甘蔗桿狀病毒(scbv)增強子及其在植物功能基因組中的用途的制作方法

專利名稱：甘蔗桿狀病毒(scbv)增強子及其在植物功能基因組中的用途的制作方法
技術領域：
本公開涉及植物分子生物學和遺傳工程學領域，并且具體地，涉及可用于調控(例如增強)植物中基因表達和/或蛋白質生成的多核苷酸分子。
背景技術：
一直以來都需要指導、控制或以其他方式調節可轉錄核酸(例如轉基因)表達的遺傳調節元件，例如用在經遺傳工程改造的生物體諸如植物中。遺傳調節元件通常包括5’非翻譯序列諸如含有轉錄因子和RNA聚合酶結合位點(一個或多個)、增強子/沉默子元件、TATA盒和CAAT盒的轉錄啟動區，連同3’聚腺苷酸化序列、轉錄終止信號、翻譯起始和終止信號、剪接供體/受體序列等等。就遺傳工程學目的而言，遺傳調節元件通常包含在表達載體或其它經工程改造的構建體中以調節可操作地連接于該調節元件的轉基因的表達。以此種方式使用的啟動子的公知的例子是 CaMV35S 啟動子(Nagy 等于!Biotechnology in plant science:relevanceto agriculture in the eighties.Zaitlin等Academic Press, Orlando, 1985)、玉米泛素啟動子(Ubi ; Christensen&Quail, Transgenic Research5:213, 1996)和 Emu 啟動子(Last等，Theor.App1.Genet.81581，1991)，不過還有許多其它啟動子也是普通技術人員已知的。類似地，已經從 各種來源分離出用在遺傳工程學中的增強子；這些包括花椰菜花葉病毒(35S CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、花生褪綠條紋病花椰菜花葉病毒(PClSV)增強子、或紫茉莉(mirabilis)花葉病毒(MMV)增強子。—直以來都需要鑒定出可以用來控制與其可操作地連接的序列(例如在異源核酸分子諸如載體和其它經工程化改造的構建體中)的表達的遺傳調節元件，諸如增強子域。發明概述本公開描述了新的轉錄調節區，其包含增強子域和在該增強子域的增強控制下的轉錄調節域。所述增強子域包含串聯排列的多個(例如2-4個或更多個)拷貝的天然但以前未得到識別的SCBV增強子。本公開的轉錄調節區(啟動子)相比于缺乏該增強子域的啟動子提供了增強的轉錄。在一個實例中，公開了一種嵌合的轉錄調節區，其包含顯示在SEQID NO:1的位置337至位置618中的SCBV增強子元件的一個或多個拷貝；和與其可操作地連接的包含RNA聚合酶結合位點和mRNA啟動位點的啟動子,其中當目的核苷酸序列在所述嵌合的轉錄調節區的調節性控制下轉錄時，轉錄產物的量相比于用包含所述啟動子、但不包含所述SCBV增強子序列的嵌合的轉錄調節區所獲得的轉錄產物的量增加。還提供了包含所描述的轉錄調節區和待轉錄的DNA序列的DNA構建體。在一個實例中，DNA構建體包含所公開的轉錄啟動區，其可操作地連接于可轉錄的多核苷酸分子，后者可操作地連接于3’轉錄終止多核苷酸分子。該DNA構建體為待轉錄DNA序列的增強的轉錄提供條件。還公開了用所公開的構建體轉化的轉基因植物、植物細胞或組織(諸如雙子葉植物或單子葉植物、植物細胞或組織)。還公開了可以從所公開的轉基因植物衍生的植物種子、果實、葉、根、芽、花、插條、和其它可用在有性或無性繁殖中的繁殖材料、包含Fl雜交種的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物及植物產物。本文中還提供了所公開的轉基因植物、植物細胞或組織的生成方法。從下面援引附圖展開的詳述中，能夠更清楚地了解本公開的前述特征和其它特征。附圖簡述


圖1顯示了 SCBV啟動子的序列(對應于GenBank登錄號AJ277091.1的位置 6758-7596, “Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate IrengMaleng”，通過提述將其以于2010年4月15日呈現在網上的形式完整并入本文)；該序列也顯示在SEQ ID NO:1中。在本研究中界定的增強子序列從-222延伸至-503，并且在本圖中加有下劃線(對應于SEQ ID NO:1的位置337-位置618)。圖2A和2B例示了對SCBV啟動子的分析結果。圖2A顯示了與螢光素酶(LUC)報告基因融合的SCBV啟動子片段，所述各啟動子片段含有自轉錄起始位點上游-839bp、-576bp和-333bp至轉錄起始位點下游106bp的序列。圖2B顯示了用上文質粒和UB1: AUS報告構建體共轉化的HiII細胞的LUC/GUS活性比的直方圖。結果顯示，含有自轉錄起始位點上游_576bp起的序列的啟動子片段所具有的活性是含有起始位點上游839bp的啟動子片段的60%。相比之下，含有自起始位點上游_333bp起的序列的啟動子片段所具有的活性僅為全長啟動子(自轉錄起始位點上游-839bp起)的10%。由此可見,牽涉啟動子活性的序列位于_333bp的上游。

圖3A和3B例示了本文中描述的SCBV增強子元件增強了從玉米Adhl啟動子的轉錄。將從-503至-222的SCBV啟動子序列的1、2和4個拷貝克隆到截短的玉米Adhl啟動子上游，融合至螢火蟲螢光素酶基因(圖3A)。為了比較，將4個拷貝的MMV增強子序列、2個拷貝的MMV增強子和2個拷貝的SCBV啟動子克隆到截短的玉米Adhl啟動子上游并融合到螢火蟲螢光素酶基因(圖3A)。將這些構建體與UB1: AUS報告構建體一起轟擊到玉米H1-1I懸浮細胞中。如圖3B中顯示的，含有1、2和4個拷貝的SCBV增強子的構建體的活性分別是沒有任何增強子的截短的Adhl構建體轟擊的細胞的活性的超過5倍、6倍和10倍。4X MMV構建體的活性是截短的Adhl構建體活性的2.5倍，且2X MMV2X SCBV構建體的活性是截短的Adhl構建體活性的6倍。圖4顯示相比于非轉基因(W)對照植物，轉基因(T)植物中4XSCBV整合位點附近(“側翼基因”)轉錄本的累積，其使用逆轉錄和PCR(RT-PCR)分析。顯示管家基因GAPDH的水平以用于比較。4XSCBV增強子導致其整合處附近基因轉錄本的累積增加；這種在轉錄本累積的增加可能緣于轉錄速率的增加。序列表如37C.F.R.1.822中定義的，對核苷酸堿基使用標準字母縮寫且對氨基酸使用三字母碼來顯示下面序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列。每個核酸序列僅顯示了一條鏈，但應理解對被展示的鏈的任何提述也包括其互補鏈。核酸序列(在序列表或本文其它地方中)以標準的5’ -3’方向呈現，蛋白質序列以標準的氨基(N)末端至羧基(C)末端方向呈現。SEQ ID NO:1顯示了 SCBV啟動子的核酸序列(對應于GenBank登錄號AJ277091.1的位置 6758-7596,“Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate IrengMaleng”，通過提述將其在2010年4月15日呈現在網上的形式完整并入本文)。本文中描述的增強子元件是從SEQ ID NO:1的位置337至位置618。發明詳述1.縮寫3' UTR 3’ 非翻譯區5' UTR 5’ 非翻譯區Adhl醇脫氫酶IasRNA 反義 RNAcDNA互補 DNAdsRNA 雙鏈 RNAGAPDH 甘油醛3_磷酸脫氫酶KB千字節kbp千喊基對LUC螢光素酶miRNA 微小 RNAnt核苷酸ORF開放閱讀框PCR聚合酶鏈式反應RT-PCR 逆轉錄及 PCRSCBV甘蔗桿狀病毒siRNA小干擾 RNAssRNA單鏈 RNATm熱解鏈點UTR非翻譯區I1.術語除非另外指出的，依照常規用法來使用技術術語。可以在以下出版物中發現分子生物學中常見術語的定義:Benjamin Lewin, Gene s V,由 Oxford University Press出版，1994 (ISBN0-19-854287-9) ; Kendrew 等(編)，The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和 RobertA.Meyers (編),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。為了幫助評估本發明的各種實施方案，提供了對特定術語的下列解釋:5’和/或3’:稱核酸分子(諸如DNA和RNA)具有“5’端”和“3’端”，因為將單核苷酸以使得一個單核苷酸戊糖環的5’磷酸根經由磷酸二酯鍵以某一方向附著于其鄰位的3’氧的方式反應來生成多核苷酸。因此，當多核苷酸一端的5’磷酸未連接于單核苷酸戊糖環的3’氧時，將其稱為“5’端”。當多核苷酸另一端的3’氧未連接于另一單核苷酸戊糖環的5’磷酸時，將其稱為“3’端”。不過內部核酸序列也可以稱為具有5’端和3’端，盡管一個單核苷酸戊糖環的5’磷酸根附著于其鄰位的3’氧。在線性或環狀核酸分子中，離散的內部元件被稱為“下游”或3’元件的“上游”或5’端。對于DNA，該術語反映了轉錄沿著DNA鏈以5’ -3’方向進行。指導所連接基因的轉錄的啟動子和增強子元件一般位于編碼區的5’端或上游。不過，增強子元件即使位于啟動子元件和編碼區的3’端也可以施加其影響。轉錄終止和多聚腺苷酸化信號位于編碼區的3’端或下游。農藝性狀:植物的屬性，所述屬性包括但不限于，植物形態學、生理學、生長和發育、產量、營養增加、疾病或害蟲抗性、或環境或化學耐受性，都是農藝性狀。“改善的農藝性狀”指在農藝性狀中可測量的改進，所述農藝性狀包括但不限于產量增加，包括在無脅迫條件下的產量增加和環境脅迫條件下的產量增加。脅迫條件可以包括，例如干旱、陰蔽、真菌性疾病、病毒性疾病、細菌性疾病、昆蟲侵襲、線蟲侵襲、冷溫暴露、熱暴露、滲透脅迫、減少的氮養分可得性、減少的磷營養可得性和高植物密度。“產量”可以受到許多特性影響，包括但不限于，植物高度、莢果數目、莢果在植物上的位置、節間數目、莢果破碎的發生率、顆粒大小、結瘤和氮固定的效率、營養物同化的效率、對生物和非生物脅迫的抗性、碳同化、植物體系結構、對倒伏的抗性、種子萌發百分比、幼苗活力、和幼態性狀。產量還可以受到下列因素的影響:萌發(包括在脅迫條件下的萌發)效率、生長速率(包括在脅迫條件下的生長速率)、穗數目、每穗的種子數目、種子大小、種子組成(淀粉、油、蛋白質)和種子填充的屬性。