專利名稱：豆類植物高效體胚發生與植株建成的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物生物學和植物組織工程學領域，具體地，本發明涉及豆類植物高效體胚發生與植株建成。
背景技術：
目前全球人口膨脹，地球資源遭到日益嚴重的威脅，糧食產量和糧食安全成為21世紀的重要課題。在我國，水稻、小麥、玉米、棉花和大豆等五大作物是保障國家經濟發展和農業安全的重要戰略物資。豆類是我國最常見的經濟農作物,包括大豆，豌豆,蠶豆，綠豆，赤豆,菜豆，蕓豆等。大豆(Glycine max L.)屬豆科,蝶形亞科,大豆屬的二倍體(2n = 40)植物，既是重要的油料作物和糧食作物，全球植物蛋白的主要來源，又是植物功能基因組研究中重要的模式植物。雖然稻類，小麥，玉米，棉花等育種取得了長足的進步，但是大豆的常規人工育種技術長期受到育種年限長、多基因重組率低、性狀連鎖難以打破、遠緣雜交困難等問題的困擾。隨著植物分子操作技術的發展，遺傳轉化手段使物種間的生殖隔離得以打破，實現了遺傳物質的種間交流，為大豆的遺傳育種帶來新的生機。然而也存在著許多問題，如目前廣泛使用的大豆遺傳轉化系統存在遺傳轉化頻率低(平均轉化效率遠低于2 % )、嵌合體發生頻率高、外源基因逃逸等缺陷，這些問題嚴重地滯緩了大豆的遺傳育種和品種改良進程。目前本領域還沒有大規模大跨度的分子育種方法，因此，本領域非常需要開發新的再生豆類體系和方法，尤其是高效再生大豆植株的方法，以克服現有技術中存在的瓶頸問題。
發明內容
本發明的目的就是提供一種制備豆類體細胞胚胎和植株的方法及應用。在本發明的第一方面，提供了一種制備豆類植物體細胞胚胎的方法，包括步驟:(I)提供豆類植物的子葉切塊，并對所述子葉切塊進行誘導，獲得胚性愈傷組織；和(2)對獲得的胚性愈傷組織進行誘導，獲得體細胞胚胎。
在另一優選例中，所述子葉切塊切過的周長占總周長的至少50%，較佳地60%，更加地為100%。在另一優選例中，所述的子葉切塊為上表面積為lmmXlmm-5mmX5mm的子葉切塊，較佳地為上表面積為2mmX4mm的子葉切塊。在另一優選例中，所述的子葉切塊來自于豆類的幼嫩豆莢。在另一優選例中，所述的幼嫩豆莢是在豆類植物開花2-6周(較佳地3-5周)時采摘的。在另一優選例中，步驟(I)所述的誘導為:將子葉切塊接種于含2，4_D和蔗糖的MSB培養基中培養。在另一優選例中，步驟(I)中MSB培養基中2，4-D的濃度為10_50mg/L，較佳地30-40mg/L,最佳地 40mg/L。在另一優選例中，步驟(I)中MSB培養基中蔗糖的濃度為l_10wt%，較佳地5wt%。在另一優選例中，步驟(I)所述的誘導是在光照強度為5-20μπκ)1.πΓ2.較佳地10 μ mol.πΓ2.s_1)的條件下進行的。在另一優選例中，步驟(2)所述誘導為:將步驟(I)獲得的胚性愈傷組織接種于含2，4-D、AgNO3和蔗糖的MSB培養基中進行培養。在另一優選例中，步驟(2)獲得的體細胞胚胎為球形胚。在另一優選例中，步驟⑵中MSB培養基中2，4_D的濃度為10_50mg/L，較佳地30-40mg/L,最佳地 30mg/L。在另一優選例中，步驟⑵中MSB培養基中AgNO3的濃度為l_10mg/L，較佳地2-7mg/L,最佳地 5mg/L。在另一優選例中，步驟⑵中MSB培養基中蔗 糖的濃度為l_10wt%，較佳地6wt%。在另一優選例中，步驟(2)所述的誘導是在光照強度為10-20 μ mol.πΓ2.s_1的條件下進行的。在另一優選例中，所述方法還包括步驟(3):(3)以步驟⑵獲得的體細胞胚胎作為受體，轉入外源基因，從而獲得轉基因的體細胞胚胎。在另一優選例中，所述的外源基因包括(但不限于):抗性基因；標記基因；豆類品質相關基因。