專利名稱：以根為外植體的諾麗愈傷組織的誘導及植株再生的方法
以根為外植體的諾麗愈傷組織的誘導及植株再生的方法
技術領域
本發明屬于用植物的外植體離體培養的方法，特別是諾麗的外植體離體培養的方法。
背景技術：
諾麗(ifori/^a ciiri/Wia)是一種生長于熱帶、亞熱帶的茜草科巴戟天屬的常綠小喬木或灌木。諾麗是一種天然的水果，營養成分十分豐富，包含了人體所需的幾乎所有的營養元素。諾麗在全球范圍內的分布地區十分稀少，我國諾麗資源短缺，僅分布于海南及西沙群島、臺灣，近年在云南熱帶地區引種栽培。諾麗離體再生體系的建立對于后續的基因工程操作非常重要，但國內外的研究大多還停留在引種育苗階段，國內外鮮見離體再生方面的報道。“諾麗(Morinda citrifolia L.)離體快速繁殖研究”是我們在中國知網CNKI數據庫所檢索到的文章，按照該文取諾麗種子發芽后，胚的子葉和下胚軸作為實驗材料，并根據其介紹的方法，我們反復實驗了 3次均未誘導出愈傷組織。而對諾麗的愈傷組織誘導及植株再生進行研究，將可為產業化方式諾麗離體快速繁殖和后續的諾麗基因工程研究奠定 ■石出。發明內容
本發明目的是以諾麗試管苗的根為外植體，在添加不同濃度6-BA的MS培養基上進行離體培養，進行諾麗離體快速繁殖，提供一種諾麗的愈傷組織誘導及植株再生的方法。
本發明的目的通過以下方式實現，步驟包括(1)愈傷組織的誘導將諾麗無菌苗的根切下，剪成0. 5cm Icm的小段作為外植體，輕輕接入培養基中， 并使外植體充分與培養基接觸，培養基為MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 5mg/L 6-BA，接種約15天陸續形成細小顆粒狀愈傷，顏色呈土黃色或綠色，硬度適中；(2)愈傷組織上不定芽的誘導20天時觀察，愈傷組織上陸續分化出不定芽，待不定芽長到約Icm時將其切下，于MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA或MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉) +1. 5 mg/L 6-BA下培養35天 40天；(3)不定芽的再生當步驟(2)中長出的不定芽長到Icm 2cm時，將其剪下，接入MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA的中培養約30天；(4)壯苗生根從步驟(3)培養得到的健壯植株中，切取莖尖或長約1 cm的其它帶芽莖段，接種于MS 培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+0. 3 mg/L NAA中誘導生根，培養30 50天，得到完整植株；(5)移栽將諾麗根系已發育良好的培養瓶移至遮光率75%的溫室中煉苗7天后，從培養瓶中移出諾麗試管苗，洗去瓊脂，剪去根部附近的葉片，移植到苗盤中，適量噴水保持葉片及土壤濕潤，在自然光照下正常管理；以上MS培養基pH值為5.8 ；培養基均在1. 1 kg/cm2的壓力、121 °C下滅菌20 min ；愈傷組織的誘導培養試驗均在25士2°C和2000 Ix光照強度下進行，每天光照12h。
所述的方法進一步是將步驟(1)培養誘導約觀天的愈傷組織顆粒轉入MS (附加 3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 5mg/L 6-BA培養基上進行愈傷組織的繼代培養，再按照以上所述的步驟(2) (5)進行操作。
本發明具有的效果和意義是多數植物在離體培養誘導愈傷組織時，通常需要添加NAA、IAA、2，4-天等多種生長調節劑。由于本發明取諾麗試管苗的根部為外植體，根部自身含有較多的生長激素，為離體培養的外植體提供了植物個體正常發育的生物學基礎。因而，本發明在MS培養基只加入6-BA 一種生長調節劑，也能對根部愈傷組織產生誘導，得到數量較多、質量較好的愈傷組織。并且，在6-BA的三個濃度梯度中，高濃度的6-BA更利于誘導諾麗根部愈傷組織。特別是當采用6-BA濃度為1. 5 mg/L時，對根部愈傷組織達到95. 65%的誘導率，且時間較短，只需要15 天左右就開始有愈傷組織的發生。
在愈傷組織誘導發芽試驗中，愈傷組織在6-BA濃度較高的培養基中培養，發芽率也較高，說明6-BA濃度高有利于芽的分化；這是由于在上一步驟中6-BA濃度較高的培養基誘導出的愈傷組織質量較好，因此，在誘導發芽中有利于芽的分化。另外，愈傷組織在不更換新鮮培養基、置于原培養基中持續培養的情況下，40天左右，愈傷組織上也能陸續分化出小芽，但發芽率較低。
本發明從根的愈傷組織的誘導、不定芽的誘導、壯苗生根到移栽獲得諾麗完整植株，整個過程大約4個月，與目前已知的以諾麗種子發芽后的胚子葉和下胚軸為實驗材料的諾麗離體快速繁殖方式所需時間或基本相同，甚或短于目前方式。
因而，本發明達到了一種產業化方式諾麗離體快速繁殖和后續的諾麗基因工程研究奠定基礎的目的。
