專利名稱：一種以甜高粱幼穗或幼穗誘導愈傷組織為外植體遺傳轉化方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，特別是涉及一種以甜高粱幼穗或幼穗誘導愈 傷組織為外植體的遺傳轉化方法。
背景技術：
甜高粱是普通高粱的一個變種，生長耗水量僅為玉米的1/3，畝產可高達5 10 噸，其莖稈汁液是發酵制造酒精和培養酵母的理想生物質原料。用甜高粱取代玉米等糧食 作物作為原料生產酒精的新工藝，不僅能節約糧食、降低成本，有力地帶動發酵產業、振興 酒精生產行業、而且能推進可再生能源事業和畜牧業的發展。發展甜高粱產業關鍵在于甜 高粱新品種的選育與高效栽培。傳統育種技術在甜高粱的產量、品質、抗病、抗蟲等特性改 良方面已發揮了重要作用，但在生產上對品種、品質要求日益提高的情況下，因受現有資源 的限制，單靠傳統的育種方法難以取得重大突破。利用轉基因技術改良高梁品種已引起廣 泛的關注。植物轉基因技術通常依賴于植物快捷、高頻率再生體系的建立。然而，甜高粱同 普通高粱一樣，通過組織培養獲得再生植株相對比較困難。目前針對甜高粱組織培養的研 究還很少。從甜高粱的成熟胚和未成熟胚誘導愈傷到獲得整個再生植株以前雖已有過一些 艮道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep. 5 :349_351 ；Ma et al.，1987，Theor App Genet. 73 389-394 ；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci. 58 :692_693)，但遺憾的是能 夠從外植體誘導胚性愈傷到再生出植株的僅限于個別幾個品種(Smith and Bhaskaran, 1986，Springer-Verlag, New York, pp. 220-223 ；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep. 15 72-75)。近年來隨著人們對甜高粱應用價值的重視，甜高梁組織培養方面的研究也取得了 快速的發展。通過對不同基因型品種及外植體、不同培養基成分(包括蔗糖濃度和激素配 比等)、不同培養條件對愈傷的誘導、增殖及分化再生能力的影響進行系統研究，為甜高粱 品種建立有效的組織培養再生體系提供了參考(Zhao et al. ,2008,Chinese Bull Bot. 25 465-468 ；Zhao et al. ,2010,African Journal ofBiotechnology. 9(16) :2367_2374)。但 以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚為外植體，目前為止以幼穗為外植體的研究 尚很少見有報道。近年來各國科學家正在致力于相關方面的研究，相比其它作物，甜高粱組織培養 植株再生困難，而且受基因型的限制，因此甜高粱遺傳轉化研究進展緩慢，目前尚很少見成 功報道。據報道，2009年美國昆士蘭大學的研究人員培育出了世界上首例木質素含量降低 的轉基因甜高粱植株，他們將編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-0-甲 基轉移酶(COMT)的DNA片段導入甜高粱品種中，通過改變木質素的含量和組分獲得了成 功，該項研究成果已申請了專利(Pub. No. US 2010/0058496A1)。其它研究尚未見相關報道。因此建立甜高粱的遺傳轉化體系，通過轉基因技術培育甜高粱新品種，使其更好 地滿足實際生產的需求。轉化體系的研發將為綠色能源生物燃料和生物材料的開發利用開
3辟新的途徑。
發明內容
本發明的目的是提供一種以甜高粱幼穗材料的組織培養再生體系及遺傳轉化方 法和以甜高粱幼穗誘導的愈傷組織的組織培養再生體系及遺傳轉化方法，以用于甜高粱轉 基因的研究。—種以甜高粱幼穗或幼穗誘導愈傷組織為外植體的遺傳轉化方法，包括如下順 序步驟1)選取幼穗，旗葉期長約2_5cm幼穗，切成薄片；2)將幼穗誘導產生的愈傷組 織或幼穗薄片接種于預培養基中培養，所述預培養基為YS-P =MS無機鹽+MS有機物+2， 4-D 2mg/L+ZT2. Omg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 10mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊 脂8g/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L, pH 5. 