專利名稱：一種硬蜱模型的轉基因動物生物安全評價方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種轉基因動物生物安全評價方法。
背景技術：
轉基因動物的研究始于20世紀80年代，而1982年“超級小鼠”的研制成功則掀起了轉基因動物的研究熱潮，至今已獲得了豬、牛、羊、兔、貓、狗、猴等多種轉基因動物。動物轉基因技術在遺傳育種、生物制藥、器官移植和疾病模型等方向的運用發展迅速。與此同時，同其它轉基因生物一樣，其安全性也引起了廣泛關注。轉基因生物及其產品的安全性包括兩個方面，一是轉基因生物環境釋放或商業化使用帶來的環境安全性，也即生態安全性； 二是轉基因食品的安全性。為防范轉基因生物對環境及人類健康的風險，并促進轉基因產業的健康發展，世界各國紛紛加強對轉基因生物安全性的研究，力圖通過各種技術措施消除轉基因生物的安全隱患，并制訂相應政策對轉基因生物的安全性進行管理。轉基因生物的環境或生態安全風險，在轉基因植物研究上已受到極大重視，但轉基因家畜與轉基因農作物相比發展滯后，然而未雨綢繆，防患于未然是必要的。家畜與植物的生存環境和生理特點不同，其影響安全性的因素也有差異。由于轉基因家畜的飼養管理方式，其對環境產生的威脅似乎遠低于轉基因植物，但轉基因家畜可以通過(I)畜體(舍) 內的其它動物，如吸血節肢動物(蚊、蜱、蠅)、體內寄生微生物以及老鼠等、(2)排泄物等途徑對環境或生態造成安全風險，因而建立轉基因動物發生環境或生態安全評價方法十分迫切。蜱，俗稱蜱蟲，是一種吸血性節肢動物，它們侵襲人、哺乳動物、鳥類、爬行類，甚至兩棲類，廣泛分布于世界各地。目前，世界上已發現的蜱超過850種，在中國已記錄的蜱有110種。蜱是一類營專性寄生生活的不完全變態的節肢動物，隸屬于節肢動物門-蜘蛛綱-蜱螨亞綱-寄螨目-蜱亞目-蜱總科，按形態和生物學特性分為硬蜱、軟蜱和納蜱3科， 其中最常見、種類最多的為硬蜱科蜱，稱為硬蜱。硬蜱的發育需經過卵、幼蜱、若蜱和成蜱四個階段，卵在適當條件下孵化成為幼蜱,幼蜱在宿主體表吸血后蛻皮為若蜱,若蜱在動物體表吸血后蛻皮成為成蜱,成蜱再次侵襲宿主吸血,飽血后產卵,從而完成整個生活史。硬蜱的繁殖能力很強,一般硬蜱一生產卵數千粒至數萬粒。硬蜱的生物學特點顯示，它是牛、羊等宿主動物最直接關聯的環境生物之一，以吸血為生。宿主轉基因可經血液成分直接進入蜱體內，對其生長發育等生物學特征有無影響具有生物安全評價的代表性；而且蜱在宿主動物吸血后脫落，在環境中產卵并孵化出幼蜱，再侵襲新的宿主動物，具備基因飄移的路徑和潛力。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種轉基因動物生物安全評價方法，該方法具有科學性和實用性，是行之有效的轉基因動物生物安全評價方法。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現
在本發明的一個方面，提供了一種轉基因動物生物安全評價方法，包括以下步驟將硬蜱的饑餓成蜱，分別接種于轉基因動物和對應的非轉基因動物體表進行吸血，統計吸血的成蜱并收取飽血雌蜱，計算蜱感染率和飽血率；將飽血雌蜱置于合適條件下產卵，并使卵孵化為幼蜱，統計產卵量和幼蜱孵化率；將一部分幼蝶在非轉基因動物體表飼血培養，觀察第二代蝶包括生長、發育和繁殖的生物學變化；將另一部分幼蜱提取DNA，用針對轉基因的特異性引物，檢測幼蜱體內是否含有轉基因;通過比較轉基因動物和對應非轉基因動物的蜱感染率和飽血率、飽血雌蜱的產卵量和幼蜱孵化率、以及第二代蜱的生物學變化，評價轉基因對環境生物的影響；由幼蜱DNA 的基因檢測結果，判斷轉基因有無漂移，如果幼蜱不含有轉基因，說明轉基因未發生漂移。所述飽血雌蜱的產卵條件是溫度25°C，相對濕度90%，飽血雌蜱的產卵時間為
15-22 天。所述卵的孵化期為25-28天。本發明轉基因動物生物安全評價方法，對轉基因產業的健康發展具有重要意義。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖I是本發明長角血蜱形態圖；圖2是本發明實施例2三種轉基因的PCR檢測方法驗證結果圖；圖3是本發明實施例2幼蜱體內人β -干擾素基因的檢測結果圖；圖4是本發明實施例2幼蜱體內人抗凝血酶III基因的檢測結果圖；圖5是本發明實施例2幼蜱體內乙肝表面抗原基因的檢測結果圖；圖6是本發明實施例3以長角血蜱為模型的轉基因羊生物安全評價方法路徑圖。
