專利名稱：一個甘藍型油菜缺磷誘導表達啟動子的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種油菜BnPR2基因啟動子及其應用，本發明提供了一個油菜缺磷誘導表達啟動子及應用。
背景技術：
磷是植物生長發育必需的大量營養元素，它不僅是植物體內核酸、磷脂、ATP等重要分子的組成成分，而且在能量傳遞和代謝途徑調控中發揮著一系列重要作用。植物主要利用根以磷酸根的形式吸收磷。雖然土壤中磷的總量非常豐富，但由于磷酸根很容易被土壤顆粒以及金屬離子吸附固定，所以土壤中磷的生物有效性非常低，缺磷經常成為限制作物產量的因素。施用磷肥成為目前保障作物產量的重要栽培措施。然而，施入土壤的磷肥當季利用率很低，往往隨水土淋失而進入水體，造成了潛在的水體富營養化等環境問題。另外，磷礦屬不可再生資源，估計60-90年后，易于開采的磷礦將被耗竭。為了實現農業的可持續發展，必須提高磷肥的利用效率，減少磷肥的施用量。培育耐低磷或磷高效的作物品種是一項經濟有效且環境友好的辦法。Gao等(Gao N, Su Y，Min J，Shen W,Shi ff.Transgenic tomato overexpressing ath_miR399d has enhanced phosphorusaccumulation through increased acid phosphatase and proton secretion as well asphosphate transporters.Plant and Soil, 2010, 334:123-136)將擬南芥miR399d 在番爺中超表達。轉基因植株提高了磷轉運子的表達，磷酸酶的活性和質子的分泌，最終表現出較高的憐吸收和葉片憐濃度。Li!等(LiiJ, Gao X, Dong Z, YiJ, An, L.1mproved phosphorusacquisition by tobacco through transgenic expression of mitochondrial malatedehydrogenase from Penicillium oxalicum.Plant Cell Reports, 2012, 31:49-56)的石開究表明，超表達線粒體蘋果酸脫氫酶(MDH)的轉基因煙草提高了對鋁磷、鐵磷和鈣磷的利用能力，增加了對的磷吸收，累積了更多的生物量。現有的植物基因工程通常采用CaMV 35S、Ubi和Actl等組成型啟動子。由于組成型啟動子在不同組織和不同環境 條件下都能驅動下游基因的表達。這不僅浪費能量，而且影響植物正常的生理代謝。因此通過誘導型啟動子或組織特異型啟動子控制實現導入基因的環境誘導表達或組織特異表達具有重要意義。誘導型啟動子(inducible promoter)在正常生長條件下不驅動下游基因的轉錄或者轉錄水平很低，而在某些物理、化學或生物信號的刺激下，可以大幅度地提高基因的轉錄水平。誘導型啟動子的優勢在于可根據需要在植物特定的發育階段或生長環境，讓其接受外界信號而激活下游基因表達；也可以去除誘導信號，停止目的基因表達。誘導型啟動子在基礎研究和生產實踐中均具有重要的應用價值。本發明人通過研究甘藍型油菜缺磷誘導表達基因，獲得了一個缺磷誘導表達啟動子，該啟動子能夠用于耐低磷或磷高效作物的培育，也可以用于缺磷誘導表達基因調控機制研究。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一個缺磷誘導表達啟動子，該啟動子來源于甘藍型油菜(Brassica napus),其位于基因BnPR2的上游。本發明所涉及的技術方案是:利用甘藍型油菜缺磷誘導表達基因BnPR2的基因組序列在蕓薹屬序列數據庫中進行BLAST分析，獲得與BnPR2序列一致的白菜BAC。根據BAC序列設計引物，擴增BnPR2的上游序列。然后將該序列與報告基因⑶S融合，構建重組表達載體PBnPK2:⑶S，通過農桿菌介導轉化擬南芥，經過抗生素篩選，PCR鑒定獲得含有BnPR2啟動子的轉基因植株。在正常和缺磷、缺氮、缺鉀、缺硫、缺鐵條件下培養轉基因植株，檢測不同缺素植株的GUS活性，結果只有缺磷植株顯藍色，正常和其它元素缺乏植株沒有藍色顯現，說明BnPR2啟動子具有缺磷誘導性。