8 ；所述幼穗誘導產生的胚性愈傷組織為將薄 片接種于誘導培養基上誘導愈傷而得到，所述誘導培養基為MS基礎培養基+2，4-D 2mg/ L+ZT2. Omg/L+PVP 10mg/L+ 抗壞血酸 10mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7. 2g/ L，pH5. 8 ；3)農桿菌介導法轉入外源基因；4)接種于共培養基中共培養，所述共培養基YS-C 為MS 無機鹽+MS 有機物+2，4-D 2mg/L+ZT 2. 0mg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 500mg/L+抗壞血酸 10mg/L+水解酪蛋白 500mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 8g/L+AS 100 μ mol/L, pH 5. 6 ；5)再轉入篩 選培養基上進行梯度篩選培養，所述篩選培養基為MS無機鹽+MS有機物+2，4-D 2mg/L+ZT 2. Omg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 10mg/L+ 抗壞血酸 10mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊 脂8g/L+羧芐青霉素250mg/L+不同濃度的雙丙氨膦，pH 5. 8 ；6)將存活的抗性愈傷組織轉 接于分化培養基中培養至出苗，所述分化培養基為MS無機鹽+MS有機物+2，4-D 2mg/L+ZT 2. Omg/L+KT 2mg/L+PVP 10mg/L+ 羧芐青霉素 125mg/L+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 ；7) 將苗移入生根培養基中培養出根，所述生根培養基為1/2MS基礎培養基+肌醇50mg/L+NAA 0. 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L，pH 5. 8 ；8)轉移至蛭石培養基 上過渡培養1-2周后移栽至溫室花盆或大田。所述幼穗長度為2-3cm，薄片約3mm長。所述預培養為26-28 °C暗培養3天。所述步驟3)為將預培養的外植體浸泡于農桿菌LBA4404懸浮液(含有攜帶外源 基因的植物表達載體)中15-20分鐘，所述農桿菌懸浮液組成為1/2MS無機鹽+酵母浸出 物 2. 5g/L+2，4-D 1. 5mg/L+ 蔗糖 68. 5g/L+ 葡萄糖 36g/L+AS 100 μ mol/L, pH 5. 2。所述農桿菌懸浮液的0D600值為0. 5-0. 6。所述外源基因為Bt殺蟲基因crylAh，所述篩選劑為雙丙氨膦。所述共培養為在26_28°C下暗培養3天。所述篩選培養的方法為先在篩選劑濃度為0的篩選培養基上避光恢復培養7天， 再轉入篩選劑濃度為lmg/L的篩選培養基上，進行一周低壓篩選，再轉入篩選劑濃度為 3mg/L的篩選培養基上，進行一周篩選，之后再轉入篩選劑濃度為5mg/L的篩選培養基上， 進行一周高壓篩選。所述分化培養基中的培養條件為在周期為16小時光照與8小時黑暗循環于 26-28°C條件下培養，每7-10天繼代培養一次。所述步驟8)轉入之前，甜高梁植株苗長約為3_4cm高。
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所述步驟9)轉入之前，甜高粱植株根長2-3cm。所述甜高粱品種為“BABUSH”和“MN-3025”。本發明通過對植物激素配比、培養基成分、不同基因型等因素對甜高粱組織培養 的影響比較發現，培養基中添加玉米素2. Omg/L對于幼穗愈傷組織的誘導具有重要的作 用，可以大幅度提高誘愈率；同時在培養基中適量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗壞血酸， 可以有效地減輕褐化現象，促進誘愈率的提高。本發明建立了甜高粱幼穗愈傷組織培養再生體系，并通過農桿菌介導法成功的將 外源基因cryIAh轉化幼穗和轉化幼穗愈傷組織，得到轉基因再生植株，經檢測表明，外源 基因得到了不同程度的表達，說明本發明的再生體系可用于遺傳轉化。雖然本發明農桿菌 介導法的外植體采用的是幼穗愈傷組織，而沒有轉化幼穗，但本領域技術人員根據相同的 方法及步驟直接轉化幼穗，是同樣可以實現的。本發明利用甜高梁幼穗為外植體在條件適宜時，能得到較高的愈傷組織誘導率， 但是，不同基因型來源的愈傷組織的胚性狀況及再生能力差別較大。實驗結果表明幼穗是 建立甜高梁再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進一步的轉化研究。甜高粱轉基因 研究目前尚很少見報道，本發明通過甜高粱農桿菌介導的轉化體系的建立，為今后深入開 展甜高粱轉基因研究奠定了基礎。