增加的產量可能起因于對關鍵的生物化學化合物諸如氮、磷和碳水化合物的改善的利用，或起因于對環境脅迫諸如冷、熱、干旱、鹽、和害蟲或病原體攻擊的改善的應答。在本公開中使用的重組DNA也可以用于提供這樣一種植物，其具有改善的生長和發育，并且作為植物生長調節物的經修飾的表達或對細胞周期或光合作用途徑進行修飾的結果，具有最終增加的產量。農藝性狀以及在植物中改變這類性狀的其他例子已在本文中提供并且/或者會被本領域中的普通技術人員認識到。改變:如本文中使用的，多核苷酸(例如由本發明的核酸編碼的多肽)中的改變包含多核苷酸序列中的任何缺失、插入和點突變。在此定義中包含對編碼多肽的基因組DNA序列的改變。類似地，術語“改變”可以用于指多肽序列中的缺失、插入和其它突變。改變生成或表達水平:相比于生成或表達的對照水平，變化(通過增加或降低)核酸分子或氨基酸分子(例如siRNA、miRNA、mRNA、基因、多肽、肽)的生成或表達水平。擴增:當用于指核酸時，它指增加樣品或標本中核酸分子拷貝數的技術。擴增的一個例子是聚合酶鏈式反應，其中使從受試者收集的生物學樣品與一對寡核苷酸引物在允許引物與樣品中的核酸模板雜交的條件下接觸。所述引物在合適的條件下延伸，與模板解離，然后重新退火、延伸并解離以擴增核酸的拷貝數。使用標準技術，可以通過電泳、限制內切酶切割樣式、寡核苷酸雜 交或連接、和/或核酸測序，來表征體外擴增的產物。體外擴增技術的其它例子包括鏈置換擴增(參見美國專利N0.5，744，311);無轉錄等溫擴增(參見美國專利N0.6，033，881);修復鏈反應擴增(參見W090/01069);連接酶鏈反應擴增(參見EP-A-320308);缺口填充連接酶鏈反應擴增(參見美國專利N0.5，427，930);偶聯的連接酶檢測和PCR (參見美國專利N0.6，027, 889);和NASBA 無RNA轉錄擴增(參見美國專利N0.6，025，134)。反義、有義和反基因:DNA具有兩條反向平行鏈，稱為正鏈的5’ 一 3’鏈，和稱為負鏈的3’ 一 5’鏈。由于RNA聚合酶以5’ 一 3’方向添加核酸，DNA的負鏈在轉錄期間充當RNA的模板。由此，RNA轉錄本將具有與負鏈互補并等同于正鏈(除了 U被T取代)的序列。反義分子是與RNA或DNA的正鏈特異性可雜交或特異性互補的反義分子。有義分子是與DNA的負鏈特異性可雜交或特異性互補的分子。反基因分子是針對DNA靶物的反義或有義分子。反義RNA(asRNA)是與有義(編碼的)核酸分子互補的RNA分子。反義抑制:該術語指一類基于細胞質的、細胞核的或細胞器的基因表達的抑制(例如宿主細胞基因組或病原體諸如病毒的基因組的表達)的基因調節，所述基因表達抑制是由于細胞中與所翻譯的mRNA的至少一部分互補的RNA分子的存在。cDNA(互補DNA):缺少內部非編碼區段(內含子)和轉錄調節序列的DNA片段。cDNA還可以含有負責相應RNA分子中翻譯控制的非翻譯區(UTRs)。通常在實驗室中通過自細胞或其它樣品所提取的信使RNA的逆轉錄來合成cDNA。嵌合的或嵌合體:兩個或更多個不同的多核苷酸或多肽分子部分的融合的產物。例如，短語“嵌合序列”和“嵌合基因”指自至少兩個異源部分衍生的核苷酸序列。嵌合序列可以包含DNA或RNA。嵌合的轉錄調節區:一組指導與其可操作地連接的核酸的轉錄的核酸控制或調節序列，該組是由不同的多核苷 酸來源裝配而成。例如，如本文中描述的嵌合的轉錄調節區可以通過對已知的啟動子或其它多核苷酸分子的操作而生成。嵌合的轉錄調節區可以將一種或多種增強子域與一種或多種啟動子組合，例如，通過將第一天然啟動子的異源增強子域與具有其自身調節元件的部分或完整集合的第二啟動子融合。本公開例示地提供了這類嵌合的轉錄調節區，其含有融合(即可操作地連接)至植物中有活性的啟動子的至少一個SCBV啟動子域。構建體:自任意來源衍生的能夠進行基因組整合或自主復制的任何重組多核苷酸分子，諸如質粒、粘粒、病毒、自主復制的多核苷酸分子、噬菌體、或線性或環狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，其包含其中已經可操作地連接一種或多種可轉錄的多核苷酸分子的多核苷酸分子。對照植物:不含有賦予(例如)轉基因植物中增強或改變的農藝性狀的重組DNA的植物，例如在為了鑒定轉基因植物中增強或改變的農藝性狀時，它被用作比較的基線。合適的對照植物可以是用于生成轉基因植物的親本系的非轉基因植物，或至少對于所檢查的特定性狀為非轉基因的植物(換言之，對照植物可能經過工程改造而含有其它異源序列或重組DNA分子)。由此，對照植物在一些情況下可以是包含空載體或標志基因，但不含有測試植物中的重組DNA，或不含有測試植物中的全部重組DNA的轉基因植物。共抑制:與內源基因具有實質同源性的外來(異源)基因的表達，其產生對該外來基因和內源基因兩者的表達的抑制。DNA(脫氧核糖核酸):DNA是包含大多數生物體(一些病毒具有包含核糖核酸(RNA)的基因)的遺傳材料的長鏈聚合物。DNA聚合物中的重復單元是4種不同的核苷酸，其中每一種都包含結合至附著有磷酸根基團的脫氧核糖的4種堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之一。核苷酸的三聯體(稱為密碼子)編碼多肽中的每個氨基酸或終止信號。術語“密碼子”也用于DNA所轉錄的mRNA中的3個核苷酸的相應的(以及互補的)序列。除非另外說明，任何對DNA分子的提述都包含該DNA分子的反向互補體。除了在本文中需要單鏈性的情況外，DNA分子雖然書面上僅描述了一條鏈，但涵蓋了雙鏈DNA分子的兩條鏈。編碼:如果一種多核苷酸在其天然狀態或當通過本領域中技術人員已知的方法對其進行操作時，可以被轉錄生成用于多肽或其片段的mRNA和/或翻譯生成多肽或其片段，則稱該多核苷酸編碼多肽。反義鏈是這類核酸的互補體，并且可以從其推導出編碼序列。增強子域:一種順式作用的轉錄調節元件(又稱為順式元件)，其賦予對基因表達的總體控制的一個方面。增強子域可以起著結合轉錄因子(其為調節轉錄的反式作用蛋白因子)的作用。一些增強子域結合超過一種轉錄因子，并且轉錄因子可以與超過一種增強子域以不同的親和力相互作用。可以通過許多技術來鑒定增強子域，包括缺失分析(從啟動子的5’端或內部刪除一個或多個核苷酸)；使用DNase I足跡法的DNA結合蛋白分析、甲基化干擾、電泳遷移率改變測定、通過連接介導的PCR的體內基因組足跡法、和其它常規測定；或通過使用常規的DNA序列比較方法與已知的順式元件基序進行DNA序列比較。可以對增強子域的精細結 構進行進一步研究，其通過對一個或多個核苷酸的誘變(或取代)或通過其它常規方法。可以通過化學合成或通過從包含這類元件的啟動子分離來獲得增強子域，并且可以加以額外的側翼核苷酸來合成它們，所述側翼核苷酸含有有用的限制酶位點來協助后續操作。(基因)表達:DNA分子到轉錄的RNA分子的轉錄。更一般地，將基因的編碼信息轉換成在細胞中存在且運行的結構的過程。表達的基因包括那些轉錄成mRNA然后翻譯成蛋白質的，以及那些轉錄成RNA但不翻譯成蛋白質的(例如siRNA、轉運RNA和核糖體RNA)。由此，靶序列(諸如基因或基因的啟動子區)的表達可能導致mRNA、蛋白質或兩者的表達。可以抑制或增強(降低或增加)靶序列的表達。可以將基因表達描述為與時間、空間、發育或形態學性質以及定量或定性指征有關。基因調節活性:多核苷酸影響可操作連接的、可轉錄或可翻譯的多核苷酸分子的轉錄或翻譯的能力。分離的具有基因調節活性的多核苷酸分子可以提供可操作連接的、可轉錄的多核苷酸分子的時間或空間的表達、或調控其表達水平和速率。分離的具有基因調節活性的多核苷酸分子可以包含啟動子、內含子、前導序列或3’轉錄終止區。基因沉默:基因沉默指由于但不限于在基因組(DNA)水平上的效應(諸如染色質重構)，或經由對轉錄本穩定性或翻譯的影響在轉錄后水平上的效應所導致的缺乏(或降低)基因表達的結果。目前的證據表明RNA干擾(RNAi)是牽涉轉錄和轉錄后基因沉默的主要過程。由于RNAi在轉錄和/或轉錄后水平上施加其影響，據信RNAi可以用于特異性地抑制來自同一基因的可變轉錄本。異源的:一種類型的序列，其通常(例如在野生型序列中)不在另一序列鄰近處發現。在一個實施方案中，該序列來自與另一序列不同的遺傳來源，諸如病毒或生物體或物種。
雜交:寡核苷酸及其類似物通過互補堿基之間的氫鍵雜交，所述氫鍵包括Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氫鍵。一般而言，核酸由含氮堿基組成，所述堿基為嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G))。這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤之間形成氫鍵，并且嘧啶對嘌呤的鍵合被稱為堿基互補。更具體地，A會與T或U鍵合，而G會與C鍵合。在RNA分子中，G還會與U鍵合。互補指在兩條不同的核酸序列或同一核酸序列的兩個不同區域之間發生的堿基互補。導致特定嚴格程度的雜交條件會根據選擇的雜交方法的性質和雜交的核酸序列的組成和長度而變化。一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強度(特別是Na+濃度)會決定雜交的嚴格性。關于得到特定嚴格程度所需要的雜交條件的計算由SambiOOk等(編),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，1-3 卷,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,第 9 章和第 11 章論述,其通過提述并入本文。以下是一組例示性的雜交條件，且并不意圖為限制的。非常高的嚴格性(檢測出具有90%序列同一性的序列)雜交:5x SSC在65°C達16小時清洗兩次:2x SSC各在室溫(RT)達15分鐘清洗兩次:0.5x SSC各在65°C達20分鐘高嚴格性(檢測出具有80%序列同一性或更高的序列)雜交:5x_6x SSC 在 65°C _70°C達 16-20 小時清洗兩次:2x SSC各在 RT達5_20分鐘清洗兩次:Ix SSC各在55°C _70°C達30分鐘低嚴格性(檢測出具有超過50%序列同一性的序列)雜交:6x SSC 在 RT 至 55 °C 達 16-20 小時清洗至少兩次:2x-3x SSC各在RT至55°C達20-30分鐘.