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO:1是本發明克隆的甘藍型油菜缺磷誘導表達啟動子的核苷酸序列，其中l_1459bp是本發明的啟動子序列，第1460-1501是基因BnPR2的部分核苷酸序列。圖1是重組表達載體PBnPK2:GUS的T-DNA區示意圖。該載體含卡那霉素(Kna)抗性篩選基因。圖2是ΡΒηΡΚ2:⑶S表達載體的酶切鑒定圖。圖3是不同元素缺乏條件下P_2:GUS轉基因擬南芥的⑶S染色結果。其中A，為缺氮處理；B為缺磷處理；C為缺鉀處理；D為缺硫處理；E為缺鐵處理；F為對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但不是限制本發明。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，例如參見《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社，北京)。引物合成由北京奧科生物技術有限責任公司完成，序列測定由華大基因科技股份有限公司武漢測序部完成。實施例lBnPR2啟動子的克隆(I)基因BnPR2是發明人從甘藍型油菜(Brassica napus,鄂油長莢；劉定富等，甘藍型油菜特長莢突變體的發現和鑒定.湖北農學院學報，1994，14(2):1-5)中分離到的一個缺磷誘導表達基因。正常條件下在油菜根中檢測到該基因微弱表達，在葉片中沒有檢測到表達；缺磷條件下該基因在根和葉中表達量急劇上升。通過對BnPR2的基因序列進行 BLAST 分析(http: //brassica.bbsrc.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html)，在BrassicaDB數據庫中找到與BnPR2序列一致的白菜BAC (登錄號為⑶695313)。根據該BAC序列設計下列引物對:PF: 5 ’ -CCTGCAGGAATTTTAGAATGTTGTGTCG-3，，PR: 5 ’ -TCTAGATCTTTTGATTTGTGGTGTTGTGC-3，。其中帶下劃線的堿基為添加的限制性內切酶位點，引物PF添加了一個Sda I酶切別位點，引物PR添加了一個Xba I酶切位點。以甘藍型油菜 (鄂油長莢)基因組DNA為模板，利用高保真DNA聚合酶KOD plus擴增基因BnPR2的上游序列。PCR反應體系為:DNA (50ng/ μ L) 4.0 μ L，ddH20 9.0 μ L, IOX PCR 緩沖液 2.0 μ L, MgSO4 (25mM) 1.0 μ L，dNTP(2.0mM)2.0μ L,引物 PF (10 μ Μ) 0.8 μ L，引物 PR(10 μ Μ) 0.8 μ L，KOD-plus (IU/μ L) 0.4 μ L0 PCR緩沖液，MgSO4, dNTP，KOD-plus DNA聚合酶均來自東洋紡(上海)生物科技有限公司。PCR反應條件為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，68°C延伸2分鐘，35個循環；最后68°C保溫5分鐘。PCR擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，得到大小為1500bp左右的單一條帶。(2)利用道普公司的PCR產物回收試劑盒對擴增產物進行純化回收，具體方法參見道普公司該試劑盒的說明書。隨后對PCR產物末端加“dA”，與pGEM T Easy載體(購自武漢潔洋盛生物科技有限公司)連接。載體試劑盒來自Promega公司，具體方法參見該公司試劑盒說明書。然后轉化大腸桿菌DH5ci，挑陽性克隆送華大基因科技股份有限公司武漢測序部測序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列長度為1501bp。與已獲得的BnPR2基因組DNA序列相比較，顯示該序列與基因BnPR2的5’端有42個堿基重疊，所以認為克隆到的長1501bpDNA片段是基因BnPR2的候選啟動子。測序結果顯示，該啟動子的序列如SEQ ID NO:1中第l_1459bp所示，在該啟動子的下游是基因BnPR2的部分核苷酸序列(5，端42個堿基)，SEQ IDNO:1中的第1460位堿基“G”為轉錄起始位點。