圖1用于甜高粱轉化的農桿菌p3301UH雙元載體T-DNA區結構示意2農桿菌介導轉基因甜高粱再生植株的形成過程。(A)-(E)轉基因甜高粱幼穗 愈傷組織的篩選、植株再生過程(A)農桿菌侵染幼穗愈傷組織用篩選培養(5mg/l雙丙氨 膦)；(B)抗性愈傷組織的分化培養；(C)誘導形成的不定芽；(D)生根后移栽溫室；(E)開花 授粉結實。圖3T0代部分轉化植株PCR檢測結果。1-11 :T0代部分甜高粱轉化植株；12 未轉化植株(CK-) ；13 空白對照(以水為模 板PCR產物)；14 :CK+(以p3301UH為模板PCR產物)；15:DNA標準分子量λ/Εοο1301(λ/ Ε) (bp) :19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421。圖4部分TO代轉化植株RT-PCR結果。M:DNA 分子量標準 DL 2000 (bp) 100、250、500、750、1000、2000 ； 1，3，5 以轉化植
株cDNA為模板；2，4，6 以轉化植株總RNA為模板；7 以未轉化植株cDNA為模板；8 =CK+,以 P3301UH為模板。圖5T0代轉化植株雙丙氨膦抗性檢測。非轉基因植株(左邊兩個葉片)，轉基因植株(右邊兩個葉片)。圖6T0代轉化植株溫室玉米螟抗性生測實驗。A 非轉基因植株；B 轉基因植株。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。下面所涉及的不同基因型的甜高粱均表明來源了，公眾可以從申請人的實驗免費得到。實施例1甜高粱幼穗組織培養再生體系的建立1. 1用于甜高粱組織培養的幼穗材料選擇與準備本發明取旗葉期長約2 5cm的幼穗，用70%酒精進行表面消毒3min，無菌水沖 洗多次；在超凈臺中用刀切成大小均一的薄片接種于誘導培養基[MS基礎培養基+2，4-D 2mg/L+ZT (玉米素)2. Omg/L+PVP (聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白 500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7. 2g/L，pH 5. 8]置于20 21 °C暗培養3 4周，使之開始脫分 化，形成愈傷組織；之后選擇生長迅速、質地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養[誘導培 養基+KT (激動素)0. 2mg/L]，每7 10天繼代一次。挑選生長狀態良好的愈傷組織接于分 化培養基[MS 基礎培養基+ZT 2. Omg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-lOmg/L+水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂8.0g/L，pH 5.8]上26_28°C光培養2 3周，之后將愈傷組織再生出的苗 移入生根培養基[1/2MS 基礎培養基 + 肌醇 500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/ L+蔗糖30g/L+瓊脂8.0g/L，pH 5.8]中，當長出根時(苗高3 4cm，根長2 3cm)，洗去 培養基，轉移到裝有消毒蛭石的小培養缽中煉苗培養7-15天，然后移栽溫室或大田。1. 2選擇合適的發育時期的幼穗誘導愈傷組織不同發育時期的幼穗(以幼穗長度為準)接種于幼穗培養基上，其愈傷誘導能力 存在差別。幼穗長度小于1. Ocm時誘導愈傷率很低，僅為16. 7%;幼穗長度為1. 0 2. Ocm 時期的誘愈率有所提高，可達到43. 8% ；當幼穗長度在2. 0 3. Ocm時，誘愈率達到最高， 為61. 7%。當幼穗長度大于5. Ocm后，隨著其發育時期的延長，幼穗長度的增加，愈傷組織 的誘導率逐漸下降(表1)。本實驗結果表明，甜高粱幼穗長度即幼穗在不同發育時期對愈 傷組織的誘導具有較大的影響，因此，在以甜高粱幼穗為外植體材料建立組織培養再生體 系或遺傳轉化時，應注意選擇適宜的發育時期的幼穗。表1幼穗長度對愈傷組織誘導的影響
權利要求
