進行超聲波檢測以確定妊娠率。共移植受體綿羊34頭，移植60d后的超聲波檢測表明，其中12頭懷孕。手術取2個胎兒進行鑒定，均為轉基因陽性，制備成纖維細胞，一部分用于體細胞克隆制備雜合子轉基因綿羊，一部分用于二次打靶和體細胞克隆制備純合子轉基因綿羊。7.轉基因雜合子陽性細胞、胎兒及克隆牛的分子生物學鑒定(I)PCR鑒定1)用于PCR鑒定的β6基因發生第一次同源重組的陽性模板質粒的構建以綿羊胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物Y-pLeftupper-18175，-ATAAGAATGCGGCCGCGATCAGAGAGGCTGCGACTG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶NotI的識別位點)與弓丨物Y-pLeftlower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3‘的引導下，PCR克隆片段為3996bp片段，反應條件為94°C30s-MV20s55°C20s68°C:3min，25個循環；68°C7min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。將該片段用NotI和酶切后回收與經相同酶切的載體PRui連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-Yang-model(圖6)，該質粒包含第一次打靶質粒PRui-S-β6的左側同源臂和報告基因neo，分別在pRui-Yang-mode1base1900-1922位點設計上游引物Pyang-I:5，-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3，，在PGK-neo開放閱讀框，pRuilang-model:base5039_5058上設計下游引物Pyang-25，-CTTCCTCGTGCTTTACGGTATC-3，，PCR擴增產物為3158bp，可做pRui-S-β6打靴后發生同源重組的細胞/胎兒/轉基因綿羊跨越式PCR鑒定的模板。2)發生同源重組的跨越式PCR鑒定以經pRui-S-β6打靶獲得的綿羊胎兒成纖維neo抗性克隆、轉基因克隆胎兒或轉基因綿羊的基因組DNA為模板，在用于PCR鑒定的β6基因發生同源重組的陽性模板質粒的構建中的引物Pyang-1，Pyang-2的引導下，PCR擴增3158bp的片段為同源重組陽性。PCR反應條件94°C30s；94°C20s55°C20s68°C3min，；35個循環；68°C7min。轉基因綿羊胎兒成纖維細胞鑒定結果如圖7所示，M:DLmarker10，000(Takara公司)，第1泳道為以非轉基因綿羊成纖維細胞DNA為模板的陰性對照，第2泳道為發生同源重組的陽性模板質粒pRui-Yang-model，第3-14泳道為單克隆細胞基因組DNA，其中第11和13泳道為同源重組陽性轉基因細胞，將其依次命名為Yang-5、Yang-23，其余均為陰性。(2)Southern雜交鑒定取約IOyg轉基因克隆綿羊胎兒或新生綿羊耳部組織的基因組DNA，用限制性內切酶EcoSlI酶切消化，30V低壓電泳，轉膜后，進行Southern雜交。雜交所用探針為利用rediprimerIIrandomprimerlabelingsystem(amersham)、由[α-32P]dCTP同位素標記的、經限制性內切酶MlI和》10I酶切消化的PRUI載體neo基因(報告基因)回收產物，以普通荷斯坦奶牛胎兒或新生犢牛的基因組DNA作為陰性對照，雜交陽性信號為91Λ片段。(3)Real-timeRT-PCR鑒定利用Trizol(Invitrogen)提取正常和轉基因綿羊胎兒或新生綿羊的甲狀腺或舌上皮組織總RNA，按TaKaRAaRNAPCRKit(AMV)Ver3.O反轉錄試劑盒說明書操作步驟反轉錄，得到cDNA模板。反轉錄體系為MgC122.0μ1,IOXRTBufferΙ.Ομ1,dNTPMixture1.Oμ1,RNAseInhibitor0.25μ1,RNAseFreedH203.75μ1,AMVReverseTranscriptase0.5μ1,提取RNA1.Ομ1,Oligo(dT)0.5μ1,總體系10.Oμ1。在上游引物PRT55‘-GTTGGGGGTTTCGCTGGCTATTC-3‘和下游引物PRT65‘-TGGAGCCTCTGTACAGTGGAT-3‘的引導下，RealTimePCR擴增β6片段為160bp；在上游引物PRT35‘-TGCCCTGAGGCTCTCTTCC-3‘和下游引物PRT45'-GCGTAGAGGTCTTTGCGGATGT-3‘的引導下，RealTimePCR擴增β-actin片段115bp。RealTimePCR反應條件是95°C30s；95°C5s,60°C31s，40個循環。根據其擴增和融解曲線，制作PCR定量標準曲線，通過求其平均值可以分析出轉基因胎兒或新生綿羊β6基因表達的變化。8.轉基因綿羊的FMDV攻毒實驗(1)綿羊半數感染量(ID5tl)的測定選取未接種FMD疫苗、無FMDV中和抗體、6月齡綿羊16頭，分成4組，每組4頭，分別在舌上表面皮內接種兩個點(每點接種0.11^)，病毒接種劑量分別為0、105、106和IO7TCID50,觀察8天，未接種病毒的對照組不發病，接種病毒的實驗組綿羊表現為蹄、口腔及其周圍和母畜的乳頭等部位出現水泡。統計發病綿羊的數量，按照Reed-Muench方法計算ID50,該組織培養毒的ID5tl為3X106。(2)轉基因綿羊的FMDV攻毒實驗選取未接種FMD疫苗、無FMDV中和抗體、6月齡左右正常及轉基因綿羊各8頭，分為4組，每組4頭。正常及轉基因綿羊中，各有一組不接種病毒，另一組分別在舌上表面皮內接種兩個點(每點接種0.ImL)，病毒接種劑量為IOOID5tl，觀察8天。