圖1為本發明根部形成愈傷組織生長示意圖。
圖2為本發明愈傷組織繼代培養生長示意圖。
圖3為本發明愈傷組織上長出的芽生長示意圖。
圖4為本發明諾麗完整植株生長示意圖。
以下結合附圖對本發明做進一步說明。本發明包括但不限制于以下實施例。
具體實施方式
(一)本發明方法所用諾麗取自西南林業大學園林學院組織培養室的組培苗，取健康、無菌諾麗苗的根部為外植體。
在以下方法中，進行對比的培養基分別是MS+0. 5 mg/L 6-BA ；MS+1. 0 mg/L 6-BA ； MS+1. 5 mg/L 6-BA。其中，MS培養基pH值為5. 8，并附加蔗糖3%、瓊脂0. 6%。培養基均在 1.1 kg/cm2的壓力、121°C下滅菌20 min。愈傷組織的誘導培養試驗均在25士2°C和2000 Ix光照強度下進行，每天光照12h。藥品均為國產分析純，實驗用水為超純水。
(1)不同濃度的6-BA對愈傷組織的誘導將諾麗無菌苗的根切下，剪成0. 5-lcm的小段，輕輕接入培養基中，確保充分與培養基接觸。記錄開始形成愈傷的時間，計算愈傷組織的誘導率，并觀察愈傷組織的顏色和質地。 其中，誘導率=產生愈傷組織的外植體數+所接種的不污染的外植體數。
接種15天后，陸續有細小顆粒狀愈傷形成，30天后愈傷變大，顏色呈土黃色和淺綠色。試驗結果表明(表1)，當6-BA濃度為0. 5 mg/L時，愈傷組織的誘導率僅為75. 51%， 愈傷組織的外觀顏色為土黃色，顆粒較松散；當6-BA濃度為1. 0 mg/L時，愈傷組織的誘導率為85. 11%，愈傷組織的外觀顏色大部分為土黃色、少部分為淺綠色；當6-BA濃度為1. 5 mg/L時，愈傷組織的誘導率最高，達95. 65%，愈傷組織的外觀顏色多為淺綠色，質地松緊合適(圖1)。
權利要求
1.以根為外植體的諾麗愈傷組織的誘導及植株再生的方法，步驟包括(1)愈傷組織的誘導將諾麗無菌苗的根切下，剪成0. 5cm Icm的小段作為外植體，輕輕接入培養基中， 并使外植體充分與培養基接觸，培養基為MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 5mg/L 6-BA，接種約15天陸續形成細小顆粒狀愈傷，顏色呈土黃色或綠色，硬度適中；(2)愈傷組織上不定芽的誘導于20天時觀察，愈傷組織上陸續分化出不定芽，待不定芽長到約Icm時將其切下，于MS 培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA或MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 5 mg/L 6-BA下培養；35天 40天；(3)不定芽的再生當步驟(2)中長出的不定芽長到Icm 2cm時，將其剪下，接入MS培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1. 0 mg/L 6-BA的中培養約30天；(4)壯苗生根從步驟(3)培養得到的健壯植株中，切取莖尖或長約1 cm的其它帶芽莖段，接種于MS 培養基(附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+0. 3 mg/L NAA中誘導生根，培養30 50天，得到完整植株；(5)移栽將諾麗根系已發育良好的培養瓶移至遮光率75%的溫室中煉苗7天后，從培養瓶中移出諾麗試管苗，洗去瓊脂，剪去根部附近的葉片，移植到苗盤中，適量噴水保持葉片及土壤濕潤，在自然光照下正常管理；以上MS培養基pH值為5.8 ；培養基均在1. 1 kg/cm2的壓力、121 °C下滅菌20 min ；愈傷組織的誘導培養試驗均在25士2°C和2000 Ix光照強度下進行，每天光照12h。
2.如權利要求1所述的諾麗愈傷組織的誘導及植株再生的方法，其特征是將步驟(1) 培養誘導約觀天的愈傷組織顆粒轉入MS (附加3%蔗糖和6%。瓊脂粉)+1.5mg/L 6-BA培養基上進行愈傷組織的繼代培養，再按照以上所述的步驟(2) (5)進行操作。
全文摘要
以根為外植體的諾麗愈傷組織的誘導及植株再生的方法，屬于用植物離體外植體的培養方法，特別是諾麗的外植體離體培養的方法。以諾麗試管苗的根為外植體，在添加不同濃度6-BA的MS培養基上進行離體培養，進行愈傷組織誘導。結果表明，最適合的愈傷組織誘導培養基是MS+1.5mg/L6-BA，誘導出的愈傷組織多數為土黃色，顆粒狀，硬度適中；最適合愈傷組織繼代的培養基也是MS+1.5mg/L6-BA，成活率達91.25%；愈傷組織在6-BA濃度為1.0mg/L、1.5mg/L的MS培養基中，不定芽分化率分別為24.13%和23.64%；愈傷組織上誘導出的芽可長成健壯的完整植株。
文檔編號A01H4/00GK102487825SQ20111040823
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者吳田, 張婷婷, 藍增全, 謝江 申請人:西南林業大學