專利名稱：一種膏桐離體葉片植株再生的方法
技術領域：
本發明屬于植物組織培養中的一項苗木生產應用技術，具體來說是通過組織培養中不定 芽的直接誘導來進行大規模生產膏桐組培苗的方法。
背景技術：
膏桐(力t/Y^力sc"rcssL)又名小桐子、麻瘋樹、黑皂樹、木花生、油蘆子、老胖果等， 屬大戟科(Eu-phobiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)落葉灌木或小喬木，高2 5m;根系十分發達， 老干灰褐色，小枝灰綠至嫩綠色；單葉互生，卵圓形，長寬近相等，3 5裂或不分裂，葉柄 長達15cm;花單性，雌雄同株，排列成腋生或頂生的聚傘花序；種子橢圓形，長18 20隱， 直徑llmni。在氣溫較高的地區一般年開花結實2次，環境好的地方可常年開花。
膏桐喜光、喜暖熱氣候；具有很強的抗旱、耐貧瘠的特性，能在石礫質土、粗質土、石 灰巖裸露地生長。處于野生狀況的膏桐，生長迅速，生命力強，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地 區。膏桐作為一種我國南方山區民間應用的木本油料樹種，也是化工、輕工的原料植物，在 工業、農業、環保及生態建設上都有應用。目前膏桐作為生物能源樹種正在大力開發，2006 年6月云南省林業廳組織編制了《云南省林木生物質能源——生物柴油原料林發展規劃》，規 劃期為10年(2006-——2015年)，總體目標培育以膏桐為主的IOOO萬畝原料林基地。因 此采用傳統的播種和扦插育苗很難在短時間內滿足膏桐大面積推廣種植的需要，而釆用組織 培養的方式可以有效地滿足其需求。目前關于膏桐組織培養技術的報道是通過莖段或頂芽等 離體器官誘導愈傷組織后再誘導出不定芽，但通過離體器官誘導出愈傷組織后再進行不定芽 的誘導，脫分化所需的時間較長，而且純愈傷誘導出來的不定芽遺傳性狀容易產生變異。
發明內容
本發明的目的在于提供一種脫分化所需時間短，得到的芽苗數量多，且誘導出來的不定 芽遺傳性狀相對純愈傷出芽方式較為穩定的膏桐植株再生的方法。
本發明方法主要包括無菌苗的獲得，不定芽誘導，不定芽增殖，不定芽的生根培養，生 根苗的煉苗與移栽，其特征在于各步驟具體如下
(1) 選種，催芽，消毒后取種胚接種于MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05 mg/L培養基上，光強 為1000-3000Lux,光照時間12小時每天，溫度在25-28。C間，7天后便可得到生長健壯的 無菌苗；
(2) 取無菌苗的葉片，接種在MS+6-BA1.0+KT1.0 +NAA0.03的培養基上，光強為 1000-3000Lux，光照時間12小時每天，溫度在25-28。C間，25天后便可在葉片上直接產生大 量的不定芽；
(3) 將獲得的嫩芽轉接到增殖培養基MS+6-BA0. 5 mg/L +KT0. 5 mg/L +NAA0. 05 mg/L上， 20天后便又可生成更多的不定芽，光照時間12小時每天，光強為1000-3000Lux，溫度在25-28 。C間；
(4) 將經過反復轉接后的不定芽切下，轉至生根培養基MS+NAA0, l—O. 3 mg/L上，15 天后便開始生根。光強為3000-5000Lux，光照時間12小時每天，溫度在25-2『C間；
(5) 將生根苗在自然光照條件下，過渡一星期，取出生根苗，洗凈沾附在小苗根部的培 養基，用0.02mg/LNAA的溶液浸泡l分鐘，便可移栽到經過滅菌的基質當中。
本發明通過調整激素濃度和配比，使得膏桐離體葉片不經過愈傷組織便可直接產生不定 芽，大大地提高了其遺傳性狀的穩定性；此外，縮短了不定芽產生的時間，而且出芽率高， 達到了 90%以上，對膏桐今后的大面積擴繁具有重要的利用價值。
具體實施方式
實施例
所選用的膏桐種子，為云南省大理州賓川縣一株性狀較為優良的單株上采得，煉苗于2007 年5月份在西南林學院的溫室大棚內進行，步驟如下
(1)先用洗衣粉將種子清洗干凈，在流水下沖洗20分鐘，之后用40度始溫的無菌水催 芽1小時。去種殼，用75%的酒精消毒30秒，無菌水漂洗一次，再用2%的次氯酸鈉消毒11 分鐘，用無菌水沖洗4-5次，無菌濾紙吸干，再將種子在酒精燈火焰上燒3-5秒，之后取種 胚接種于MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05 mg/L培養基上，光強為1000-3000Lux，每天光照12 小時，溫度26。C間，接種后第三天，胚便開始萌動，7天后長成健狀的小苗，且無菌率達100%。