在另一優選例中，所述的抗性基因選自下組:抗除草劑基因、抗病毒基因、耐寒基因、和抗蟲基因。在另一優選例中，所述的標記基因選自下組:gus(i3-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、和gfp (綠色突光蛋白)基因。在另一優選例中，所述的 類品質相關標記基因選自下組:脂肪改良相關基因、雄性不育相關基因、花形相關基因、和花色相關基因。在另一優選例中，轉入外源基因的方法選自下組:農桿菌法、基因槍法、花粉管通道法。在本發明的第二方面，提供了一種制備豆類再生植株的方法，包括步驟:將本發明第一方面獲得的體細胞胚胎誘導為再生植株。在另一優選例中，所述方法包括步驟:(i)對體細胞胚胎進行擴增，獲得擴增的體細胞胚胎；(ii)對步驟(i)擴增的體細胞胚胎進行體細胞胚胎成熟和分化培養，獲得成熟和分化的體細胞胚胎；和(iii)對步驟(ii)獲得的成熟和分化的體細胞胚胎進行干化和萌發培養，獲得有根的再生植株。
在另一優選例中，所述方法還包括步驟:(iv)將步驟(iii)獲得的有根的再生植株進行煉苗培養和移栽。在另一優選例中，步驟(iv)所述的煉苗培養是在光照強度為80 μ mol.m_2.s'28 ± I °C的條件下進行。在另一優選例中，步驟(i)所述的擴增為:將體細胞胚胎接種于含2，4-D、AgN03和蔗糖的MSB培養基中培養。在另一優選例中，步驟(i)擴增的體細胞胚胎為球形胚和/或指形胚。在另一優選例中，步驟⑴MSB培養基中2，4-D的濃度為10_50mg/L，較佳地20_40mg/L,最佳地 20mg/L。在另一優選例中，步驟(i)MSB培養基中AgNO3的濃度為l_10mg/L，較佳地l_5mg/L,最佳地3mg/L。在另一優選例中，步驟(i) MSB培養基中蔗糖的濃度為Iwt-1Owt %，較佳地3wt %。在另一優選例中，步驟(i)所述的擴增是在光照強度為2-7 μ mol.πΓ2.s—1的條件下，較佳地5 μ mol.m_2.s—1的條件下進行的。在另一優選例中，步驟(ii)所述的成熟和分化培養為:將步驟(i)獲得的擴增的體細胞胚胎接種于含ΑΒΑ、麥芽糖和活性炭的MSB培養基中。在另一優選例中，步驟 (ii)所述成熟與分化的體細胞胚胎為葉狀胚或子葉期胚。在另一優選例中，步驟(ii)MSB培養基中ABA的濃度為l_10mg/L，較佳地2_3mg/L0在另一優選例中，步驟(ii)MSB培養基中麥芽糖的濃度為2wt-10wt%，較佳地6wt%。在另一優選例中，步驟(ii)MSB培養基中活性炭的濃度為0.2wt_2wt%，較佳地
0.5wt% ο在另一優選例中，步驟(ii)所述成熟和分化培養是在光照強度為15-40 μ mol.m_2.s—1的條件下，較佳地20-30 μ mol.m_2.s—1的條件下進行的。在另一優選例中，步驟(iii)所述的干化和萌發培養包括步驟:(A)將步驟(iii)獲得的成熟與分化的體細胞胚胎置于含麥芽糖和活性炭的MSB薄層培養基培養，獲得進一步成熟、分化與干化的體細胞胚胎；(B)將步驟(A)獲得的體細胞胚胎接種于含蔗糖的MSB培養基中，進行體細胞胚胎萌發培養，獲得再生植株。在另一優選例中，步驟(A)所述麥芽糖的濃度為2wt_10wt%,較佳地為6wt%。在另一優選例中，步驟(A)所述活性炭的濃度為0.2wt-2wt %，較佳地0.5wt %。在另一優選例中，步驟(B)所述蔗糖的濃度為2wt_5wt %，較佳地3wt %。在另一優選例中，本發明第一或第二方面所述的豆類選自下組:大豆、豌豆、蠶豆、綠豆、菜豆、蕓豆或赤豆。