處于順式:指示兩條序列處于RNA或DNA的同一片段上。處于反式:指示兩條序列處于RNA或DNA的不同片段上。工業用農作物:其生長主要供人或動物消耗，或用在工業過程(例如作為用于制造的脂肪酸的來源或用于生產醇的糖的來源)中的農作物。會理解的是，在許多情況中可以消耗植物或從該植物生成的產物(例如甜料、油、面粉或粗磨粉(meal));由此，工業用農作物的一個子集是食物農作物。食物農作物的例子包括但不限于，玉米/谷物、大豆、稻、小麥、油菜(oilseed rape)、棉花、燕麥、大麥和馬鈴薯植物。在本文中列出了工業用農作物(包含食物農作物)的其它例子。干擾或抑制(靶序列的表達):該短語指小RNA (諸如siRNA或miRNA)或其它分子可測量地降低攜帶靶序列的分子的表達和/或穩定性的能力。靶序列可以包括DNA序列，諸如基因或基因的啟動子區，或RNA序列，諸如mRNA。“干擾或抑制”表達涵蓋了基因或序列的終產物例如編碼的蛋白質或受靶序列影響的蛋白質、核酸、其它生物分子的表達或功能、或生物學功能的降低，并且由此包括mRNA轉錄本或其它靶序列的量或壽命的降低。在一些實施方案中，小RNA或其它分子指引著染色質修飾，其抑制靶序列的表達。將該短語理解為是相對的，且并不需要對序列的絕對抑制(阻抑)。因此，在有些實施方案中，干擾或抑制靶序列的表達需要的是，隨著小RNA或其它分子(諸如編碼一種或多種小RNA的載體或其它構建體)的應用，該序列以比應用前低至少5%、低至少10%、低至少15%、低至少20%、低至少25%、或甚至降低了更多的水平表達。因此，在一些特定的實施方案中，小RNA或其它分子的應用使靶序列的表達降低了約30%、約40%、約50%、約60%、或更多。在特定的實例中，在小RNA或其它分子特別有效的情況下，表達降低了 70%、80%、85%、90%、95%、或甚至更多。分離的:“分離的”生物學組分(諸如核酸、肽或蛋白質)是已經從該組分所天然存在的生物體細胞中的其它生物學組分(例如其它染色體和染色體外的DNA和RNAjP蛋白質)實質性分開的、分開產生的、或純化出來的。因此，已經“分離的”核酸、肽和蛋白質包含通過標準的純化方法純化的核酸和蛋白質。該術語還包括通過在宿主細胞中重組表達制備的核酸、肽和蛋白質以及化學合成的核酸。代謝組:單一的生物體、樣品、組織、細胞或其它分開的任意部分中存在的相對低分子量分子(代謝物)的全數。舉例而言，代謝組可以包括代謝中間物、激素和其它信號傳導分子和次級代謝物。代表性的代謝組包括在生物學樣品諸如植物、植物部分、或植物樣品、或其懸浮液或提取物中發現的代謝物的全數。這類分子的例子包括但不限于:酸和有關化合物；單、雙和三羧酸(飽和的、不飽和的、脂肪族和環狀的、芳基的、烷芳基的)；醛酸、酮酸；內酯形式；赤霉素；脫落酸；醇、多羥基化合物、衍生物和有關化合物；乙醇、苯甲醇、甲醇；丙二醇、甘油、葉綠醇；肌醇、糠醇、薄荷醇；醛、酮、醌、衍生物和有關化合物；乙醛、丁醛、苯甲醛、丙烯醛、糠醛、乙二醛；丙酮、丁酮；蒽醌；碳水化合物；單糖、二糖、三糖；生物堿、胺和其它堿；嘧啶(包括煙堿酸、煙酰胺)；嘧啶(包括胞嘧啶、胸腺嘧啶)；嘌呤(包括鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤/次黃嘌呤、細胞分裂素(kinetin));吡咯；喹啉(包括異喹啉)；嗎啡喃、托烷、cinchonan ;核苷酸、寡核苷酸、衍生物和有關化合物；鳥苷、胞苷、腺苷、胸苷、肌苷；氨基酸、寡肽、衍生物和有關化合物；酯；酚和有關化合物；雜環化合物和衍生物；吡咯、四吡咯(咕啉和卟吩/卟啉，有或無金屬離子)；黃酮類化合物；噴哚；類脂(包括脂肪酸和甘油三酯)、衍生物和有關化合物；類胡蘿卜素、八氫番茄紅素；以及固醇、類異戊二烯，包括職(terpene)。微小RNA (miR NA):小的非編碼RNA基因產物，長度約21個核苷酸且發現于各種生物體包括動物和植物中。miRNA在結構上類似于siRNA，但它們是自miRNA基因衍生的高度組織化的、形成折回的前體轉錄本產生的。miRNA基因的初始轉錄本形成發夾結構，其由多域RNAseIII樣的核酸酶DICER和DROSHA(動物中)或DICER-LIKE1 (DCLI ;植物中)加工以得到miRNA雙鏈體。成熟的miRNA在雙鏈體解旋后被并入到RISC復合物中。植物miRNA與其RNA靶物以完美或近乎完美的互補性相互作用。核苷酸:術語核苷酸包括但不限于，包含連接至糖的堿基的單體，諸如嘧啶、嘌呤或其合成的類似物，或者包含連接至氨基酸的堿基的單體，如在肽核酸(PNA)中的。核苷酸是寡核苷酸/多核苷酸中的單體。核苷酸序列指寡核苷酸/多核苷酸中的堿基序列。DNA的主要核苷酸是脫氧腺苷5’-三磷酸(dATP或A)、脫氧鳥苷5’-三磷酸(dGTP或G)、脫氧胞苷5’ -三磷酸(dCTP或C)、和脫氧胸苷5’ -三磷酸(dTTP或T)。RNA的主要核苷酸是腺苷5’ -三磷酸(ATP或A)、鳥苷5’ -三磷酸(GTP或G)、胞苷5’ -三磷酸(CTP或C)、和尿苷5’ -三磷酸(UTP或U)。肌苷也是可以整合到DNA或RNA中的核苷酸中的一種堿基(分別為dITP或ITP)。
產油物種(植物的):在特定器官中(主要在種子中)產生并儲存三酰甘油的植物物種。這類物種包括但不限于，大豆(Glycine nizax)、油菜籽和油菜(諸如Brassicanapus、Brassica rapa 和 Brassica campestris)、向日葵(Helianthus annus)、棉花(Gossypium hirsutum)、玉米(玉蜀黍(Zea mays))、可可(Theobroina cacao)、紅花(Carthamus tinctorius)、油椰(Elaeis guineensis)、椰樹(Cocos nucifera)、亞麻(Linum usitatissimuin)、蓖麻(Ricinus commiunis)和花生(Arachis hypogaea)。寡核苷酸:寡核苷酸是通過磷酸二酯鍵結合的、長度介于約6-約300個核苷酸之間的多個核苷酸。寡核苷酸類似物指發揮著類似于寡核苷酸的功能但具有非天然存在部分的化合物。例如，寡核苷酸類似物可以含有非天然存在的部分，諸如改變的糖模塊或糖間連接，諸如硫代磷酸寡脫氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能性類似物可以結合RNA或DNA。可操作地連接:該術語指組件特別是核苷酸序列的并置，從而使組件的正常功能可以得到實施。由此，當第一核酸序列置于與第二核酸序列的功能性關系中時，第一核酸序列與第二核酸序列是可操作地連接的。例如，若啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則該啟動子與該編碼序列是可操作地連接的。一般地，可操作地連接的DNA序列是連續的，且在必須連接兩個蛋白質編碼區時，可操作地連接的DNA序列位于同一閱讀框中。“可操作地連接”于調節序列的編碼序列指核苷酸序列的一種配置，其中編碼序列可以在該調節序列的調節性控制(例如轉錄和/或翻譯控制)下表達。ORF(開放閱讀框):編碼氨基酸而無終止密碼子的一系列核苷酸三聯體(密碼子)。這些序列通常可翻譯成肽。百分比序列同一性:當將參照(“查詢”)多核苷酸分子的線性多核苷酸序列與測試(“受試”)多核苷酸分子(或其互補鏈)進行最佳聯配(具有合適的核苷酸插入、缺失、或缺口，其總共少于·沿比較窗口參照序列的20%)時，前者與后者相比其中等同核苷酸的百分比。用于聯配比較窗口的最佳序列比對是本領域中技術人員公知的，并且可以使用工具來進行，諸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比對算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法。優選地,利用這些算法的計算機化執行諸如 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA(作為 GCGOi) Wisconsin 包 (AccelrysInc., Burlington, Mass.)的部分可獲)來實施這類比較。測試序列和參照序列聯配區段的“同一性分數”是兩條聯配序列間共有的等同組分數目除以參照序列區段中的總組分數目(即完整的參照序列或參照序列的較小的限定部分)。百分比序列同一性由同一性分數乘以100代表。一個或多個多核苷酸序列可以與全長多核苷酸序列或其部分比較，或與更長的多核苷酸序列比較。實質性百分比序列同一性是至少約80%的序列同一性、至少約90%的序列同一性、或甚至更高的序列同一性，諸如約98%或約99%的序列同一性。植物:任何植物或其后代。該術語還包括植物的部分，包含種子、插條、塊莖、果實、花等。在各個實施方案中，該術語植物指栽植的植物物種，諸如玉米/谷物、棉花、油菜、向日葵、大豆、高粱、苜蓿、小麥、稻、生成果實和蔬菜的植物、以及草坪和觀賞性植物物種。如本文中使用的，術語植物細胞指植物的結構和生理單元，其由原生質體和周圍細胞壁組成。如本文中使用的，術語植物器官指植物的獨特且明顯分化的部分，諸如根、莖、葉或胚。更一般地，術語植物組織指在植物體內或培養物中的任何植物組織。該術語包括完整的植物、植物細胞、植物器官、原生質體、細胞培養物或任何組織成結構和功能性單元的植物細胞組。多核苷酸分子:來源于基因組或合成的單鏈或雙鏈DNA或RNA ;即分別的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的聚合物，其從5’端(上游)向3’端(下游)閱讀。多肽分子:一種聚合物，其中的單體是通過酰胺鍵結合在一起的氨基酸殘基。當氨基酸是α-氨基酸時，可以使用L-光學異構體或D-光學異構體，優選L-異構體。如用于本文的，術語多肽或蛋白質涵蓋任何氨基酸序列且包括經修飾的序列諸如糖蛋白。術語多肽特定地意圖涵蓋天然存在的蛋白質以及那些重組或合成生成的。轉錄后基因沉默(PTGS):—種基因沉默形式，其中在轉錄后發生抑制機制。這可能導致特定RNA祀物的穩定態水平降低或對翻譯的抑制(Tuschl, ChemBiochem, 2:239-245，2001)。在文獻中，術語RNA干擾(RNAi)和轉錄后共抑制經常用于指示轉錄后的基因沉默。啟動子:通過識別并結合例如RNA聚合酶II和其它蛋白質(反式作用轉錄因子)來啟動轉錄，指導核酸轉錄的一排核酸對照序列。啟動子包括在轉錄起始位點附近的必要核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動子的情況中是TATA元件。在最小程度上，啟動子通常包括至少一個RNA聚合酶結合位點且還可以包括一個或多個轉錄因子結合位點，其應答轉錄因子的占據而調控轉錄。在本文中描述了啟動子的代表性例子(和可以裝配以產生啟動子的元件)。可以通過啟動子的 時間、空間、或發育的表達樣式對其進行定義。植物啟動子是在植物細胞中有功能的天然或非天然的啟動子。蛋白質:由基因表達且由氨基酸構成的生物學分子，例如多肽。原生質體:分離的沒有細胞壁的植物細胞，其具有被轉化和/或再生成細胞培養物或全植物的潛力。純化的:術語“純化的”不要求絕對純度，而意圖是一個相對的術語。因此，例如純化的融合蛋白制備物是其中融合蛋白相比于其生成環境中(例如在細胞中或在生化反應室中)的蛋白質更富集的。優選地，純化融合蛋白的制備物從而使該融合蛋白代表制備物總蛋白含量的至少50%。重組:重組核酸分子具有非天然存在的序列或通過將兩個分開的序列區段人工組合而產生的序列。經常通過化學合成，或者更普遍地，通過對分離的核酸區段的人工操作(例如通過遺傳工程改造技術)來完成該人工組合。類似地，重組蛋白是由重組核酸分子編碼的重組蛋白質。可調節的啟動子:其活性受到某介質(agent)調節(直接或間接地)的啟動子，所述介質諸如轉錄因子、化學化合物、環境條件或核酸分子。調節基因表達:通過增加或降低影響基因表達的介質的表達、生成或活性來控制基因表達的過程。所述介質可以是蛋白質諸如轉錄因子，或者是核酸分子諸如miRNA或siRNA分子，當與基因或其上游調節序列或由該基因編碼的mRNA接觸時，其增加或降低基因表達。調節性序列或元件:這些術語一般指一類多核苷酸分子(諸如DNA分子，具有DNA序列)，其影響或控制可操作地連接的、可轉錄的多核苷酸分子的轉錄或翻譯及由此的基因表達。該術語包括啟動子、增強子、前導區、內含子、基因座控制區、邊界元件/絕緣子、沉默子、基質附著區(也稱為支架附著區)、阻遏子、轉錄終止子(又稱為轉錄終止區)、復制起點、著絲粒、和減數分裂重組熱點。啟動子是在基因5’端附近的DNA序列，其充當RNA聚合酶的結合位點，并且從此處啟動轉錄。增強子是升高從啟動子的轉錄水平的對照元件，其通常不依賴于增強子的取向或與啟動子間的距離。基因座控制區(LCR)賦予其所連接的基因組織特異性的或在時間上受調節的表達。LCR不依賴于其相對于基因的位置，但依賴于拷貝數而發揮功能。據信它們發揮著打開核小體結構從而使其它因子可以結合至DNA的功能。LCR還可以影響復制時間安排和起點使用。絕緣子(也稱為邊界元件)是通過阻斷周圍染色質的影響來阻止基因轉錄活化(或失活)的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑制基因表達的對照元件；它們不依賴于其取向或與基因的距離而作用于基因。