未接種病毒的對照組不發病，接種病毒的正常綿羊組綿羊全部發病，統計轉基因發病綿羊的數量并與正常組發病綿羊的癥狀進行比較，計算發病率。實施例2體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉基因綿羊的生產及分子生物學檢測體細胞克隆整合素β6亞基基因敲除的純合子轉基因綿羊的生產流程如圖1所示，具體過程包括如下步驟1.整合素β6亞基基因敲除的二次打靶載體的構建在整合素β6亞基基因敲除第一次打靶載體的基礎上用報告基因GFP替換neo，獲得第二次打靶載體。具體方法如下以pRui為模板，在引物Y-pGKlupper5，-CGGGGTACCCTCGAGATAACTTCGTATAGCATAC-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶KpnI的識別位點)與引物Y-pGKllower5’-TGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATATTGGCTGCAGGTCGAAAG-3’(帶下劃線的堿基為GFP基因5’序列)的引導下，PCR克隆片段為556bp的Y_pGK啟動子片段；以Y_pEGFP_Nl為模板，在引物Y-pGFPupper5’CCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3’(帶下劃線的堿基為PGK啟動子3’序列)與引物Y-pGFPlower5’TTCTGCAGACTTACAGCGGATCCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’(帶下劃線的堿基為pGK終止子5’序列)，PCR克隆片段為700bp的GFP基因片段；以pRui為模板，在引物Y-pGK2upper5，-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGGGATCCGCTGTAAGTCTGCAG-3’與引物Y_pGK2lower5，TTCGAACTCGACGGTATCGAGCTTCTGATGG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶BspT104I的識別位點)PCR克隆片段為513bp的pGK終止子片段。將純化的556bpPCR產物與700bpPCR產物混合作為兩步法PCR反應的拼接模板，在引物Y-pGKlupper與引物Y-pGFPlower的引導下，獲得1231bp的PCR產物。反應條件為:94V30s；94°C20s56°C20s68°Clmin，25個循環；68°C5min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收1231bp片段；以純化的1231bpPCR產物與51!3bpPCR產物混合作為兩步法PCR反應的拼接模板，在引物Y-PGK1upper與引物Y_pGK21ower的引導下，PCR克隆1736bp片段，將該片段用KpnI和BspT104I酶切后回收該片段與經相同酶切的載體pRui_S-β6回收13863bp片段連接，然后將連接產物轉化E.C0liDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-Yang-GFP-β6(序列2)。2.雜合子轉基因綿羊胎兒皮膚成纖維細胞系的建立選取40日齡的實施例1中獲得的雜合子轉基因胎兒，其胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法與實施例1綿羊胎兒皮膚成纖維細胞系的制備方法相同。3.雜合子轉基因綿羊胎兒皮膚成纖維細胞的脂質體轉染和篩選處于對數生長期的雜合子轉基因綿羊胎兒皮膚成纖維細胞，用Opti-MEM洗1次細胞，將二次打靶載體pRui-Yang-GFP-β6線性化后，濃縮濃度不低于1μg/μL，經脂質體LTX轉染大量細胞，Mh后培養液中含有700μg/mLG418和8μΜGancvilor，每3d換液1次，后用0.25%胰蛋白酶消化細胞并進行流式細胞分選，含有GFP的細胞接種于細胞培養皿中，100個細胞/培養皿，用700μg/mLG418和8μΜGancvilor繼續進行正負篩選，培養IOd后，在熒光倒置顯微鏡下挑選有綠色熒光的細胞克隆(具備G418和Gancvilor抗性且產生綠色熒光的細胞可能是β6基因敲除的純合子細胞)，擴繁2-3代，期間取部分細胞進行鑒定，其余細胞液氮保存、備用。4.卵母細胞的成熟培養、去核與實施例1卵母細胞的成熟培養、去核方法相同。5.核移植和克隆胚胎的體外培養與實施例1核移植和克隆胚胎的體外培養方法相同。6.胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體綿羊的子宮角內。在移植后的第30d、60d和90d對受體綿羊進行B超檢測以確定受胎情況。7.轉基因純合子陽性細胞及克隆綿羊的分子生物學鑒定(I)PCR鑒定1)用于PCR鑒定的第二條染色體β6基因發生同源重組的陽性模板質粒的構建以綿羊胎兒成纖維細胞的基因組DNA為模板，在引物Y-pLeftupper-18175，-ATAAGAATGCGGCCGCGATCAGAGAGGCTGCGACTG-3，(帶下劃線的堿基為限制性內切酶NotI的識別位點)與弓丨物Y-pLeftlower5，ACGCGTCGACGGGCACTTTGTTAGACTGA-3‘的引導下，PCR克隆片段為3996bp片段，反應條件為94°C30s-MV20s55°C20s68°C3min，25個循環；68°C7min。反應結束后對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段。