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1為本發明的大豆幼嫩子葉切塊體細胞胚胎發生與植株再生的過程，其中，圖1A為幼嫩子葉切塊,棒狀基線(bar) = 4mm ；圖1B為胚性愈傷組織,棒狀基線(bar) = 4mm ；圖1C為附著在愈傷組織上的球形胚，棒狀基線(bar) = 2mm ；圖1D為擴增的球形胚和指狀胚,棒狀基線(bar) = 3mm ；圖1E為葉狀胚和子葉期胚,棒狀基線(bar) = 3mm ；圖1F為經體胚發生的再生小植株,棒狀基線(bar) = 1cm。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，篩選和測試了各種不同的材料，意外地發現將豆類子葉進行切塊，能大 大提高體細胞胚胎的誘導效率，并據此首次建立了一種豆類高效體胚發生和植株再生的方法。以大豆為例，本發明方法以開花3-5周的大豆幼嫩子葉切塊為起始外植體，大量獲得體細胞胚胎，獲得的體細胞胚胎還可以作為轉基因的優良受體。體細胞胚胎經擴增、成熟和分化培養、以及萌發等培養環節，可穩定地獲得大量的再生植株(平均每個子葉切塊可獲得50株或更多)，且植株遺傳穩定。在此基礎上完成了本發明。在一個優選例中，本發明方法包括步驟:獲得切塊的豆類幼嫩子葉；對幼嫩子葉切塊進行誘導，獲得胚性愈傷組織；以誘導胚性愈傷組織獲得體細胞胚胎，并進行擴增；對體細胞胚胎進行成熟和分化培養；將分化的體細胞胚胎培養成再生植株。豆類如本文所用，術語“豆類”是指屬于豆目的植物，特別地，是指豆科植物，包括(但不限于)大豆，豌豆，蠶豆，綠豆，赤豆，菜豆，蕓豆等。再生植株如本文所用，術語“再生植株”是指將豆類的幼嫩子葉切塊為起始外植體，使其形成愈傷組織，經體細胞胚胎發生途徑，形成完整植株的方法或用所述方法獲得的植株。培養基MSB母液配方可以參見以下文獻:Murashige, T and F.Skoog, 1962:A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue-culture.Physiol.Plant.15:473-497.
在本發明的一個優選例中，MSB母液配方如下(以IL為例)，700ml蒸餾水再加入下面的成分:大量元素10倍IOOml ;氯化鈣20倍50ml ;微量元素100倍IOml ;鐵鹽100倍IOml ；B5 有機 100 倍 IOml ；加入蔗糖后定容，調節pH調5.8 ;加入瓊脂Sg，煮沸兩次；分裝后封閉；121°C滅菌20分鐘。本發明提供了一類適于豆類高效體胚發生與植株建成的MSB培養基。根據不同培養條件，MSB培養基還具有選自下組的成分:
10-50mg/L 的 2，4_D (較佳地 30_40mg/L)；l-10mg/lLAgN03(較佳地 3_5mg/L)；l-10mg/L ABA (較佳地 3_5mg/L):2wt-10wt% 麥芽糖(較佳地 5wt_6wt % ):0.2wt-2wt% 活性炭(較佳地 0.5wt% )。體細胞胚胎及其誘導如本文所用，術語“體細胞胚胎”是指由起源于豆類非合子細胞(即體細胞)卻歷經合子胚發育過程的胚。本發明提供了一種豆類體細胞胚胎的制備方法，在一個優選例中，所述方法包括步驟:(I)提供豆類植物的子葉切塊，并對所述子葉切塊進行誘導，獲得胚性愈傷組織；和(2)對獲得的胚性愈傷組織進行誘導，獲得體細胞胚胎。在另一選例中，所述子葉切塊切過的周長占總周長的至少50%，較佳地60%，更佳地為100% ;子葉切塊為上表面積為ImmX lmm-5mmX5mm的子葉切塊,較佳地為上表面積為2mmX4mm的子葉切塊；子葉切塊來自于豆類的幼嫩豆莢，所述的幼嫩豆莢是在豆類植物開花2-6周(較佳地3-5周)時采摘的。在另一優選例中，步驟⑴所述的誘導為將子葉切塊接種于含2，4_D和蔗糖的MSB培養基中培養；2，4-D的濃度為10-50mg/L，較佳地30_40mg/L，最佳地40mg/L ;蔗糖的濃度為 1-1Owt較佳地 5wt% ;在光照強度為 5-20 μ mol.