基質附著區(MAR，也稱為支架附著區)是結合核支架的DNA內的序列。它們可以影響轉錄，可能通過將染色體分開到調節域中。據信MAR介導染色體中更高級的、成環的結構。轉錄終止子是RNA酶從模板釋放的基因鄰近內的區域。復制起點是在細胞分裂的DNA合成或復制階段期間，開始DNA復制過程的基因組區。減數分裂重組熱點是在減數分裂期間比平常更經常地重新組合的基因組區。調節區中的特定核苷酸可以發揮多種功能。例如，特定的核苷酸可以是啟動子的一部分并且參與對轉錄激活子蛋白的結合。在細胞中(例如在植物或植物細胞中)發揮功能的分離的調節元件可用于經由例如遺傳工程改造來修飾植物表型。RNA:由磷酸二酯鍵連接的核糖核酸單體的、通常為線性的聚合物。天然存在的RNA分子分成三個通常的類，信使RNA (編碼蛋白質的mRNA)、核糖體RNA (rRNA,核糖體組分)、和轉運RNA(tRNA，在蛋白質合成期間負責將氨基酸單體轉移到核糖體的分子)。信使RNA包括異核RNA(hnRNA)和結合膜的多核糖體RNA(附著于粗內質網)。總RNA指所有類型的RNA分子的異質混合物。RNA干擾(RNAi):牽涉小RNA (包括miRNA和siRNA)的基因沉默機制經常被稱為屬于廣義術語RNAi。RNAi的天然功能包括保護基因組免受移動遺傳元件諸如轉座子和病毒的侵襲，和調節基因表達。RNA干擾導致生物體內基因表達的失活或受到抑制。RNAi可以由兩種通常途徑之一觸發。第一，其可以由小干擾RNA(siRNA，通常長度為 21個核苷酸并且以各3’端有2個未配對核苷酸的dsRNA雙鏈體形式投遞)的直接細胞投遞觸發，該小干擾RNA與作為抑制靶物的RNA具有序列互補性。第二，RNAi可以由其中從所設計、表達的各種類型的基因體內形成siRNA的數種方法之一觸發。這些基因通常表達形成分子內或分子間雙鏈體的RNA分子(dsRNA)，其由天然的酶(DICER或DCL)加工以形成siRNA。在一些情況中，這些基因表達形成“發夾”的RNA轉錄本，其具有完美或近乎完美的堿基配對；一些不完美的形成發夾的轉錄本得到特定類型的小RNA，稱為微小RNA (miRNA)。在任一種通用方法中，siRNA (或miRNA)充當“指引序列”來指導RNA降解酶(稱為RISC)切割靶RNA或使其沉默。在一些情況中，將誘導RNAi的基因整合到轉基因生物體的基因組中是有益的。一個例子是經修飾以通過誘導RNAi的轉基因來抑制特定基因的植物。在大多數目前所實踐的方法中，在轉基因植物中通過表達dsRNA(分子內的或發夾，或分子間的，其中兩個轉錄本退火以形成dsRNA)的轉基因來觸發RNAi。RNA沉默:用于指示基于RNA的基因沉默或RNAi的通用術語。
序列同一性:兩條核酸序列或兩條氨基酸序列之間的相似性表達為序列之間的相似性或稱為序列同一性。序列同一性經常以百分比同一性(或相似性或同源性)衡量；百分比越高，兩條序列就越相似。當使用標準方法聯配時，本文中提述或公開的序列同源物(諸如SCBV增強子元件的同源物)會擁有相對高的序列同一性程度。用于比較的序列比對方法是本領域中公知的。各種程序和比對算法記載于:Smith 和 Waterman (Adv.Appl.Math.2: 482，1981) ; Needleman 和 Wunsch (J.Mol.Biol.48:443，1970);Pearson 和 Lipman(PNAS.USA85:2444, 1988);Higgins 和 Sharp (Gene, 73:237-244，1988);Higgins 和 Sharp(CAB10S5:151-153, 1989);Corpet 等(Nuc.Acids Res.16:10881-90，1988);Huang 等(Comp.Appls Biosc1.8:155-65,1992);和Pearson 等(Methods in Molecular Biology24:307-31， 1994)。 Altschul 等(NatureGenet., 6:119-29, 1994)提供了對序列比對方法和同源性計算的詳細考量。可以使用比對工具ALIGN (Myers 和 Miller, CAB10S4:11-17, 1989)或LFASTA (Pearson 和 Lipman, 1988)來實施序列比較(Internet Program ◎ 1996, ff.R.Pearson 和 the University of Virginia, “fasta20u63” 版本 2.0u63,發布日 1996 年12月)。ALIGN將完整的序列彼此間進行比較，而LFASTA比較區域的局部相似性。這些比對工具及其相應教程可在網絡上biology, ncsa.uiuc.edu處獲得。所公開序列的直系同源物(Ortholog)或并系同源物(paralog)(更一般地，同源物)通常表征為使用設置為缺省參數的ALIGN，具有與它們所比較的序列的全長比對計算出的超過75%的序列同一性。當用該方法評估時，與參照序列具有甚至更高的相似性的序列會顯示增加的百分比同一性，諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少98%的序列同一性。另 外，可以在公開的融合蛋白的一個或兩個結合域的全長上比較序列同一性。在此情況下，百分比同一性基本上類似于就全長序列同一性所論述的百分比同一性。當對完整序列的顯著小于全部的部分的序列同一性進行比較時，同源物在10-20個氨基酸的小窗口上通常會擁有至少80%的序列同一性，并且根據其與參照序列的相似性，可能具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%的序列同一性。可以使用LFASTA來測定這類小窗口上的序列同一'I"生；可以在萬維網地址biology, ncsa.uiuc.edu上發現方法。本領域中的技術人員會領會這些序列同一性范圍的提供僅用于指引；在給出的范圍外能夠獲得非常顯著的同源物是完全可能的。本公開不僅提供了上文所描述的肽同源物，還提供了編碼這類同源物的核酸分子。兩種核酸分子緊密相關的另一指示是這兩種分子在嚴格條件下彼此雜交。嚴格條件是序列依賴性的，并且在不同的環境參數下不同。一般地，嚴格條件選擇為比特定序列在限定的離子強度和PH處的熱解鏈點(Tm)低約5°C至20°C。Tm是50%的靶序列與完美匹配的探針雜交時的溫度(在限定的離子強度和PH下)。核酸雜交條件和嚴格性的計算可以在 Sambrook 等(于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NewYork,1989)和 Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology第I部分,第2章,Elsevier, New York, 1993)中發現。在嚴格條件下與公開的SCBV增強子序列雜交的核酸分子通常會基于完整的融合蛋白編碼序列、完整結合域、或編碼序列的其它選擇部分在0.2x SSC, 0.1%SDS、于65°C的清洗條件下與探針雜交。但是由于遺傳密碼子的簡并性，不顯示高度同一性的核酸序列也可能編碼相似的氨基酸序列。理解的是，可以使用此簡并性來改變核酸序列以生成各編碼基本相同的蛋白質的多種核酸序列。小干擾RNA(siRNA):通過DICER酶(動物中)或DCL酶(植物中)從dsRNA加工出的約21-25個核苷酸的RNA。初始DICER或DCL產物是雙鏈的，其中兩條鏈通常長為21-25個核苷酸并且在各3’端含有2個未配對堿基。雙鏈siRNA結構內的單個鏈被分開，然后其中一條siRNA通常與多亞基復合物誘導RNAi的沉默復合物(RISC)結合。siRNA的典型功能是基于堿基配對互補性指引RISC到達靶物。可轉錄的多核苷酸分子:任何能夠轉錄成RNA分子的多核苷酸分子。普通技術人員已知這樣的方法，即用于將構建體以某種方式引入細胞，從而使得可轉錄的多核苷酸分子被轉錄成功能性mRNA分子，其被翻譯并因此表達為蛋白質產物。還可以構建能夠表達反義RNA分子的構建體，從而抑制特定目的RNA分子的翻譯。用于制備并使用構建體及宿主細胞的常規組合物和方法是本領域中技術人員公知的(參見例如Molecular CloningiALaboratory Manual,第 3 版卷 I, 2 和 3.Sambrook 等,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2000)。轉錄:通過RNA聚合酶生成作為DNA序列互補拷貝的RNA分子。轉錄終止區:控制轉錄本3’端形成的序列。自切割核酶和聚腺苷酸化序列是轉錄終止序列的例子。轉錄性基因沉默(TGS):由與基因啟動子區同源且有時和編碼區同源的dsRNA的形成所觸發的現象。TGS導致DNA和組蛋白甲基化以及染色質重構，由此導致轉錄抑制而非RNA降解。TGS和PTGS都依賴于dsRNA，其被切割成小(21_25個核苷酸)干擾 RNA(Eckhardt, Plant Cell,14:1433-1436, 2002;Aufsatz 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，99:16499-16506，2002)。轉基因:該術語指含有重組遺傳材料的植物/真菌/細胞/其它實體或生物體，該重組遺傳材料通常未發現于該 類型/物種的實體中(即為異源遺傳材料)且是通過人工操作引入所論述的實體(或該實體的祖系)中的。由此，從其中通過轉化引入重組DNA的植物細胞(經轉化的植物細胞)生長出的植物是轉基因植物，且該植物的含有引入的轉基因的所有后代(不管是有性或無性產生的)也都是轉基因植物。轉化:外源DNA進入并改變受體細胞的過程。它可能在自然條件下或使用本領域中公知的各種方法在人工條件下發生。轉化可以依賴于任何已知的用于將外來核酸序列插入到原核或真核生物宿主細胞中的方法。對方法的選擇受到所轉化的宿主細胞的影響，并且可以包括但不限于，病毒感染、電穿孔、脂轉染、和粒子轟擊。經轉化的:經轉化的細胞是已經通過分子生物學技術引入核酸分子的細胞。經轉化的細胞包括穩定轉化的細胞，其中插入的DNA能夠作為自主復制質粒或作為宿主染色體的一部分復制。它們也包括在有限時間段內瞬時表達插入DNA或RNA的細胞。如本文中使用的，術語轉化涵蓋了所有可以將核酸分子引入這類細胞中的技術，包括用病毒載體轉染、用質粒載體轉化、和通過電穿孔引入裸DNA、脂轉染和粒子槍加速。轉座子:能夠在基因、染色體或基因組內部轉移位置或移動的核苷酸序列諸如DNA或RNA序列。轉基因植物:含有插入到其核基因組或細胞器基因組的外來(異源)核苷酸序列的植物。
轉基因:通過轉化技術插入到一種或多種宿主細胞的核酸序列。載體:引入到宿主細胞中由此生成經轉化的宿主細胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細胞中復制的核酸序列，諸如復制起點。載體還可以包含一種或多種治療性基因和/或可選擇的標志基因以及本領域中已知的其它遺傳元件。載體可以轉導、轉化或感染細胞，由此使得細胞表達其天然的那些以外的核酸和/或蛋白質。任選地，載體包括幫助實現核酸進入細胞的材料，諸如病毒顆粒、脂質體、蛋白質包被等。除非另外解釋的，本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常的理解相同的含義。除非上下文另外清楚指出的，單數的術語“一個/ 一種/該”包含復數所指對象。類似地，除非上下文另外清楚指出的，詞“或/或者”意圖包含“和/及/以及”。因此“包含A或B”意味著包含A或B，或A和B。還應理解的是，對核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子質量值都是大概的，并且提供以用于描述。盡管可以在本發明的實踐或測試中使用類似于或等同于本文中所描述的那些的方法和材料，但在下文中描述了合適的方法和材料。本文中所提述的所有出版物、專利申請、專利和其它引用都通過提述完整并入。在有沖突的情況下，參照本說明書內容，包括對術語的解釋。另外，材料、方法和實施例僅為例示性的并且不意圖限制。II1.對數個實施方案的概述本公開描述了新的轉錄啟動區，其包含增強子域以及在該增強子域的增強控制下的轉錄調節域。所述增強子域包含串聯排列的多個(例如2-4個或更多個)拷貝的天然但以前未識別的SCBV增強子。本公開的轉錄調節區(啟動子)相比于缺乏該增強子域的啟動子提供增強的轉錄。在一個實施方案中，公開了嵌合的轉錄調節區，其包含在SEQ ID NO:1的位置337至位置618中顯示的SCBV增強子元件(或其同源物)的一個或多個拷貝；以及可操作地與其連接的包含RNA聚合酶結合位點和mRNA啟動位點的啟動子，其中當在所述嵌合的轉錄調節區的調節性控制下轉錄目的核苷酸序列時，轉錄產物的量相比于用包含所述啟動子、但不包含所述SCBV增強子序列的嵌合的轉錄調節區所獲得的轉錄產物的量增加。在一些實施方案中，嵌合的轉錄調節區包含從植物病毒基因、細菌基因、真菌基因、植物核基因、植物核外基因、無脊椎動物基因或脊椎動物基因的上游區獲得的啟動子。還提供了包含所描述的轉錄調節區和待轉錄的DNA序列的DNA構建體。在一些實施方案中，公開了一種DNA構建體，其包含轉錄啟動區，所述轉錄啟動區可操作地連接于可轉錄的多核苷酸分子，而后者可操作地連接于3’轉錄終止多核苷酸分子。在一個實施方案中，所述可轉錄的多核苷酸分子賦予其中表達該多核苷酸分子的植物農藝性狀。還提供了轉基因植物。在一個實施方案中，轉基因植物由公開的DNA構建體穩定轉化。在一些實施方案中，所述轉基因植物是雙子葉植物。在其它實施方案中，所述轉基因植物是單子葉植物。在一個具體的實施方案中，所述轉基因植物是玉米植物。進一步提供了公開的轉基因植物的種子。在一個實施方案中，所述種子包含公開的DNA構建體。甚至還進一步提供了轉基因植物細胞或組織。在一個實施方案中，轉基因植物細胞或組織包含公開的嵌合的轉錄調節區。在一些實施方案 中，所述植物細胞或組織衍生于雙子葉植物。在其它實施方案中，所述植物細胞或組織來自單子葉植物。在一個具體的實施方案中，所述植物細胞或組織來自玉米植物。