具體實施例方式為防范轉基因動物對環境及人類健康的風險，本發明研發出了一種以硬蜱為實驗模型的轉基因動物對環境生物安全的評價方法。長角血蜱是硬蜱中的一種，本發明下述實施例以長角血蜱為模型進行轉基因動物生物安全評價實驗。本發明根據硬蜱的生物學特征，通過比較研究轉基因羊群對長角血蜱的吸血、發育和生殖的生物學影響，評價轉基因羊對環境生物安全的影響；同時，基于成蜱在轉基因羊體吸血后產卵并孵化成幼蜱的生物學特征，通過檢測幼蜱體內有無靶標轉基因，從而評價轉基因羊的基因水平傳播(基因漂移)的情況。通過應用長角血蜱對三種轉基因羊(人β-干擾素、抗凝血酶III、乙肝表面抗原轉基因羊)的生物安全評價研究，提出一種以長角血蜱為模型的轉基因動物生物安全評價方法。實施例I三種轉基因羊對吸血長角血蜱的生物學特性的影響青島基地轉基因羊有人干擾素、人抗凝血酶III和乙肝表面抗原三種不同的轉基因羊群及正常羊群，羊群在圈舍及活動區被常見體表寄生蟲(長角血蜱)侵襲和寄生， 本發明通過與基地正常羊群的比較研究，分析蜱的種類、感染率、感染強度、飽血雌蜱的產卵量和幼蜱孵化率，以及生活史第二代蜱實驗條件下生長發育數據，從而進行轉基因羊對環境生物的安全評估。I.轉基因羊群與蜱種類轉基因羊為青島森淼生物技術研究所研發，含人干擾素、人抗凝血酶III和乙肝表面抗原三種不同的轉基因羊群，轉基因羊群及正常羊群飼養于青島嶗山隔離基地， 在圈舍及活動區被常見體表寄生蟲(蜱)侵襲和寄生，不同季節段采集青島基地的轉基因羊群體表吸血的蜱和圈舍及活動區蜱，通過形態學和生物學特點進行種類鑒定。結果發現該基地蝶種為單一種，為我國廣泛分布的主要硬蝶種類-長角血蝶(Haemaphysalis Iongicornis),屬于孤雌生殖種群,其形態見圖I。2.羊群感染率和感染強度在不同年份(2009年度，2010年度)，蜱的感染蜂期季節(6_9月份)，同時對基地正常羊群以及人β-干擾素、人抗凝血酶III、乙肝表面抗原轉基因羊群，分別采集檢查羊的體表吸血長角血蜱，統計羊群感染率和感染強度。結果如表I所示，正常羊群和三組轉基因羊群的蜱感染率都為100% ;正常羊群以及人β-干擾素、抗凝血酶III、乙肝表面抗原轉基因羊群的平均感染強度分別為104 373只、128 383只、117 387只和97 367只，統計學分析，各組間無顯著差異，表明轉基因羊對吸血長角血蜱的感染侵襲無影響。表I.轉基因羊群的硬蜱感染率和感染強度
權利要求
1.一種轉基因動物生物安全評價方法，其特征在于，包括以下步驟將硬蜱的饑餓成蜱，分別接種于轉基因動物和對應的非轉基因動物體表進行吸血，統計吸血的成蜱并收取飽血雌蜱,計算蜱感染率和飽血率；將飽血雌蜱置于合適條件下產卵，并使卵孵化為幼蜱，統計產卵量和幼蜱孵化率；將一部分幼蜱在非轉基因動物體表飼血培養，觀察第二代蜱包括生長、發育和繁殖的生物學變化；將另一部分幼蜱提取DNA，用針對轉基因的特異性引物，檢測幼蜱體內是否含有轉基因；通過比較轉基因動物和對應非轉基因動物的蜱感染率和飽血率、飽血雌蜱的產卵量和幼蜱孵化率、以及第二代蜱的生物學變化，評價轉基因對環境生物的影響；由幼蜱DNA的基因檢測結果，判斷轉基因有無漂移，如果幼蜱不含有轉基因，說明轉基因未發生漂移。
2.根據權利要求I所述的轉基因動物生物安全評價方法，其特征在于，所述硬蜱為寄生動物體表的吸血節肢動物，其生活史包括卵、幼蜱、若蜱、成蜱四個階段。
3.根據權利要求I所述的轉基因動物生物安全評價方法，其特征在于，所述飽血雌蜱的產卵條件是溫度25°C，相對濕度90%。
4.根據權利要求I所述的轉基因動物生物安全評價方法，其特征在于，所述飽血雌蜱的產卵時間為15-22天。
5.根據權利要求I所述的轉基因動物生物安全評價方法，其特征在于，所述卵的孵化為幼蝶期為25-28天。
全文摘要
本發明公開了一種硬蜱模型的轉基因動物生物安全評價方法，通過比較轉基因動物和對應非轉基因動物的蜱感染率和飽血率、飽血雌蜱的產卵量和幼蜱孵化率、以及第二代蜱的生物學變化，評價轉基因對環境生物的影響；并利用成蜱在轉基因動物體表吸血后產卵，然后孵化成幼蜱的生物學特征，通過幼蜱體內有無轉基因的特異性檢測，判斷轉基因有無漂移。本發明方法具有科學性和實用性，是一種行之有效的轉基因動物生物安全評價方法。
文檔編號A01K67/033GK102578046SQ20121004464
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者周勇志, 周金林, 張厚雙, 曹杰, 趙雅琳 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所, 青島森淼實業有限公司