BnPR2啟動子屬于典型的TATA盒型啟動子，第1428位堿基為TATA框。利用PLACE數據庫(http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE/signalscan.html)對BnPR2啟動子序列進行順式作用元件分析，顯示其中含有響應不同環境信號或控制組織特異表達的順式作用元件，其中與磷營養有關的是3個PlBS元件。 實施例2植物表達載體的構建為確定BnPR2啟動子的表達特性，構建含有BnPR2啟動子和報告基因⑶S的植物表達載體。具體方法是:(I)選擇實施例1中啟動子序列完全正確的克隆，在含有50μ g/mL氨芐的LB培養基中大量搖菌，利用道普公司的小量質粒提取試劑盒提取質粒，具體方法參見道普公司該試劑盒的說明書。隨后用限制性內切酶Sda I和Xba I雙酶切含有BnPR2啟動子的質粒和PBI121載體(華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室代書桃惠贈，在以前華中農業大學的專利申請中已提及該載體)。酶切體系如下:含BnPR2啟動子的質粒或pBI121載體32.4 μ L, IOX Sda I 緩沖液 4.0 μ L，內切酶 Sda I 1.2 μ L，內切酶 Xba I 2.4 μ L0 限制性內切酶及緩沖液來自MBI公司。37°C酶切10小時。酶切產物在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，用手術刀片切下目標條帶，用道普公司的凝膠回收試劑盒予以回收，具體方法參見道普公司該試劑盒的說明書。(2)連接回收產物，連接體系如下:BnPR2啟動子片段(序列如表SEQ ID NO:1所示，長150αρ)8.0μ ，ρΒΙ121片段(具有除CaMV 35S啟動子外的其它所有元件和序列，長13923bp) 8.0yL, IOX T4緩沖液2.0 μ L，Τ4連接酶2.0 μ L。連接酶及緩沖液來自MBI公司。混勻連接體系，4°C連接16小時。
(3)將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 α中。將轉化產物涂布在含50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養基上，37°C培養16小時。挑單克隆于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37°C培養10小時。用引物對PF和PR(序列見實施例1)來檢測菌液。PCR反應體系為:菌液 2.0 μ L，ddH20 13.9 μ L，IOX PCR 緩沖液 2.0 μ L，dNTP (IOmM) 0.4 μ L，引物PF (10 μ Μ) 0.8 μ L，引物 PR(10 μ Μ) 0.8 μ L, rTaq (5U/ μ L) 0.1 μ L。其中 rTaq 聚合酶，PCR 緩沖液購自寶生物工程大連有限公司，dNTP購自Roche公司。PCR擴增條件為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，35個循環；最后72°C保溫5分鐘。PCR產物在1.0 %的瓊脂糖凝膠中電泳，片段大小與BnPR2啟動子相同，且呈單一條帶的克隆被認為是陽性克隆。挑選該陽性克隆，搖菌，提質粒，進一步用Sda I和XbaI雙酶切鑒定插入片段大小是否與BnPR2啟動子符合，結果見圖2。酶切體系及方法同實施例2中的步驟(I)。將構建好的植物表達載體命名為PBnPK2:GUS。實施例3利用植物表達載體PBnPK2:⑶S轉化擬南芥(I)農桿菌感受態的制備:接種農桿菌GV3101 (華中農業大學園藝林學學院張金智惠贈)單菌落于50mLYEB培養液中(牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L,蔗糖5.0g/L,硫酸鎂0.5g/L，用NaOH調pH至7.0)。28 V，200轉/分鐘振蕩培養至OD26tl為0.5左右，冰浴30分鐘。5000轉/分鐘離心5分鐘收集菌體，倒掉上清液，然后用IOmL 0.5mol/L NaCl懸浮菌體。