還提供了生成公開的轉基因植物、植物細胞、種子或組織的方法。在一些實施方案中，所述方法包括用公開的DNA構建體轉化植物細胞或組織。進一步提供了可從公開的轉基因植物衍生的植物細胞、果實、葉、根、芽、花、種子、插條和其它在有性或無性繁殖中有用的再生材料、包括Fl雜交種的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物產物。還公開了包含在SEQ ID NO:1的位置337至位置618中顯示的SCBV增強子元件的一個或多個拷貝的玉米植物細胞、組織或植物。在一個實施方案中，玉米植物細胞、組織或植物包含在SEQ ID NO:1的位置337至位置618中顯示的SCBV增強子元件的一個或多個拷貝，其中所述SCBV增強子元件的一個或多個拷貝被插入到玉米植物細胞、組織或植物基因組的隨機位置處。在一些實施方案中，相比于在不存在SCBV增強子時目的核苷酸序列的轉錄，SCBV增強子賦予在其調節性控制下的目的核苷酸序列的增強的轉錄。IV.SCBV增強子及其用途本公開提供了來自甘蔗桿狀DNA病毒(SCBV)基因組的以前未識別的增強子區，該增強子可用于增強轉錄效率，這可能導致在該增強子控制下的DNA序列的轉錄增強。特別感興趣的是可能具有與宿主相同的遺傳起源或外來起源的基因序列(天然存在的序列(有義和反義方向)或合成制備的序列)的增強的轉錄。受試增強子包含以前未識別的天然SCBV增強子域(其序列在SEQ ID NO:1中位置337至618處提供)的兩個或更多個拷貝。該增強子包含串聯排列的增強子域序列的至少2個拷貝，在一些實施方案中3個或4個或更多個拷貝。還涵蓋了同源增強子。不意圖以任何方式受到限制的，代表性的同源序列可以包含那些來自其它SCBV啟動子的，例如來自不同的SCBV分離物，諸如那些記載于Braithwaite等(Plant Cell Rep.23:319-326，2004;通過提述完整并入本文)或美國專利N0.5，994，123 (通過提述完整并入本文)中的。天然的增強子 包含在其天然環境中處于啟動子上游并且在其約600bp內的DNA序列。取mRNA的起始核苷酸作為0，含有增強子的序列是從約-50至約-1，OOObp，通常從約-50至-950bp，一般包含約-100至-SOObp。增強子域是順式作用的，且期望地位于待增強的轉錄啟動序列的約10，OOObp內，通常約2，OOObp內，更通常地鄰近于或位于該轉錄啟動序列的約1，OOObp內。增強子相對于轉錄啟動序列可以處于任一方向，并且相對于其所增強的啟動子位于其上游或下游，不過通常在上游。本公開的增強子域可以與很多種啟動序列一起使用，所述啟動序列包括天然發現的在增強子控制下的啟動子(例如處于順式位置(鄰近且同源的))以及通常不與特定增強子關聯的那些(例如異源的)。增強子域和轉錄啟動域可以來自相同或不同的界、科或種。感興趣的物種包括原核生物和真核生物，諸如細菌、植物、昆蟲、哺乳動物等。組合包括所描述的SCBV(病毒的)增強子域(一個或多個)與以下物種的結構基因的轉錄啟動區的組合:SCBV的宿主(例如來自甘蔗)、另一種植物物種(例如來自相同或不同的科)、昆蟲、脊椎動物、細菌、真菌等。本公開還涵蓋了 DNA構建體，其包含受試轉錄啟動區以及在該轉錄啟動區控制下的待轉錄的DNA序列。所述DNA序列可以包含天然的開放閱讀框，其包含轉錄的5’和3’側翼序列。或者，其可以由于編碼RNA分子或其部分的互補體而包含反義序列。當構建體包含編碼蛋白質的開放閱讀框(ORF)時，獲得增強的轉錄啟動速率，其通常提供該基因的多肽表達產物的增加量。當構建體包含反義序列時，與野生型互補的RNA的增強的轉錄抑制了野生型mRNA的表達，由此降低多肽表達產物的量；所討論的野生型mRNA可以對應于宿主細胞的天然mRNA或病原體諸如病毒或真菌的mRNA。在各個實施方案中，待轉錄的DNA序列包括:基因(例如來自植物、動物、細菌、病毒或真菌)的蛋白質編碼序列，其可以包含:編碼蛋白質產物的天然的開放閱讀框；自基因編碼的mRNA衍生的互補DNA(cDNA)序列；產生期望的編碼序列的合成DNA ;自天然基因的外顯子衍生的蛋白質編碼序列，諸如通過外顯子連接產生的開放閱讀框；和/或其任意兩種或更多種的組合。附著于這些序列的是合適的轉錄終止/聚腺苷酸化序列；來自編碼初始RNA產物(由外顯子和內含子組成)的天然基因(例如來自植物、動物、細菌、病毒或真菌)的序列(例如真核生物的天然的聚合酶II和聚合酶III轉錄的基因)；編碼特定的RNA或蛋白質產物的合成的DNA序列；通過誘變(諸如定點誘變)和/或其它遺傳工程改造技術從已知的編碼序列(例如天然的基因序列)修飾而來的DNA序列；通過連接DNA片段實現的上述任意種的嵌合體，包括編碼融合蛋白的嵌合體；和/或編碼RNA分子或其部分的互補體的DNA序列。植物中增強的轉錄可以在增強植物特征性蛋白質(內源的-即正常發現于野生型宿主中)或來自其它遺傳來源的那些蛋白質(外源的-即正常未發現于野生型宿主中)的生成中發揮作用。要從本文中所描述的增強子和嵌合轉錄調節區表達的序列類型的例子包括:反義或小的抑制性RNA(用于基因抑制)；營養上重要的蛋白質；生長促進因子；對特定環境條件下生長的植物給予保護的蛋白質，例如賦予對金屬、鹽或其它毒性抗性的蛋白質；脅迫有關的蛋白質，其給予對極端溫度、冷凍等的耐受；賦予植物對害蟲或感染有關的保護的蛋白質，例如給予對細菌、真菌或其它微生物感染抗性，或者對昆蟲捕食(例如蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)毒素)或其它無脊椎動物或脊椎動物抗性的蛋白質；具有植物以外的醫學重要性例如抗微生物、抗腫瘤 等的化合物；具有特定商業價值的蛋白質或其它化合物；蛋白質，例如代謝途徑(例如用于生成多酚化合物或其它次級代謝物的途徑)的酶的水平升高；對植物宿主具有結構性價值的產物的水平升高；等等。轉錄的目的序列長度會是至少約8bp、至少約12bp、至少約20bp,且可以是一千或幾千個堿基對(kbp)。V.構建體本公開的構建體通常含有嵌合的轉錄調節區，其包含所提供的SCBV增強子元件的一個或多個拷貝，所述一個或多個拷貝可操作地連接于啟動子(通常至少含有RNA聚合酶結合位點和mRNA啟動位點)，而該區域可操作地連接于可轉錄的多核苷酸分子，該分子可操作地連接于3’轉錄終止多核苷酸分子。另外，構建體可以包括但不限于來自植物基因的3’非翻譯區(3’ UTR)的另外的調節性多核苷酸分子(例如3’ UTR以增加mRNA的mRNA穩定性，諸如馬鈴薯的P1-1I終止區或者章魚堿或胭脂堿合酶3’終止區)。構建體可以包括但不限于mRNA多核苷酸分子的5’非翻譯區(5’UTR)，其可能在翻譯啟動中起著重要作用并且還可以是植物表達構建體中的遺傳組件。例如，已經證明自熱激蛋白基因衍生的不翻譯的5’前導多核苷酸分子增加植物中的基因表達(參見例如美國專利Nos.5，659，122和5，362，865，其中每個都通過提述完整并入)。如該構建體中存在的這類額外的上游和下游調節性多核苷酸分子可以自相對于構建體上的其它元件為天然的或異源的來源衍生。
因此，一個實施方案是包含嵌合的轉錄調節區的構建體，該轉錄調節區本身包含在SEQ ID NO:1的位置337至位置618中顯示的SCBV增強子元件(或其同源物)的一個或多個拷貝(例如2個、3個、4個或更多個拷貝)，所述拷貝可操作地連接于啟動子，該啟動子可操作地連接于可轉錄的多核苷酸分子，從而當將該構建體引入到植物細胞中時，指導所述可轉錄的多核苷酸分子以期望的水平和/或在期望的組織或發育樣式中轉錄。在一些實例中，所述可轉錄的多核苷酸分子包含基因的蛋白質編碼區，且嵌合的轉錄調節區提供功能性mRNA分子的轉錄,所述mRNA分子從構建體翻譯并作為蛋白質產物表達。在另一個實施方案中，所述可轉錄的多核苷酸分子包含基因的反義區，且嵌合的轉錄調節區影響反義RNA分子或其它類似的抑制性RNA的轉錄，從而抑制靶宿主細胞中特定目的RNA分子的表達。本公開的更多的構建體例子包括雙Ti質粒邊界DNA構建體，其具有從根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)分離出的 Ti 質粒(包含 T-DNA)的右邊界(RB 或 AGRtu.RB)和左邊界(LB或AGRtu.LB)區，其與由土壤桿菌細胞提供的轉運分子一起，使得T-DNA能夠整合到植物細胞的基因組中。該構建體還可以含有提供細菌細胞中的復制功能和抗生素選擇的質粒骨架DNA區段,例如,大腸桿菌(Escherichia coli)復制起點諸如ori322、具有廣泛宿主范圍的復制起點諸如oriV或oriR1、以及用于可選擇標志的編碼區諸如Spec/Strp，其編碼賦予對壯觀霉素或鏈霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰轉移酶(aadA)，或艮他霉素(Gm，Gent)可選擇標志基因。對于植物轉化，代表性的宿主細菌菌株包括根癌土壤桿菌ABI，C58，或LBA4404 ;然而，也可以使用植物轉化領域中的技術人員已知的其它菌株。還涵蓋了包含至少一個SCBV增強子元件(任選地，在嵌合的轉錄調節區的背景中)的構建體，該構建體是激活標簽化構建體。激活標簽化是一種在全基因組規模隨機并強烈上調基因，然后可以篩選并選擇特定表型的方法。已知在各種激活標簽化構建體類型中可用的組件；參見例如:Walden等，Plant Mol.Biol.26:1521-8，1994(描述了一種用于活化煙草細胞培養物中基因從而允許細胞在缺乏植物生長激素的情況下生長的活化 T-DNA 標簽構建體);Miklashevichs 等,Plant J.12:489-98，1997; Harling等,EMBO J.16:5855-66，1997; Walden 等,EMBO J.13:4729-36，1994(報告了從 T-DNA標簽側翼的植物基因組序列分離并推定牽涉植物生長激素應答的基因)；S c h e 11等，Trends Plant Sc1.3:130，1998 (論述了對一組相關研究的調查)；Kardailsky等，Science286:1962-1965，1999(描述了激活T-DNA標簽并篩選植物中的早期開花表型)；Koncz 等，Proc Natl Acad Sci U S A86 (21):8467-71，1989 (描述了使用土壤桿菌基因5啟動子(pg5)進行的激活標簽化，該啟動子僅在增殖細胞時有活性并且必須插入到直接臨近于植物基因以影響其表達)；Wilson等，Plant Cell8:659-671, 1996(利用修飾的Ds轉座子進行的激活標簽化，所述轉座子攜帶CaMV35S啟動子和nos::hpt選擇盒)和Schaffer等，Cell93:1219-1229，1998(例示了同一系統，其用于上調臨近的植物基因，從而導致優勢的功能獲得性突變1996);和Weigel等，PlantPhysiology, 122:1003-1013, 2000 (例示了可用于篩選成百上千個經轉化的植物的形態學表型的激活標簽化載體)。 V1.用于轉錄增強的核苷酸序列用于通過納入如本文中提供的構建體進行轉錄增強的例示性可轉錄的多核苷酸分子包括，例如來自靶物種以外的多核苷酸分子或基因或者起源于或存在于相同物種中的基因，但通過遺傳工程改造方法而非經典的繁殖或育種技術納入到受體細胞中的多核苷酸分子或基因。多核苷酸分子的類型可以包括但不限于，已經存在于靶植物細胞中的多核苷酸分子、來自另一種植物的多核苷酸分子、來自不同生物體的多核苷酸分子、或外部生成的多核苷酸分子，諸如含有基因的反義信息的多核苷酸分子或編碼轉基因的人工的、合成的、或經修飾的版本的多核苷酸分子。在一個實施方案中，將如SEQ ID NO:1的位置337至618中顯示的多核苷酸分子(或其兩個或更多個拷貝)(例如在嵌合轉錄啟動區的背景中)納入到構建體中，從而使得所描述的SCBV增強子序列(或兩個或更多個這類序列的系列)可操作地連接于可轉錄的多核苷酸分子，所述可轉錄的多核苷酸分子是有農藝意義的基因或其它表達序列(更一般地，目的核苷酸序列)。如本文中使用的，術語“有農藝意義的基因”指包括但不限于如下的可轉錄的多核苷酸分子:提供與植物形態學、生理學、生長和發育、產量、營養改善、疾病或害蟲抗性、或環境或化學耐受性有關的期望屬性的基因。期望表達有農藝學利益的基因，例如，從而賦予農藝學上重要的性狀。