πΓ2.(較佳地 10 μ mol.πΓ2.s_1)的條件下進行。在另一優選例中，步驟(2)所述誘導為:將步驟(I)獲得的胚性愈傷組織接種于含2，4-D、AgN0jP蔗糖的MSB培養基中進行培養；步驟⑵獲得的體細胞胚胎為球形胚；2，4_D的濃度為10-50mg/L,較佳地30-40mg/L,最佳地30mg/L ；AgN03的濃度為Ι-lOmg/L,較佳地2-7mg/L,最佳地5mg/L ;鹿糖的濃度為l-10wt%,較佳地6wt%;在光照強度為10-20 μ mol.πΓ2.s—1的條件下進行。本發明還提供了一種轉基因的體細胞胚胎及其制備方法。如本文所用，術語“轉基因的體細胞胚胎”是指將體細胞胚胎作為受體，轉入外源轉基因。在一個優選例中，可以使用本發明誘導體細胞胚胎生成的方法制備體細胞胚胎，將其作為受體，轉入外源基因，從而獲得轉基因的體細胞胚胎。在另一優選例中，所述的外源基因包括(但不限于):抗性基因；標記基因；豆類品質相關基因。在另一優選例中，所述的抗性基因選自下組:抗除草劑基因、抗病毒基因、耐寒基因、和抗蟲基因。在另一優選例中，所述的標記基因選自下組:gus(i3-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、和gfp (綠色突光蛋白)基因。
在另一優選例中，所述的 類品質相關標記基因選自下組:脂肪改良相關基因、雄性不育相關基因、花形相關基因、和花色相關基因。本領域的普通技人員可以使用通用的方法以體細胞胚胎作為受體，轉入外源轉基因。如農桿菌法、基因槍法、花粉管通道法。
農桿菌介導法農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，與植物基因轉化有關的有2種類型:根癌農桿菌(Agrobacteriumtum efaciens)和發根農桿菌(Agrobacteriumrh izogenes),分別含有Ti質粒和Ri質粒。由于根瘤農桿菌具有趨化性，侵染受體時，在植物受傷組織產生的一些糖類和酚類物質誘導下，向受傷組織集中，通過供體和受體特異互作，農桿菌細胞識別并附著到植物細胞表面，將Ti質粒上的一段T2DNA片段導入植物細胞基因組中。農桿菌介導的遺傳轉化，通常以單拷貝或者低拷貝的形式將外源基因插入到植物基因組，轉育周期短、重復性好、基因沉默現象少、組織培養簡單，但是轉化和再生受材料基因型限制。基因槍法基因槍法是DNA吸附在微載體(鎢粉或金粉粒子)表面，然后以高壓氣體或高壓放電為動力，金屬微粒被射入受體植物細胞，實施轉化。基因槍法技術主要以大豆幼胚的胚軸、莖尖、胚性懸浮細胞和未成熟胚莖尖為轉化受體，通過潮霉素篩選轉化植株。基因槍轉化法不受基因型的限制、產生的微創有利于基因轉移、具有較高的轉化率、能夠轉移多拷貝的重組DNA或者DNA片段。但比農桿菌介導法耗資大，技術難，在植物基因組中拷貝數高，易引起基因沉默。花粉管通道法花粉管通道法是將含目的基因的DNA放到授粉后不久經切割的花柱上，DNA沿著花粉管到達胚珠，并進一步整合到胚珠的基因組中，當攜帶外源基因的受精卵發育成植株時，即獲得了轉基因植物。利用花粉管通道法導入外源基因的方法有子房和胚囊微注射法、柱頭滴加法、花粉粒攜帶法和生殖細胞浸泡法等。植株的再生