(2) 將無菌苗的葉片切成不規則的形狀，接種于MS+6-BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0. 03 mg/L的培養基上，葉的背面與培養基相接觸，其培養條件與上同。接種10天后，葉片開始 巻曲，切口邊緣有少量的愈傷組織形成，20天后可見少量的綠色芽點，其葉片的不定芽誘導 率達90%以上，再經過5-IO天的培養，芽點逐漸形成小芽叢。
(3) 將芽叢切割，轉接到增殖培養基MS+6-BAO. 5 mg/L +KT0. 5 mg/L +NAA0. 05 mg/L上， 20天后又可在芽叢的周圍形成大量的芽點，如此反復，待芽增殖到一定數量后，便可將一部 分高度大于lcm以上的芽接種到生根培培養基上。
此外，可以將分化得到的無菌苗，取葉片，重復步驟(2)后，同樣也可以誘導出大量 的不定芽，從而避免后期再用種子消毒來得到無菌苗。
(4) 生根培養基為MS+NAA0. l—O. 3 mg/L上，光強3000-5000Lux 。 15天后可見白色的根 系長出，數量2-5條不等。當根長至2cm時，移到自然光下煉苗，煉苗期間將瓶口透氣膜松 動以利于透氣。
(5) 煉苗1星期后，取出洗凈附在小苗根部的培養基，用0. 02mg/LNAA的溶液浸泡1分鐘， 之后移栽到消毒過的河沙基質中，覆蓋塑料膜保濕。此期間每天透氣1-3次，每隔1星期噴灑 低濃度的多菌靈溶液和MS溶液一次，到第5天后逐漸揭去透氣膜。隨著時間的延長，到第 10天開始延長其透氣時間，15天后揭去塑料膜，20天后轉入正常管理，30天后的苗木保存活 率達90%以上。
權利要求
1、一種膏桐離體葉片植株再生的方法，包括無菌苗的獲得，不定芽誘導，不定芽增殖，不定芽的生根培養，生根苗的煉苗與移栽，其特征在于各步驟具體如下(1)選種，催芽，消毒后取種胚接種于MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05 mg/L培養基上，光強為1000-3000Lux，光照時間12小時每天，溫度在25-28℃間，7天后便可得到生長健壯的無菌苗；(2)取無菌苗的葉片，接種在MS+6-BA1.0mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.03 mg/L的培養基上，光強為1000-3000Lux，光照時間12小時每天，溫度在25-28℃間，25天后便可在葉片上直接產生大量的不定芽；(3)將獲得的嫩芽轉接到增殖培養基MS+6-BA0.5 mg/L+KT0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L上，20天后便又可生成更多的不定芽，光照時間12小時每天，光強為1000-3000Lux，溫度在25-28℃間；(4)將經過反復轉接后的不定芽切下，轉至生根培養基MS+NAA0.1—0.3 mg/L上，15天后便開始生根。光強為3000-5000Lux，光照時間12小時每天，溫度在25-28℃間；(5)將生根苗在自然光照條件下，過渡一星期，取出生根苗，洗凈沾附在小苗根部的培養基，用0.02mg/LNAA的溶液浸泡1分鐘，便可移栽到經過滅菌的基質當中。
全文摘要
本發明屬于植物組織培養中的一項苗木生產應用技術，具體來說是通過組織培養中不定芽的直接誘導來進行大規模生產膏桐組培苗的方法，包括無菌苗的獲得，不定芽誘導，不定芽增殖，不定芽的生根培養，生根苗的煉苗與移栽，通過調整激素濃度和配比，使得膏桐離體葉片不經過愈傷組織便可直接產生不定芽，大大地提高了其遺傳性狀的穩定性；此外，縮短了不定芽產生的時間，而且出芽率高，達到了90％以上，對膏桐今后的大面積擴繁具有重要的利用價值。
文檔編號A01H4/00GK101361457SQ200810058988
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月27日 優先權日2008年9月27日
發明者何承忠, 唐軍榮, 歐光龍, 輝 胥, 馬煥成 申請人:西南林學院