對農作物 植物提供有益的農藝性狀的有農藝學利益的基因可以是，例如一種或多種賦予表達該基因的植物以下益處的序列:除草劑抗性(參見例如美國專利 Nos.6，803，501; 6，448，476; 6, 248，876; 6, 225，114; 6，107，549; 5, 866，775; 5, 804，425; 5, 633，435; 5, 463，175 ；以及美國公開 US20030135879 和 US20030115626)、增加的產量(參見例如美國專利USRE38, 446;美國專利Nos.6，716，474; 6，663，906; 6，476，295; 6，441，277; 6，423，828; 6，399，330; 6，372，211; 6，235，971; 6，222，098; 5，716，837)、昆蟲控制(參見例如美國專利 Nos.6，809，078;6，713，063;6，686，452;6，657，046;6，645，497; 6, 642，030; 6, 639，054; 6, 620，988; 6, 593，293; 6, 555，655; 6, 538，109; 6, 537，756; 6,521，442; 6, 501，009; 6, 468，523; 6，326，351; 6，313，378; 6, 284，949; 6, 281，016; 6，248，536;6，242，241; 6, 221，649; 6, 177，615;6，156，573; 6, 153，814;6，110，464; 6, 093，695; 6, 063，756; 6，063，597 ; 6，023，013 ; 5，959，091; 5，942，664; 5，942，658，5，880，275; 5，763，245;5，763，241)、真菌疾病抗性(參見例如美國專利 Nos.6，653，280; 6，573，361; 6，506，962; 6，316，407; 6，215，048; 5，516，671; 5, 773，696; 6，121，436; 6，316，407; 6，506，962)、病毒抗性(參見例如美國專利 Nos.6，617，496; 6, 608，241; 6, 015，940; 6, 013，864; 5, 850，023; 5,304，730)、線蟲抗性(參見例如美國專利N0.6，228，992)、細菌疾病抗性(參見例如美國專利N0.5，516，671)、植物生長和發育(參見例如美國專利Nos.6，723，897;6, 518，488)、淀粉產生量(參見例如美國專利 Nos.6，538，181; 6，538，179; 6, 538，178; 5, 750, 876; 6, 476，295)、改進的油產生量(參見例如美國專利Nos.6，444，876; 6, 426，447; 6, 380，462)、高油產生量(參見例如美國專利 Nos.6，495，739; 5，608，149; 6，483，008; 6，476，295)、改進的脂肪酸含量(參見例如美國專利 Nos.6，828，475; 6，822，141; 6，770，465; 6，706，950; 6，660，849; 6，596，538; 6，589，767; 6，537，750; 6，489，461; 6, 459，018)、纖維產生量(參見例如美國專利 Nos.6，576，818; 6，271，443; 5，981，834; 5，869，720)、高蛋白產生量(參見例如美國專利N0.6，380，466)、果實成熟(參見例如美國專利N0.5，512，466)、改善的可消化性(參見例如美國專利N0.6，531，648)、改善的味道(參見例如美國專利N0.6，011，199)、低棉子糖(參見例如美國專利N0.6，166，292)、增強的動物和/或人營養(參見例如美國專利 Nos.6，723，837; 6, 653，530; 6, 541，259; 5, 985，605; 6, 171，640)、環境脅迫抗性(參見例如美國專利N0.6，072，103)、期望的肽(例如藥學的或可分泌的肽)(參見例如美國專利 Nos.6，812，379; 6，774，283; 6，140，075; 6，080，560)、改進的加工性狀(參見例如美國專利N0.6，476，295)、工業酶生產(參見例如美國專利N0.5，543，576)、氮固定(參見例如美國專利N0.5，229，114)、雜交種子產生(參見例如美國專利N0.5，689，041)、生物聚合物(參見例如美國專利N0.USRE37, 543;美國專利Nos.6，228，623; 5, 958，745和美國公開N0.US20030028917)和生物燃料生產(參見例如美國專利N0.5，998，700)。在上文所列出的專利和公開申請中描述的遺傳元件、方法和轉基因通過提述并入本文。或者，可轉錄的多核苷酸分子可以通過編碼導致內源基因表達受到靶向抑制(經由例如反義、抑制性RNA(RNAi)、或共抑制介導的機制)的反義的或RNA分子來影響上文提述(或其它)的植物屬性或表型。RNA還可以是催化性RNA分子(核酶)，其被工程改造以切割期望的內源mRNA產物。因此，任何編碼影響目的表型、生化或形態學變化的轉錄RNA分子的可轉錄的多核苷酸分子都可以受益于由本文中提供的序列和構建體實現的轉錄增強。可以將描述的SCBV增強子或包含其一個或多個拷貝的嵌合轉錄調節區組入到具有一個或多個標志基因的構建體(任何可以以某種方式篩選其表達或打分的可轉錄的多核苷酸分子)中，并在瞬時或穩定的植物分析中測試以提供對穩定的轉基因植物中調節元件的基因表達樣式的指征。在這類實施方案的實施中使用的標志基因包括但不限于，編碼以下蛋白質的可轉錄的多核苷酸分子:β -葡糖醛酸糖苷酶(記載于美國專利N0.5，599，670的⑶S)和綠色熒光蛋白(記載于美國專利Nos.5，491，084和6，146，826的GFP)、賦予抗生素抗性的蛋白質、或賦予除草劑耐受性的蛋白質。本領域中已知可用的抗生素抗性標志，包括那些編碼賦予對卡那霉素抗性(nptll)、潮霉素B抗性(aph IV)、鏈霉素抗性、或壯觀霉素抗性(aad, spec/strep)和艮他霉素抗性(aac3和aacC4)的蛋白質的。已經證明轉基因植物對其耐受性并且可以應用本發明的方法的除草劑包括但不限于:草甘膦(glyphosate)、草銨膦(glufosinate)、磺酰脲類(sulfonylureas)、咪唑啉酮類(imidazolinones)、溴苯臆(bromoxynil)、茅草枯(dalapon)、cyclohezanedione、原口卜啉原(protoporphyrinogen)氧化酶抑制劑、和isoxasfIutole除草劑。編碼牽涉除草劑耐受性的蛋白質的多核苷酸分子是本領域中已知的，并且包括但不限于編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸(enolpyruvy lshikimate) -3-憐酸合酶(EPSPS,記載于美國專利Nos.5, 627, 061，5，633，435，6，040，497和美國專利N0.5，094，945中用于草甘膦耐受性)的多核苷酸分子；編碼草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰轉移酶(記載于美國專利N0.5，463，175的GOX和記載于美國公開N0.20030083480的GAT)的多核苷酸；編碼溴苯腈腈水解酶(Bxn，記載于美國專利N0.4，810, 648用于溴苯腈耐受性)的多核苷酸分子；記載于Misawa等(Plant J.4:833-840, 1993)和 Misawa 等(Plant J.6:481-489，1994)中用于編碼對達草滅(norflurazon)耐受性的八氫番爺紅素去飽和酶(crtl)的多核苷酸分子；記載于Sathasiivan 等(Nuc1.Acids Res.18:2188-2193，1990)中編碼用于對橫酸服除草劑耐受性的乙酰羥酸合酶(AHAS，又稱為ALS)的多核苷酸分子；編碼降解麥草畏的酶加氧酶(記載于美國專利公開US20030135879和US20030115626，用于麥草畏耐受性)的多核苷酸分子；和記載于DeBlock等(ΕΜΒ0 J.6:2513-2519, 1987)中用于草銨膦和雙丙氨膦(bialaphos)耐受性的bar基因。本公開的調節元件可以表達編碼以下酶的可轉錄多核苷酸分子:膦絲菌素(phosphinothricin)乙酰轉移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基葡糖苷磷酸轉移酶、羥苯基丙酮酸脫氫酶、潮霉素磷酸轉移酶、新霉素磷酸轉移酶、茅草枯脫齒素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、鄰氨基苯甲酸酯合酶、草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰基轉移酶。可以將含有至少一個可操作地連接于標志基因或其它目的核苷酸序列的SCBV增強子(例如在嵌合的轉錄調節區的背景中)的構建體投遞到組織(例如經轉化的)中，并且通過依賴于所轉錄的標志或序列的合適機制來分析該組織。當將調節元件可操作地連接于穩定植物中有農藝學利益的基因時，可以將這類定量或定性分析用作工具來評估該調節元件的潛在表達譜。在瞬時測定法中可以使用標志基因；在瞬時測定法中測試標志基因表達的方法是本領域中普通技術人員已知的。已經報告了使用多種植物、組織和DNA投遞系統的標志基因的瞬時表達。例如，瞬時分析系統包括但不限于，在使用任何感興趣的植物物種的任何瞬時植物測定法中經由對組織的電穿孔或粒子轟擊進行的直接基因投遞。這類瞬時系統會包括但不限于，對來自多種組織來源的原生質體的電穿孔或對感興趣的特定組織的粒子轟擊。本公開涵蓋了任何瞬時表達系統評估調節元件的用途，所述調節元件可操作地連接于任何可轉錄的多核苷酸分子，其包括但不限于標志基因或有農藝學利益的基因。預想通過合適的投遞系統在瞬時中測試的植物組織的例子包括但不限于，葉基組織、愈傷組織、子葉、根、胚乳、胚、花組織、花粉、和表皮組織。VI1.植物轉化可以使用任何植物轉化方法將含有如本文中描述的增強子元件(或其多個拷貝)或嵌合的轉錄調節區的植物轉化構建體引入植物中。在本發明的實踐中，用于通過將植物表達構建體引入到植物基因組中來轉化植物的方法和材料可以包括任何公知且經過證明的方法，包括電穿孔(例如美國專利N0.5，384，253)、微粒轟擊(microprojectilebombardment)(例如美國專利 Nos.5，015，580; 5, 550，318; 5，538，880; 6, 160，208; 6, 399，861;和6，403，865)、土壤桿菌介導的轉化(例如美國專利Nos.5，824，877; 5, 591，616; 5，981，840;和6，384，301)、和原生質體轉化(例如美國專利N0.5，508，184)。對本領域中的技術人員明顯的是，可以利用并修改許多轉化方法學以從任意數量的感興趣的靶作物生成穩定的轉基因植物。用于轉化雙子葉植物的特定方法是本領域中的技術人員已知的。舉例而言，已經描述了許多農作物的轉化和植物再生方法，所述農作物包括但不限于，棉花(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)和蕓苔屬(Brassica)的成員。類似地，用于轉化單子葉植物的具體方法也是本領域中的技術人員已知的。舉例而言，已經描述了許多農作物的轉化和植物再生方法，所述農作物包括但不限于，大麥(Hordeum vuIgarae);玉米(玉蜀黍)；燕麥(Avena sativa)；野茅(orchard grass) (Dactylis glomerata);稻(Oryza sativa,包括秈稻和粳稻品種)；高粱(Sorghum bicolor);甘鹿(甘鹿屬(Saccharum)的種)；高羊茅(tall fescue)(Festuca arundinacea);草坪草(turfgrass)物種(例如 Agrostis stolonifera, Poapratensis, Stenotaphrum secundatum);小麥(Triticum aestivum),和苜猜(Medicagosativa)。可以對經轉化的植物分析目的基因的存在以及由本文中描述的嵌合的轉錄調節區賦予的表達水平和/或譜。 本領域中的普通技術人員可使用眾多用于分析經轉化植物的方法。例如，用于植物分析的方法包括Southern和Northern印跡分析、基于PCR(或其它基于核酸擴增)的辦法、生化分析、表型篩選方法、田間評估、和免疫診斷測定法(例如用于蛋白質的檢測、定位、和/或定量)。已經在玉米中證明了使用所描述的SCBV增強子的增強的基因表達，但預期該增強子在其它植物物種中起作用，所述植物可能包括雙子葉植物以及單子葉植物。具有4個SCBV上游區拷貝的增強子元件提供了本文中研究的組合的最高表達水平。更少或更多的上游區拷貝、以及與來自其它來源的增強子元件的組合也可以提供調控基因表達的優點。同樣的激活子、構建體和辦法可能可以用于其它農作物物種，所述農作物物種由于其基因組序列可獲或正在進展中可以對其鑒定基因(包括高粱(Sorghum bicolor)、小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、粟(Foxtail millet)(Setaria italica)、甘鹿(Saccharum off icinarum)、巨芒(Miscanthus giganteus)),或者可以通過后續基因組測序努力或可能的染色體同線性來對其鑒定‘活化基因’(包括燕麥(Avena sativa)、黑麥(Secale cereale)、珍珠粟(Pennisetum glaucum)、龍爪稷(Finger millet) (Eluesinecoracana)、黍稷(Proso millet) (Panicum miliaceum) >Teff millet (Eragrostis tef)),或用于其基因組序列可獲或正在進展中的模式草物種(包括紫色假燕麥(Brachypodiumdistachyon)、狗尾草(Green bristlegrass) (Setaria viridis))。提供以下實施例以例示某些具體特征和/或實施方案。不應將這些實施例理解為限制本發明為所描述的具體特征或實施方案。