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本發明還提供了一種豆類植株再生的方法，將體細胞胚胎誘導為再生植株。在本發明的另一優選例中，包括步驟:(i)對體細胞胚胎進行擴增，獲得擴增的體細胞胚胎；(ii)對步驟(i)擴增的體細胞胚胎進行體細胞胚胎成熟和分化培養，獲得成熟和分化的體細胞胚胎；和(iii)對步驟(ii)獲得的成熟和分化的體細胞胚胎進行干化和萌發培養，獲得有根的再生植株；(iv)將步驟(iii)獲得的有根的再生植株進行煉苗培養和移栽；煉苗培養是在光照強度為80 μ mol.πΓ2.S-1JSiSO (較佳地28±1°C)的條件下進行。在另一優選例中，步驟(i)所述的擴增為:將體細胞胚胎接種于含2，4-D、AgN03和蔗糖的MSB培養基中培養；體細胞胚胎為球形胚和/或指形胚；2，4-D的濃度為10-50mg/L，較佳地20-40mg/L,最佳地20mg/L ；AgN03的濃度為l-lOmg/L,較佳地l_5mg/L,最佳地3mg/L ;鹿糖的濃度為Iwt-1Owt較佳地3wt% ;在光照強度為2-7 μ mol.πΓ2.s_1的條件下,較佳地5 μ mol.m_2.s—1的條件下進行。在另一優選例中，步驟(ii)所述的成熟和分化培養為:將步驟(i)獲得的擴增的體細胞胚胎接種于含ΑΒΑ、麥芽糖和活性炭的MSB培養基中；成熟與分化的體細胞胚胎為葉狀胚或子葉期胚；ΑΒΑ的濃度為l-10mg/L，較佳地2_3mg/L ;麥芽糖的濃度為2被-10被％，較佳地6wt% ;活性炭的濃度為0.2wt-2wt%，較佳地0.5wt% ;在光照強度為15-40 μ mol.m_2.s—1的條件下，較佳地20-30 μ mol.m_2.s—1的條件下進行的。在另一優選例中，步驟(iii)所述的干化和萌發培養包括步驟:(A)將步驟(iii)獲得的成熟與分化的體細胞胚胎置于含麥芽糖和活性炭的MSB薄層培養基培養，獲得進一步成熟、分化與干化的體細胞胚胎；和(B)將步驟(A)獲得的體細胞胚胎接種于含蔗糖的MSB培養基中，進行體細胞胚胎萌發培養，獲得再生植株；步驟(A)所述麥芽糖的濃度為2wt-10wt%,較佳地為6wt% ;活性炭的濃度為0.2wt-2wt%,較佳地0.5wt% ;步驟(B)所述鹿糖的濃度為2wt-5wt%,較佳地3wt%。本發明的主要優點在于:1.本發明方法快速高效，重復性好；2.利用本發明方法能獲得大量的再生植株；3.獲得的植株遺傳穩定，產量高。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例1培養基的制備MSB基本培養基由MS培養基的鹽類、B5培養基的有機為骨干成分混合物而成，MSB母液配制(IL):700ml蒸餾水再加入下面的成分:大量元素10倍IOOml ;氯化鈣20倍50ml ;微量元素100倍IOml ;鐵鹽100倍IOml ；B5有機100倍IOml ;加入30g蔗糖后定容；調節pH調5.8 ;加入瓊脂8g，煮沸兩次；分裝后封閉；121°C滅菌20分鐘。體細胞胚胎發生全過程均使用該培養基作為基本培養基。實施例2獲取豆莢選取飽滿健壯的大豆種子適時播種于田間或溫室，待植株開花3-5周時采摘幼嫩的豆莢，用流動的自來水沖洗60分鐘，吸干豆莢表面的水分，獲得的豆莢可以4°C冰箱保存備用或直接進入體細胞胚胎誘導環節。實施例3獲取子葉切塊選取實施例2中表面完整的豆莢，在超凈工作臺上用70%的乙醇消毒60秒，無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠，撥開豆莢，取出未成熟的種子(又稱幼胚)，獲得幼嫩子葉(3mmX 4mm—5mmX 6mm)。將幼嫩子葉切成2mmX4mm的切塊，備用。 圖1A顯示了切塊的幼嫩子葉,棒狀基線(bar) = 4mm。實施例4誘導并形成胚性愈傷組織將實施例3獲得的幼嫩子葉切塊接種于含40mg/l 2,4-D和5%蔗糖的MSB培養基中，進行胚性愈傷組織誘導。培養條件:光照(10 μ mol.m 2.s O 16h/d培養，培養溫度為23± I °C, 2周繼代一