再次離心，菌體懸浮于ImL 20mmol/L CaCl2溶液中。取100 μ L菌液分裝到冰凍的1.5mL離心管中，液氮速凍，并保存于_80°C冰箱中。(2)凍融法轉化農桿菌GV3101:取l.0yg實施例2構建的植物表達載體PBnPK2:⑶S，加入100 μ L冰上解凍的感受態農桿菌中，輕輕混合，冰浴30分鐘。然后在液氮中迅速凍I分鐘，37°C水浴融化5分鐘，冰浴2分鐘，加入ImL YEB培養液(成分同上)。280C，100轉/分鐘搖動培養3小時。5000轉/分鐘離心3分鐘，倒去大部分上清液，剩下100 μ L左右重懸菌體。涂在含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的YEB固體培養基(成分同上，只是按常規計量添加瓊脂，其他成分同YEB培養液)上，28°C培養2天。挑取單菌落于含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的YEB培養液中，28°C，200轉/分鐘搖菌。用實施例1中的引物對PF和P R來確定BnPR2啟動子的存在。PCR反應條件參見實施例2中的步驟(3)。(3)轉化擬南芥。擬南芥的轉化采用花序浸潤法(floral dip)，參照Clough 和 Bent (Clough S J, Bent A F.Floral dip:A simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournal, 1998，16:735-743)報道的方法并略作修改進行。挑取含有PBnPK2:⑶S重組表達載體的農桿菌單菌落接入3mL YEB液體培養基中(含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素)。28°C，200轉每分鐘搖菌I天，再將得到的菌液按2% (體積比)接入150mLYEB液體培養基(含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素)中，28°C，200轉每分鐘振搖使農桿菌的濃度達到OD6tltl約為1.8。在4°C下5000g離心15分鐘，倒掉上清液，菌體重懸于含有
0.02% Silwet-77 (購自LEHEL SEEDS公司)的5%蔗糖溶液中，溶液最終的OD600約為0.8。將生長良好的擬南芥花序浸泡在菌液中5-10秒，直立并用黑色塑料袋包裹，保濕24小時。除去塑料袋，恢復正常培養植株，約一個月后收獲Tl代種子。實施例4轉基因擬南芥的篩選與鑒定(I)陽性苗的篩選將收獲的Tl代擬南芥種子用70% (體積比)乙醇消毒I分鐘，50% (體積比)的84消毒液(市售產品)消毒5分鐘，再用滅菌去離子水清洗5次，均勻鋪在0.6%瓊脂的1/2MS培養基(附加50mg/L卡那霉素)上進行篩選。約10天可區分出陽性苗(轉化苗)和野生型苗(非轉化苗)。可見陽性苗根正常生長，葉片呈綠色；而野生型苗根幾乎不能生長，葉片呈黃白色，逐漸死亡。將篩選到的陽性苗移栽到營養土(蛭石和泥炭按體積比1:1混合而成)中生長。(2)陽性苗的PCR鑒定待陽性苗長出數片蓮座葉，取其葉片，提取基因組DNA(方法見 Doyle JJ, Doyle J L.1solation ofplant DNA from fresh tissue.Focus，1990，12:13-15)。用實施例1中的引物對PF和PR來確定BnPR2啟動子的存在(PCR反應條件參見實施例2)。利用引物對⑶IF (5 ' GCGTTTCGATGCGGTCAC 3 ')和⑶IR(5 ' GCGAGGTACGGTAGGAGTTGG 3 ')來檢測報告基因⑶S是否存在。PCR反應體系為:轉化苗的 DNA(50ng/ μ L) 2.0 μ L，ddH20 13.9 μ L，IOX PCR 緩沖液 2.0 μ L，dNTP (IOmM) 0.4 μ L,弓 I 物⑶IF (10 μ Μ) 0.8 μ L，弓 I 物⑶IR (10 μ Μ) 0.8 μ L，rTaq (5U/μ Ο.1uL0其中rTaq聚合酶，PCR緩沖液購自寶生物工程大連有限公司，dNTP購自Roche公司。PCR擴增條件為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，35個循環；最后72°C保溫5分鐘。