將該片段用NotI和酶切后回收與經相同酶切的載體pRui連接，然后將連接產物轉化E.coliDH5α，挑取單菌落搖菌、提質粒，并進行酶切和測序鑒定，得到含有目的片段的重組載體，命名為pRui-Yang-model-2，在pRui-Yang-model-2base1900-1922設計上游引物Pyang-I:5，-TTCCCTAGCCTGCCTTCTATTAT-3，(同pRui-Yang-model)，在pGK-GFP開放閱讀框上base5106_5125設計下游引物Pyang-45，-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3，，可做二次打靶載體pRui_GFP_β6打靶后發生同源重組的細胞/轉基因綿羊跨越式PCR鑒定的模板。2)β6基因敲除純合子的跨越式PCR鑒定以二次打靶獲得的綿羊胎兒成纖維neo抗性及綠色熒光克隆或轉基因綿羊的基因組DNA為模板，跨越式PCR鑒定引物Pyang-I和Pyang-2及Pyang-I和Pyang-4的分別引導下，PCR擴增3158bp及3225bp的片段分別為第一次和第二次同源重組陽性。PCR反應條件94°C30s;94°C20s55°C20s68°C3min，35個循環；68°C7min。(2)Southern雜交鑒定取約10μg轉基因克隆綿羊胎兒組織或轉基因綿羊耳部組織的基因組DNA，以綿羊基因組DNA作為陰性對照，用限制性內切酶EcoSlI酶切消化，30V低壓電泳，轉膜后，進行Southern雜交。雜交所用探針分另U為禾[I用rediprimerIIrandomprimerlabelingsystem(amersham)、由[α-32P]dCTP同位素標記的、經限制性內切酶Mil和XhoI酶切消化的pRUI載體neo基因或pRui-GFP-β6載體GFP基因回收產物，第一次打靶(β6被neo基因替換)的雜交陽性信號為91Λ片段，第二次打靶(β6被GFP基因替換)的雜交陽性信號為8.Skb片段。(3)Real-timeRT-PCR鑒定與實施例IReal-timeRT-PCR方法相同。8.轉基因綿羊的FMDV攻毒實驗與實施例1轉基因綿羊的FMDV攻毒實驗方法相同。權利要求1.一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于是將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染羊或豬的胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導入羊或豬的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕羊或豬的子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉基因羊或豬。2.根據權利要求1所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于，還包括以下方法雜合子轉基因羊或豬經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因羊或豬；或雜合子轉基因公畜和雜合子轉基因母畜正常交配繁殖而獲得純合子轉基因羊或豬。3.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述羊為綿羊或山羊。4.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述羊或豬胎兒成纖維細胞為3550日齡胎兒不同組織來源的成纖維細胞。5.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述羊或豬胎兒成纖維細胞為耳成纖維細胞、皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞或卵丘細胞。6.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染羊或豬胎兒成纖維細胞方法為電轉染法、脂質體轉染法、病毒載體法或磷酸鈣沉淀法。7.根據權利要求6所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染羊或豬胎兒成纖維細胞方法為脂質體轉染法。8.根據權利要求7所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述脂質體轉染法的條件為線性化的載體DNA濃度不低于1μg/μL，DNA脂質體LTX=13。9.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的核供體細胞核導入羊或豬的去核卵母細胞的方法為顯微注射法。10.根據權利要求1或2所述的通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，其特征在于所述去核卵母細胞不帶有第一極體。全文摘要本發明公開了一種通過敲除口蹄疫病毒受體整合素β6亞基基因獲得抗口蹄疫轉基因羊或豬的方法，是將線性化的攜帶有報告基因的突變的整合素β6亞基基因的打靶載體轉染羊或豬的胎兒成纖維細胞，通過同源重組獲得替換整合素β6亞基基因的核供體細胞，將核供體細胞核導入羊或豬的去核卵母細胞中得到重構胚，再將重構胚移入代孕羊或豬的子宮中，得到的子代即為整合素β6亞基基因被敲除的雜合子轉基因羊或豬。雜合子轉基因羊或豬經二次打靶和體細胞克隆獲得純合子轉基因羊或豬。用本方法獲得的轉基因羊或豬低表達或不表達口蹄疫病毒受體整合素β6亞基，使FMDV感染率明顯下降，其具備了抗FMD的能力。文檔編號A01K67/027GK102492685SQ20111039862公開日2012年6月13日申請日期2011年12月5日優先權日2011年12月5日發明者仲躋峰,何洪彬,侯明海,劉藍,呂洋,孫濤,宋玲玲,楊宏軍,武建明,王洪梅,高運東申請人:山東省農業科學院奶牛研究中心