實施例實施例1:對包含甘蔗桿狀病毒(SCBV)啟動子的增強子元件的序列的鑒定
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本實施例例示了對包含SCBV啟動子增強子元件的序列的鑒定。首先通過瞬時表達測定法檢查自SCBV基因組(GenBank登錄號AJ277091，并由Geijskes等，Arch.Virol.，147:2393-2404, 2002描述)衍生的啟動子片段以確定該啟動子序列的哪些區域含有增強子元件序列。在啟動子分析研究中，將自SCBV啟動子(SEQID NO:1)衍生的多個片段克隆到螢火蟲熒光素酶(LUC)報告蛋白的編碼區上游，所述各片段含有從轉錄起始位點(定義為+1位置)-839至+106bp (質粒pSCBV839)、從-576至+106bp (質粒pSCBV576)、以及從-333至+106bp (質粒pSCBV333)的序列。轉錄由胭脂堿合酶(Nos) 3’UTR區的一個拷貝終止(如公開在GenBank登錄號V00087.1 (其通過提述據此完整并入)的堿基1847-2103以及
圖1中的)。通過用粒子轟擊將它們轉化到玉米H1-1I懸浮細胞(在下面實施例2中有具體描述)中并監測LUC報告基因的活性來測試這些構建體的瞬時轉錄活性。通過將等摩爾量的質粒DNA(含有SCBV = LUC構建體)和參照質粒的DNA共轉化來標準化各實驗中的螢光素酶活性，所述參照質粒攜帶由驅動GUS ( β -葡糖醛酸糖苷酶)編碼區表達的玉米泛素l(ubil)基因啟動子(如公開于美國專利N0.5，510，474，其通過提述完整據此并入；基本上GenBank登錄號S94464.1的堿基7-1990，其通過提述完整據此并入)和終止表達的玉米Per53’ UTR終止子組成的構建體(如公開于美國專利N0.6，699，984，其通過提述完整據此并入；例如構建體ubil:⑶S)。轟擊后兩天，從經轉化的細胞分離總蛋白并通過發現于例如(Maliga等，Methods in Plant Molecular Biology.A Laboratory Course Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)的方法來測量LUC酶活性(表達為螢光素酶單位(LU) /mg蛋白)和⑶S酶活性(表達為⑶S活力單位(GU) / μ g蛋白)。通過將LUC水平對⑶S水平標準化為LU/mg蛋白:⑶/ μ g蛋白的比率，來比較三種SCBV = LUC構建體中測試啟動子的相對活性。瞬時測試結果顯示LUC活性隨著轟擊的質粒DNA濃度的增加也線性增加，提示LUC活性與轉錄本水平相關。進一步地，含有轉錄起始位點上游_576bp至下游+106bp的序列的SCBV啟動子片段具有全長啟動子片段(此處定義為含有起始位點上游_839bp至下游+106bp的序列)66%±2%的活性。相比之下，含有轉錄起始位點上游_333bp至下游+106bp的序列的SCBV啟動子片段僅具有全長啟動子片段17%土 1%的活性。因此，對應于大部分SCBV啟動子活性的序列位于從轉錄起始位點起-333bp的上游。檢查了 SCBV啟動子序列的能夠增強異源最小啟動子序列驅動的轉錄的部分。如由這些實驗限定的，增強子元件被操作性鑒定為短(200-300bp)的順式作用DNA序列(缺乏TATA盒)，當在瞬時或穩定轉化系統中對其進行測試時，在將其置于異源最小啟動子序列的5’附近時，以可重復且可測量的方式增加異源最小啟動子的表達活性。此外，增強子元件的串聯重復比其單拷貝提供了更高的異源最小啟動子表達活性水平。在本實施例中利用的異源最小啟動子元件包含玉米醇脫氫酶I (Adhl)基因啟動子(對應于GenBank登錄號X04049的堿基997-1202，其通過提述完整據此并入，如其在2010年8月30日公開可獲的)從-100至+106的堿基。將兩個自SCBV啟動子衍生的片段克隆到包含最小玉米Adhl啟動子及與之融合的編碼區(編碼螢火蟲螢光素酶(LUC)蛋白)的序列的5’端，所述片段包含相對于轉錄起始位點從-503至-222bp和從-758至_222bp的序列。如上文所描述的通過Nos3’ UTR終止嵌合基因的轉錄。轉化玉米H1-1I懸浮培養細胞，其通過用攜帶LUC和GUS構建體的質粒DNA進行粒子轟擊，并如上文所述測量和比較酶活性。相對于沒有加入SCBV序列的最小Adhl啟動子，包含具有置于最小Adhl啟動子5’端的-503至-222序列或-758至-222序列的LUC構建體的質粒分別顯示出多6倍和多4倍的LUC活性。因此，在SCBV啟動子的這些片段中的序列增強了由異源玉米啟動子介導的轉錄活性。

通過將-502至_222bp序列的I個、2個或4個拷貝克隆到融合于LUC編碼區的最小玉米Adhl啟動子5’端來測試-503至-222bp SCBV增強子區的多拷貝增加由最小Adhl啟動子介導的表達的能力(圖3A)。將攜帶該構建體(以及具有參照ubil:GUS構建體的質粒DNA)的質粒DNA轟擊到玉米H1-1I懸浮培養細胞中，并如上文所述測量和比較LUC和GUS活性。相對于用缺乏SCBV增強子序列的類似的最小Adhl啟動子構建體轟擊的細胞，用含有SCBV增強子序列的I個、2個或4個拷貝的構建體轟擊的細胞分別具有超過5倍、6倍和10倍更多的LUC活性(圖3B)。包含SCBV啟動子(如SEQ ID NO:1中提供的)的_502至_222bp的核酸堿基編碼轉錄活化活性，該活性賦予植物啟動子更好的表達屬性。進一步地，通過堆積包含SCBV啟動子(如SEQ ID NO:1中提供的)的-502至_222bp的堿基的多個串聯拷貝來增加轉錄活化活性。再進一步地，還可以檢查和利用本文中提供的方法和試劑來提供保持轉錄活化活性的更短的序列，或者可以在新的組合中與其它轉錄激活子元件和植物啟動子組合。實施例2:玉米H1-1I懸浮培養細胞中SCBV = LUC和ubl:⑶S構建體的瞬時表達測試本實施例描述了玉米H1-1I懸浮培養細胞中SCBV = LUC和ubl:⑶S構建體的瞬時表達測試。通過用按上文所描述的構建的攜帶LUC和⑶S構建體的質粒DNA進行粒子轟擊轉化玉米H1-1I懸浮培養細胞(Armstrong等，Maize Genet.Coop.Newslett.,65:92-93, 1991)，并測量和比較酶活性。使用QiAfilter 質粒Maxi試劑盒(Qiagen, Germantown, Maryland)來大量制備質粒DNA,并使用標準的分子方法來分析其數
量和質量。用于轟擊的玉米H1-1I懸浮培養細胞的制備.在H9CP+培養基中于28°C在黑暗中，在125rpm的振蕩器上維持H1-1I細胞(H9CP培養基由以下組成:MS鹽4.3gm/L、蔗糖3%、酪蛋白氨基酸 200mg/L、肌醇 100mg/L、2, 4_D2mg/L、NAA2mg/L、1000X MS 維生素 ImL/L、L-腦氨酸 700mg/L、和椰子汁(coconut water) (Sigma Aldrich, St.Louis, MO) 62.5mL/L，pH6.0)。在轟擊前，將2日齡的H1-1I培養物轉移到G-N6培養基(CHU N6培養基3.98g/L、CHU N6 維生素 lmL/L (兩種 CHU組分都來自 PhytoTechnology Laboratories , Lenexa, KS)、肌醇100mg/L、2，4-D2mg/L和蔗糖3%，pH6.0)中并允許其生長24小時。在轟擊當日，將G-N6生長的細胞(2.5gm細胞)轉移到置于G-N6培養基(含有0.5M D-山梨糖醇和0.5M D-甘露醇)上的無菌Whatman N0.1濾紙盤(55mm),并溫育4小時。使用經滲透調節過的細胞進行轟擊。具有質粒DNA的金顆粒的制備和轟擊測定法.用70%乙醇清洗金顆粒(I μ m直徑，BioRad, Hercules, CA) 10分鐘，然后用無菌水清洗3次。將顆粒以120mg/mL的濃度分散至丨J 50%甘油中。對于一個典型實驗，將150 μ L(18mg)金顆粒、約5 μ g質粒DNA、150 μ L2.5ΜCaCl2、和30 μ L0.2Μ亞精胺組合起來。在室溫將反應(總體積375 μ L)溫育10分鐘，偶爾溫和攪動。將DNA包被的金顆粒短暫離心、用420 μ L70%乙醇清洗，隨后用420 μ L100%乙醇清洗。將最終的離心沉淀重懸于110 μ L100%乙醇中并用Bransonl450超聲波儀進行簡單的超聲處理(3次各3秒的脈沖，每次脈沖之間為I分鐘)。將用DNA包被的金顆粒的12.2 μ L等分試樣散布到9個大擔載體(macrocarrier) (BioRad, Hercules, CA)的每一個上，并在使用BioRad roSlOOO/He系統的轟擊測定法中使用。使用3510psi盤以靶距離9cm轉化懸浮培養細胞，并且每 個板轟擊3次。在轟擊后，將細胞在黑暗中于28°C溫育，首先在含有D-山梨糖醇和D-甘露醇培養基的G-N6上溫育12小時，接著在G-N6板上再溫育36小時。從板上收集細胞，吸干以除去緩沖液，并用300μ L2x CCLT LUC提取緩沖液(PromegaCorporation, Madison, WI)提取。離心后，收集約600 μ L蛋白質提取物。使用Bradford測定法估算蛋白質濃度。測量LUC酶活性(表示為螢光素酶單位(LU)/mg蛋白)和GUS酶活性(表示為GUS 活力單位(GU)/μ g 蛋白)，其通過在例如 Maliga 等(Methods in Plant MolecularBiology.A Laboratory Course Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)中記載的方法。通過將LUC水平對⑶S水平標準化為LUC/mg蛋白:⑶S/μ g蛋白的比率來比較SCBV = LUC構建體中測試啟動子的相對活性。實施例3:用于玉米植物中激活標簽化的質粒本實施例描述了土壤桿菌超二元質粒的生成。超二元系統是土壤桿菌穿梭載體/同源重組系統的一個特殊化的例子(Komari等，Meth.Mol.Biol.343:15-41，2006，Komari等，Plant Physiol.114:1155-1160，2007;還參見歐洲專利N0.EP604662B1和美國專利N0.7，060, 876，各通過提述完整并入)。與超二元系統一起采用的根癌土壤桿菌宿主菌株是LBA4404 (pSBl)。菌株LBA4404 (pSBl)攜帶兩個獨立復制的質粒PAL4404和pSBl。pAL4404是Ti質粒衍生的輔助質粒，其含有完整的vir基因集(來自Ti質粒pTiACH5)，但不具有T-DNA區(且因此不具有T-DNA左邊界和右邊界重復序列)。質粒pSBl供應了自pTiBo542衍生的另一 vir基因部分集。在超 二元系統中使用的穿梭載體的一個例子是PSB11，其含有被T-DNA右邊界和左邊界重復區側翼的克隆多接頭，該克隆多接頭充當預定用于植物細胞轉化的基因的引入位點。穿梭載體PSBll不能在土壤桿菌中獨立復制,但在經由pSBl和pSBll上存在的共有序列之間的同源重組整合到pSBl中時作為共整合質粒穩定維持在土壤桿菌中。由此，通過自兩種不同的土壤桿菌Ti質粒來源(pTiACH5和pTiBo542)衍生的Vir蛋白有效地作用于經修飾的pSBll載體上的LBA4404(pSBl)中引入的完全修飾過的T-DNA區，并將其轉移到植物細胞中。已經證明超二元系統在單子葉植物物種的轉化中特別有用(參見Hiei等，Plant J.6:271-282, 1994，和Ishida 等,Nat.Biotechnol.14:745-750，1996)。用于生成經激活標簽化的玉米植物的轉化質粒可以包括通過超二元質粒pSBl和pEPP1088(具有pSBll載體骨架)之間的同源重組形成的共整合質粒(參見歐洲專利N0.EP604662B1和美國專利N0.7060876，各通過提述據此并入)。所述共整合質粒被稱為pSBl::pEPP1088或ZeaTAG載體。pEPP1088的結構由限制酶分析和對構建體的選定區域的DNA序列測定驗證。