只有BnPR2啟動子和報告基因GUS都存在的植株才被認為是真正的轉基因植株，然后正常培養，至收獲T2代種子。T2代種子經過卡那霉素篩選陽性苗和營養土培養(方法同實施例4)，獲得T3代種子。T3代種子經過卡那霉素篩選沒有分離，全部顯綠色的被認為是純合轉基因植株，將用于進一步的GUS組織化學分析。實施例5PBnFK2:⑶S轉基因擬南芥的⑶S組織化學分析將獲得的純合Τ3代轉基因擬南芥先在1/4營養液中培養15天(營養液配方見后)。營養液配方米用改良的Hoagland和Arnon營養液配方，該營養液(又稱標準營養液)的成分及濃度如下:Ca (NO3)2 4.5mM, KNO3 4.0mM, KH2PO4 1.0mM，MgSO4 2.0mM，H3BO346.0 μ M，MnCl2 9.0uMjCuCI2 0.3 μ M, ZnCl2 0.8 μ Μ, Na2MoO4 0.1 μ M和 EDTA-Fe 50.0 μ Μ。然后轉移到1/2的上述標準營養液中培養10天。培養期間每5天更換一次新鮮標準營養液(成分同上)。隨后將一部分植株轉移到缺磷，缺氮，缺鉀，缺硫或缺鐵營養液中培養，另一部分植株仍舊在標準營養液(成分及濃度同上)中培養，作為對照。在缺氮營養液中用4.5mM CaSO4代替Ca (NO3)2，用2.0mM K2SO4代替KNO3，其它成分及濃度同上；在缺磷營養液中用0.5mM K2SO4代替KH2PO4，其它成分及濃度同標準營養液；在缺鉀營養液中用1.0mMNaH2PO4代替KH2PO4,用4. 0mM NaNO3代替KNO3,其它成分及濃度同標準營養液；在缺硫營養液中2.0mMMgCl2代替MgSO4，其它成分及濃度同標準營養液；在缺鐵營養液中直接去掉EDTA-Fe，其它成分及濃度同標準營養液。每種缺素處理采用3個獨立的轉基因株系，每個株系包括2單株。所有植株都生長在溫室中，每天14h光照/IOh黑暗，光強約為200μπιΟ1photonsnT2s4，溫度為 18-23°C，相對濕度 60-80%。缺素處理3天后對植株進行GUS染色(按照常用方法)。方法是，首先將植株放入含有IOmL常用染色液的離心管中，保證整個植株全部浸入溶液中。染色液的成分及濃度如下:lmg/mL的X-Gluc (5-溴-4-氯-3-卩引哚-β -葡萄糖苷酸)，100mmol/L的磷酸鹽緩沖液(0.61 體積的 200moI/LNa2HPO4 與 0.39 體積的 200moI/LNaH2PO4 混合而成，pH 7.0)，10mmol/L 的 Na2EDTA, 0.5mmol/L 的 K3 [Fe (CN) 6]和 K4 [Fe (CN) 6]，20 % 的甲醇，0.1 % 的 TritonX-100。然后37°C避光染色10小時。染色結束后用70% (體積比)乙醇對植株脫色3次，再用無水乙醇脫色數次，至葉片綠色褪去。結果顯示只有缺磷處理擬南芥呈現藍色(見圖3，B)，正常培養以及缺氮、缺鉀、缺硫和缺鐵處理的擬南芥都沒有藍色顯現(見圖3中除圖3，B外其他圖像)，結果表明本發明分離克隆的BnPR2啟動子受缺磷特異性誘導表達。
權利要求
1.一個甘藍型油菜缺磷誘導表達的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.權利要求1所述的啟動子在培育耐低磷或磷高效植物中的應用。
3.權利要求2的應用，其中包括 在培育耐低磷或磷高效甘藍型油菜品種中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域。從甘藍型油菜中克隆得到一個缺磷誘導表達啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1中第1-1459堿基所示。將該啟動子與報告基因GUS融合轉化擬南芥，GUS組織化學分析表明該啟動子只在缺磷條件下具有活性，在正常、缺氮、缺鉀、缺硫以及缺鐵條件下都不具有活性。該啟動子除了應用于耐低磷或磷高效作物的培育外，還可以用于缺磷誘導表達基因調控機制研究。
文檔編號A01H5/00GK103194447SQ20121000661
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者徐芳森, 楊廣哲 申請人:華中農業大學