一種以甜高粱幼穗或幼穗誘導愈傷組織為外植體的遺傳轉化方法，包括如下順序步驟1)選取幼穗，旗葉期長約2 5cm幼穗，切成薄片，2)將幼穗誘導產生的胚性愈傷組織或幼穗薄片接種于預培養基中培養，所述預培養基為YS PMS無機鹽+MS有機物+2，4 D2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+AS100μmol/L，pH 5.8；所述幼穗誘導產生的胚性愈傷組織為將薄片接種于誘導培養基上誘導愈傷而得到，所述誘導培養基為MS基礎培養基+2，4 D 2mg/L+ZT2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.2g/L，pH5.8；3)農桿菌介導法導入外源基因；4)接種于共培養基中共培養，所述共培養基YS C為MS無機鹽+MS有機物+2，4 D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 500mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+AS 100μmol/L，pH 5.6；5)再轉入篩選培養基上進行梯度篩選培養，所述篩選培養基為MS無機鹽+MS有機物+2，4 D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+羧芐青霉素250mg/L+不同濃度的雙丙氨膦，pH 5.8；6)將存活的抗性愈傷組織轉接于分化培養基中培養至出苗，所述分化培養基為MS無機鹽+MS有機物+2，4 D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 2mg/L+PVP 10mg/L+羧芐青霉素125mg/L+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH 5.8；7)將苗移入生根培養基中培養出根，所述生根培養基為1/2MS基礎培養基+肌醇50mg/L+NAA 0.400mg/L+IBA 2mg/L+PVP10mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH 5.8；8)轉移至蛭石培養基上過渡培養1 2周后移栽至溫室花盆或大田。
2.根據權利要求1所述的方法，所述幼穗長度為2-3cm，薄片約3mm長，所述預培養為 26-28°C暗培養3天。
3.根據權利要求1所述的方法，所述步驟3)為將預培養的外植體浸泡于含有攜帶外源 基因的植物表達載體的農桿菌LBA4404懸浮液中15-20分鐘。
4.根據權利要求3所述的方法，所述農桿菌懸浮液的0D600值為0.5-0. 6，所述農桿菌 懸浮液組成為1/2MS無機鹽+酵母浸出物2.5g/L+2，4-D 1. 5mg/L+蔗糖68. 5g/L+葡萄糖 36g/L+AS 100 μ mol/L, pH 5.2。
5.根據權利要求3所述的方法，所述外源基因為Bt殺蟲基因crylAh，所述篩選劑為雙 丙氨膦。
6.根據權利要求1所述的方法，所述共培養為在26-28°C下暗培養3天。
7.根據權利要求1所述的方法，所述篩選培養的方法為先在篩選劑濃度為0的篩選培 養基上避光恢復培養7天，再轉入篩選劑濃度為lmg/L的篩選培養基上，進行一周低壓篩 選，再轉入篩選劑濃度為3mg/L的篩選培養基上，進行一周篩選，之后再轉入篩選劑濃度為 5mg/L的篩選培養基上，進行一周高壓篩選。
8.根據權利要求1所述的方法，所述分化培養基中的培養條件為在周期為16小時光 照與8小時黑暗循環于26-28°C條件下培養，每7-10天繼代培養一次。
9.根據權利要求1所述的方法，所述步驟8)轉入之前，甜高粱植株苗約為3-4cm高，所 述步驟9)轉入之前，甜高粱植株根長2-3cm。
10.根據權利要求1所述的方法，所述甜高粱品種為“BABUSH”和“MN-3025”。
全文摘要
本發明為“一種以甜高粱幼穗或幼穗誘導愈傷組織為外植體遺傳轉化方法”，屬植物基因工程技術領域。本發明對甜高粱幼穗外植體誘導愈傷組織，采用農桿菌介導法轉化外源基因，通過預培養，然后共培養，再篩選培養，得到抗性愈傷，再將其繼代分化培養、出芽、生根，移栽得到轉化植株。本發明利用所建立的遺傳轉化體系轉化甜高粱植物獲得轉基因抗蟲植株。本發明為利用生物技術改良甜高粱的品質和提高抗逆性等研究提供了技術支撐，也為加快甜高粱的基礎研究打下了很好的基礎。
文檔編號A01H4/00GK101946708SQ20101026194
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月24日 優先權日2010年8月24日
發明者朱莉, 李桂英, 郎志宏, 黃大昉 申請人:中國農業科學院生物技術研究所