pEPP1088在T-DNA左邊界(LB)和右序列(RB)序列(由pSBll質粒提供)之間的位置處含有上文所描述的-502至-222bp SCBV增強子序列的4個拷貝以及可選擇的標志基因，其由以下構成:稻(Or yza sativa)肌動蛋白基因啟動子和相關的第I內含子和5’UTR(基本如GenBank登錄號EU155408.1的堿基12-1411所公開的，其通過提述完整據此并入)、AAD-1除草劑耐受蛋白的編碼序列(如美國專利申請N0.20090093366中公開的)、和來自玉米脂肪酶的3’UTR終止序列(基本如GenBank登錄號gb | L35913.1 |MZELIPASE的堿基921-1277和美國專利N0.7，179，902中所公開的，其通過提述完整據此并入)。pEPP1088的T-DNA (且如存在于pSBl::pEPP1088中的)在通過土壤桿菌介導的轉化引入玉米細胞中時整合到玉米染色體中的隨機位置處。對經轉化的玉米細胞的選擇由T-DNA中的組成性表達的AADl可選擇標志基因提供。攜帶強力的-502至_222bp SCBV轉錄增強子激活子元件的串聯拷貝的T-DNA導致整合位點附近天然基因的異常表達，由此在一些情況中，為從經轉化的組織再生的植物提供了新的可鑒定的性狀。存在幫助對受體位點附近受影響的基因進行分離和鑒定的現代分子生物學方法，由此為分離的基因用于進一步開發提供了條件。實施例4:土壤桿菌介導的玉米轉化本實施例描述了土壤桿菌介導的玉米轉化的生成。未成熟胚的生成.將來自B104近交系的種子種植到含有SunshineCustom Blend 160 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA)的 4 加侖罐中。使用高壓鈉和金屬鹵化物燈與16:8小時光照:黑暗光周期的組合，使植物在溫室中生長。為了獲得用于轉化的未成熟的胚，實施受控的近緣授粉。在授粉后10-13天當胚大小為約1.4-2.0mm時，分離未成熟的胚。感染和共培養.通過將玉米穗浸沒到有Tween20 (每500mLl或2滴)的50%商品化漂白劑中10分鐘，并用無菌水漂洗3次對其進行表面消毒。將在YEP固體培養基(含有50mg/L壯觀霉素、10mg/L利福平、和50mg/L鏈霉素)上于28°C生長3天或于25°C生長4天的細菌取I或2個菌環轉移到含有100 μ M乙酰丁香酮的5mL液體感染培養基(MS鹽、ISU修改的MS維生素、3.3mg/L麥草畏、68.4gm/L鹿糖、36gm/L葡萄糖、700mg/L L-脯氨酸，PH5.2)中，來制備含有超二元載體共整合質粒的土壤桿菌細胞的懸浮液。使用無菌5mL移液管溫和地吹打該溶液，直到得到均勻的懸浮液，并將濃度調節到使用UltrospeclO細胞密度儀(GE Healthcare/Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)在 6OOnm 處(OD600)測量的光密度為0.3-0.5。將未成熟的胚直接分離到含有2mL感染培養基的微離心管中。除去培養基并用l_2mL新鮮的感染培養基替換2次，然后將其除去并用1.5mL 土壤桿菌溶液替換。將土壤桿菌和胚溶液在室溫溫育5分鐘并轉移到共培養培養基中，該培養基含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、3.3mg/L麥草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、IOOmg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解產物、15mg/L AgNO3、100μΜ乙酰丁香酮、和2.3_3gm/LGelzan (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO), pH5.8。共培養溫育在黑暗下或在24小時白熒光光照條件(約50 μ EnT2s-1)下于25°C進行3-4天。靜息和選擇.共培養后，將胚轉移到無選擇的基于MS的靜息培養基中，該培養基含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、3.3mg/L麥草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、IOOmg/L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解產物、15mg/LAgN03、0.5gm/L MES (2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(ethanesulfonic acid monohydrate) ;PhytoTechnologies Labr., Lenexa, KS) >250mg/L羧芐青霉素、和2.3gm/L Gelzan , pH5.8。溫育在黑暗下或在24小時的白熒光光照條件(約δΟμΕπΓ2^)下于28°C進行7天。在7日靜息期后，將胚轉移到選擇性培養基中。為了選出經超二元質粒(含有植物可表達的AADl可選擇標志基因)轉化的玉米組織，使用補充有氟吡氯禾靈(Haloxyfop)的基于MS的靜息培養基(如上)。將胚首先轉移到含有IOOnM氟吡氯禾靈的選擇培養基中并溫育1-2周，然后轉移到含有500nM氟吡氯禾靈的選擇培養基中并再溫育2-4周。經過在黑暗下或在24小時白熒光光照條件下(約50 μ Em-2S-1)于28°C約5-8周的過程，獲得經轉化的分離株。通過將回收的分離株每隔1-2周轉移到新鮮的選擇培養基中使其壯大，以用于再生和進一步分析。

玉米轉化領域中的技術人員會理解當使用其它的植物可表達的、可選擇的標志基因(例如除草劑耐受基因)時有其它選擇經轉化的植物的方法可供使用。預再生.在選擇過程后，將暴露于24小時光照方案的培養物轉移到基于MS的預再生培養基中，該培養基含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、45gm/L蔗糖、350mg/L L-脯氨酸、100mg/L 肌醇、50mg/L 酪蛋白酶促水解產物、lmg/L AgN03、0.25gm/L MES、0.5mg/L 萘乙酸、2.5mg/L脫落酸、lmg/L6_節氨基嘌呤、250mg/L羧節青霉素、2.5gm/L Gelzan jP500nM氟吡氯禾靈，pH5.8。在24小時白熒光光照條件(約50 μ EnT2s-1)下于28°C持續溫育7天。再生和小植株分離.為了再生，將培養物轉移到基于MS的第一再生培養基中，該培養基含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、60gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、125mg/L羧芐青霉素、2.5gm/L Gelzan 、和500nM氟吡氯禾靈，pH5.8。在黑暗下或在24小時白熒光光照條件(約50 μ Em-2S-1)下于28°C 2周后，將組織轉移到基于MS的第二再生培養基中，該培養基由以下構成:MS鹽、ISU修改的MS維生素、30gm/L鹿糖、100mg/L肌醇、3gm/L Gelzan , pH5.8(有或無500nM氟吡氯禾靈)。再生/選擇在16小時或24小時白熒光光照條件(約50 μ En^s—1)下于28°C持續2周。當小植株長度達到3-5cm時，將它們切下并轉移到第二再生培養基(如上，但無氟吡氯禾靈)中，并在16小時白熒光光照條件(約50 μ EnT2iT1)下于25°C溫育以允許芽和根的進一步生長和發育。種子生成.將植物移植到Metro-Mix 360無土生長培養基(Sun GroHorticulture)中并在生長室中使其長壯(harden off)。然后將植物移植到SunshineCustom Blendl60土壤混合物中并在溫室中生長至開花。進行受控的授粉以用于種子生成。實施例5:穩定轉化的玉米細胞中的SCBV增強子活性從自經轉化的B104未成熟胚再生的10株Ttl植物分離出基因組DNA (Qiagen DNeasy 植物 Mini 試劑盒；Qiagen, Germantown, Maryland),并通過反向 PCR克隆和對由反向PCR擴增的產物進行DNA測序來測定整合的T-DNA (從pSBl::pEPP1088轉移)的基因組位置。通過使用側翼序列作為查詢序列的BLAST搜索(Altschul等，J.Mol.Biol., 215:403-410,和 Karlin 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264-2268，1990)，確定位于4xSCBV增強子的IOkb內的側翼編碼區所代表的基因的身份。對BLAST結果的分析揭示，T-DNA(因此4XSCBV增強子亦然)在10個系的每一個中都被整合到不同的基因組位置，且因此4XSCBV增強子在每個系中都被不同的基因側翼(表I)。從10個Ttl系的葉組織中分離出總RNA (Qiagen _RNeasy 植物Mini試齊[J盒，Qiagen, Germantown, Maryland)。通過使用針對側翼于4XSCBV增強子的相關基因的特異性引物進行逆轉錄和RT-PCR(實時PCR)，在合適的Ttl植物和未經轉化的對照植物之間比較鑒定的側翼序列的轉錄本累積。作為對照，還測定了內源GAPDH基因的轉錄本累積。RT-PCR產物揭示這些系中來源于3個不同的側翼基因的轉錄本的累積增加了。4XSCBV增強子在2個Ttl系中位于受影響的側翼基因的上游2.6kb和2.8kb，在第3個Ttl系中位于受影響的側翼基因的下游478bp。由此，這些結果指示由T-DNA投遞的4XSCBV增強子導致整合位點附近基因轉錄本的不依賴于鏈的、增加的累積(strand-1ndependentincreased accumulation)。表I指示了鑒定出的側翼基因和對其轉錄水平的分析結果。表1.4XSCBV增強子對10株Ttl植物中側翼基 因的RNA累積的影響。
權利要求
1.一種嵌合的轉錄調節區，包含: 顯示在SEQ ID NO:1的位置337至位置618中的甘蔗桿狀病毒(SCBV)增強子元件或其同源物的一個或多個拷貝；和 可操作地與其連接的、包含RNA聚合酶結合位點和mRNA啟動位點的啟動子， 其中當在所述嵌合的轉錄調節區的調節性控制下轉錄目的核苷酸序列時，轉錄產物的量相比于用包含所述啟動子但不包含所述SCBV增強子序列的嵌合的轉錄調節區所獲得的轉錄廣物的量提聞。
2.權利要求1的嵌合的轉錄調節區，其中所述啟動子從植物病毒基因、細菌基因、真菌基因、植物核基因、植物核外基因、無脊椎動物基因、或脊椎動物基因的上游區獲得。
3.一種構建體，其包含權利要求1的轉錄啟動區，所述轉錄啟動區可操作地連接于可轉錄的多核苷酸分子，所述可轉錄的多核苷酸分子可操作地連接于3’轉錄終止多核苷酸分子。
4.權利要求3的構建體，其中所述可轉錄的多核苷酸分子賦予其中表達所述多核苷酸分子的植物以農藝性狀。
5.用權利要求3的構建體穩定轉化的轉基因植物。
6.權利要求5的轉基因植物，其中所述可轉錄的多核苷酸分子賦予其中表達所述多核苷酸分子的植物以農藝性狀。
7.權利要求5的轉基因植物的種子，其中所述種子包含所述構建體。
8.權利要求5的轉基因植物，該植物是玉米植物。
9.包含權利要求1的嵌合的轉錄調節區的轉基因植物細胞。
10.一種生成轉基因植物的方法，包括用權利要求3的構建體來轉化植物細胞或組織。
11.權利要求10的方法，其中所述轉基因植物是雙子葉植物。
12.權利要求10的方法，其中所述轉基因植物是單子葉植物。
13.用權利要求3的構建體轉化的植物細胞或組織。
14.權利要求13的植物細胞或組織，其中所述植物細胞或組織來源于雙子葉植物。
15.權利要求13的植物細胞或組織，其中所述植物細胞或組織來源于單子葉植物。
16.可以從權利要求6的轉基因植物獲得的植物細胞、果實、葉、根、芽、花、種子、插條、和其它可用在有性或無性繁殖中的繁殖材料、包含Fl雜交種的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物及植物產物。
17.一種玉米植物細胞、組織或植物，其包含顯示于SEQ ID NO:1的位置337至位置618中的甘蔗桿狀病毒(SCBV)增強子元件或其同源物的一個或多個拷貝，其中所述SCBV增強子元件的一個或多個拷貝被插入到所述玉米植物細胞、組織或植物的基因組中的隨機位置處。
18.權利要求17的玉米植物細胞、組織或植物，其中所述SCBV增強子賦予在其調節性控制下的目的核苷酸序列以增強的轉錄，所述增強的轉錄是與不存在SCBV增強子時該目的核苷酸序列的轉錄相比而言的。
全文摘要
對新的增強子序列的鑒定在植物功能基因組學中具有重大的效用。已經鑒定了甘蔗桿狀DNA病毒(SCBV)轉錄增強子。該增強子可以用于增加從基因啟動子及在激活標簽化實驗中的轉錄速率。當將4列SCBV增強子置于玉米醇脫氫酶最小啟動子截短形式的上游時，觀察到轉錄中有10倍的增加。描述了使用SCBV轉錄增強子的方法，以及包含一個或多個該增強子拷貝的嵌合的轉錄調節區、構建體、細胞、組織和微生物。
文檔編號A01H5/10GK103201389SQ201180052649
公開日2013年7月10日 申請日期2011年8月29日 優先權日2010年8月30日
發明者J.P.戴維斯, V.S.蕾蒂, W.M.艾恩利, M.A.湯普森 申請人:陶氏益農公司