次，培養基不變。結果表明:培養4-6周后，綠黃色且結構致密的胚性愈傷組織形成。圖1B為胚性愈傷組織，棒狀基線(bar) = 4mm。
實施例5誘導并形成體細胞胚胎將實施例4所得的胚性愈傷組織轉接在附含30mg/l 2，4_D、l_5mg/l AgNO3和6%蔗糖的MSB培養基中，進行體細胞胚胎誘導。培養條件:光照(10-20 μ mol.πΓ2.s—1) 16h/d培養，培養溫度為23土 1°C，2周繼代一次，培養基不變。AgNO3經過濾滅菌后直接添加到42±2°C的無菌培養基中。結果表明:培養2-4周后，晶瑩剔透的黃綠色球形胚形成。圖1C為附著在愈傷組織上的球形胚，棒狀基線(bar) = 2mm,實施例6體細胞胚胎的擴增培養將實施例5所得的黃綠色球形胚連同其附著愈傷組織一起轉接至附20mg/12，
4-D、l-3mg/lAgNO3和3%蔗糖的MSB培養基中，進行體細胞胚胎擴增培養。培養條件:光照(5 μ mol.1ii2-S1) 16h/d培養,培養溫度為23± 1°C, 2周繼代一次，培養基不變。AgNO3經過濾滅菌后直接添加到42±2°C的無菌培養基中。結果表明:培養4-6周后，擴增出大量淡黃色的球形胚和指狀胚。圖1D為擴增的球形胚和指狀胚， 棒狀基線(bar) = 3mm。實施例7體細胞胚胎的成熟與分化培養將實施例6所得的擴增后的淡黃色球形胚和指狀胚連同其附著愈傷組織一起轉接至附含l_3mg/l ABA+6%麥芽糖+0.5%活性炭的MSB培養基中，進行體細胞胚胎成熟與分化培養。培養條件:光照(20-30 μ mol.πΓ2.s_1) 16h/d培養，培養溫度為23土1°C，2周繼代一次，培養基不變。麥芽糖和活性炭直接添加到培養基中與培養基混合滅菌。結果表明:培養4-6周后，大量淡黃色的球形胚和指狀胚經由雙子葉植物胚胎發生的各個不同發育時期，分化成為葉狀胚或子葉期胚。圖1E為葉狀胚和子葉期胚，棒狀基線(bar) = 3mmο實施例8植株生成將含6%麥芽糖+0.5%活性炭的MSB培養基3_4ml倒入直徑為9cm的培養皿中平鋪成薄層，把實施例8所得的葉狀胚或子葉期胚單一放置在該薄層上，用parafilm膜封口后，置于相對濕度為80-90%的培養箱內，進行體細胞胚胎得進一步成熟、分化與干化培養。
5-7天后，將經干化處理過的子葉期胚轉接至附含3%蔗糖的MSB培養基上，進行體細胞胚胎萌發培養。培養條件:光照(50-80 μ mol.πΓ2.s—1) 16h/d培養，培養溫度為23土 1°C，2周繼代
一次，培養基不變。結果表明:培養4-5周后，大量子葉期胚經由雙子葉植物胚胎發生的各個不同發育時期，再生成根系發達的小植株。圖1F為經體胚發生的再生小植株，棒狀基線(bar)=Icm0實施例9煉苗、移植將實施例8所得的生根苗連同培養基、培養瓶等一起轉入28±2°C、光照(80 μ mol.m_2.s—1) 16h/d的培養條件下進行耐受培養1_2周后，打開培養瓶蓋子，注入10-20ml無菌水或去離子水,煉苗5-8天。將再生小苗移栽到泥炭、菜園土和珍珠巖(3: 6: I)的基質中，在28±2°C、自然光照的大棚中生長良好，成為與自然生長小苗一致的大豆再生植株。實施例10用150個子葉切塊，重復實施例2-9，重復三批，其中子葉切塊大小為(lmm-2mm)X (2mm—4mm)。結果表明，每個幼嫩子葉切塊經培養，平均獲得大豆再生植株51-58株，再生植株遺傳穩定性好。對比例大豆幼嫩子葉(未切塊)大小為:l-3mmX3-5mm胚芽大小為:1—2mm成熟大豆種子的子葉大小為:6mm-10mm結果表明:以大豆幼嫩子葉(未切塊)為起始外植體能誘導出體細胞胚，但數量較少(少于15% )，無法再生出完整植株；胚芽和成熟大豆種子的子葉均不能經由體細胞胚胎繼而實現植株建成。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范
圍。·
權利要求
1.一種制備豆類植物體細胞胚胎的方法，其特征在于，包括步驟 (1)提供豆類植物的子葉切塊，并對所述子葉切塊進行誘導，獲得胚性愈傷組織；和 (2)對獲得的胚性愈傷組織進行誘導，獲得體細胞胚胎。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述子葉切塊切過的周長占總周長的至少50 %，較佳地60 %，更佳地為100 %。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的誘導為將子葉切塊接種于含2，4-D和蔗糖的MSB培養基中培養。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述誘導為將步驟(I)獲得的胚性愈傷組織接種于含2，4-D、AgNO3和蔗糖的MSB培養基中進行培養。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，還包括步驟 (3)以步驟(2)獲得的體細胞胚胎作為受體，轉入外源基因，從而獲得轉基因的體細胞胚胎。
6.一種制備豆類再生植株的方法，其特征在于，包括步驟 將權利要求1-5任一方法制備的體細胞胚胎誘導為再生植株。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，包括步驟 (i)對體細胞胚胎進行擴增，獲得擴增的體細胞胚胎； ( )對步驟(i)擴增的體細胞胚胎進行體細胞胚胎成熟和分化培養，獲得成熟和分化的體細胞胚胎；和 (iii)對步驟(ii)獲得的成熟和分化的體細胞胚胎進行干化和萌發培養，獲得有根的再生植株。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，還包括步驟(iv) (iv)將步驟(iii)獲得的有根的再生植株進行煉苗培養和移栽。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(i)所述的擴增為將體細胞胚胎接種于含2，4-D、AgNO3和蔗糖的MSB培養基中培養。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(ii)所述的成熟和分化培養為將步驟⑴獲得的擴增的體細胞胚胎接種于含ΑΒΑ、麥芽糖和活性炭的MSB培養基中。
11.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(iii)所述的干化和萌發培養包括步驟 (A)將步驟(iii)獲得的成熟與分化的體細胞胚胎置于含麥芽糖和活性炭的MSB薄層培養基培養，獲得進一步成熟、分化與干化的體細胞胚胎； (B)將步驟(A)獲得的體細胞胚胎接種于含蔗糖的MSB培養基中，進行體細胞胚胎萌發培養，獲得再生植株。
12.如權利要求I或6所述的方法，其特征在于，所述的豆類選自下組大豆、豌豆、蠶豆、綠豆、菜豆、蕓豆或赤豆。
全文摘要
本發明涉及豆類植物高效體胚發生與植株建成。具體地，本發明方法以豆類幼嫩的子葉切塊為起始外植體，經體細胞胚胎發生途徑，成功建成大量的再生植株，所述方法包括步驟對豆類幼嫩子葉進行剝離與切割，獲得子葉切塊；對子葉切塊進行誘導，獲得胚性愈傷組織；進一步誘導胚性愈傷組織，獲得體細胞胚胎；以及將體細胞胚胎再生為植株。本發明的豆類體細胞胚胎發生方法快速高效，且植株遺傳穩定性好。
文檔編號A01H4/00GK103250636SQ20121003879
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者朱木蘭, 衛志明 申請人:中國科學院上海生命科學研究院