專利名稱：一種從意大利蒼耳提取的化合物及其作為除草劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及除草劑蒼耳皂素技術領域，具體的說，本發明涉及一種自有害植物意大利蒼耳提取純化的蒼耳皂素并將其作為除草劑應用技術領域。
背景技術：
農業生產中大量使用的化學除草劑由于缺乏相應的微生物對其進行分解，容易在自然界長期留存，造成對土壤以及地下水資源的污染。而利用從自然界中提取的天然成分作為除草劑，則因其易于分解、在自然界沒有殘留而日益受到科研界的重視。(8α，10 β ) -4-氧-I (5)，2，11(13)-蒼耳三烯-12，8-內酯，英文名Xanthinosin,結構參見附圖8，中文名蒼耳皂素為一種倍半萜內酯，主要由蒼耳屬植物分離得到。利用本專利的提取技術，可從外來有害入侵植物意大利蒼耳中分離得到純度達95%以上的純品。蒼耳皂素被報道具有抑制微生物生長及腫瘤細胞生長和抗潰瘍等作用，但是蒼耳皂素對其它植物的生長抑制作用(植物毒作用)國內外均未見報道，參見文獻1-5。目前已有關于其人工化學合成方法的報道,參見文獻6。用以提取蒼耳皂素的外來植物意大利蒼耳，于1991年首次在北京發現，目前已擴散至河北、山東、廣東、新疆等地，參見文獻7。生態模型預測顯示，我國大部分地區為其適生區，意大利蒼耳具有進一步擴散蔓延的潛力，參見文獻8。該植物生長迅速，生物量大，可與本土植物競爭養分和空間，嚴重危害入侵地的農林牧業生產以及生態系統穩定。用其做原料提取蒼耳皂素，既對其進行了利用，又有利于控制其進一步發展。此外，蒼耳屬的其它植物材料如蒼耳等也可用以提取蒼耳皂素，因此，原料來源廣泛。參考文獻I. Favier, L. S. ；Maria, A. O. M ；Wendel, G. H. ；Borkowski, E. J. ；Giordano, 0. S.；Pelzer, L ;Tonn，C. E. Anti-ulcerogenic activity of xanthanolide sesquiterpenesfrom Xanthium cavanillesii in rats. J. Ethnopharmacol. 2005，100 :260_267o2. Kovacs, A. ；Vasas, A. ;Forgo，P. ;Rethy，B. ;Zupko，I. ;Hohmann，J.Xanthanolides with antitumour activity from Xanthium italicum. Zeitschriftfuer Naturforschung, C J. Biosci. 2009,64 :343_349。3. Lavault, M. ；Landreau, A. ；Larcher, G. ；Bouchara, J. P. ；Pagniez, F. ;Pape，P. L. ;Richomme，P. Antileishmanial and antifungal activities of xanthanolidesisolated from Xanthium macrocarpum. Fitoterapia 2005,76 :363_366。4. Rami rez-Erosa, I. ;Huang，Y. ;Hickie，R. A. ;Sutherland，R. G. ;Barl，B. Xanthatin and xanthinosin from the burs of Xanthium strumarium L as potentialanticancer agents. Can. J. Physiol. Pharmacol. 2007,85 :1160_1172o5. Sato, Y. ;0ketani，H. ;Yamada，T. ;Singyouchi，K. ;0htsubo，T. ;Kihara，M. ;Higuti，T. A xanthanolide with potent antibacterial activity againstmethici11 in-resistant Staphylococcus aureus. J. Pharm. Pharmacol. 1997,49 1042-1044。6.Vasas, A. ；Hohmann, J.Xanthane sesquiterpenoids !structure, synthesisandbiological activity.Nat. Prod. Rep. 2011, 28 :824_842。7.劉慧圓，明冠華。2008.外來入侵種意大利蒼耳的分布現狀及防控措施，生物學通報.43 (5) : 15-16。8.王瑞，萬方浩.2010.外來入侵植物意大利蒼耳在我國適生區預測. 草業學報，19(6) :222-230。
發明內容
針對國內外未見有關(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯從自有害植物意大利蒼耳提取，以及應用于除草劑的技術現狀。本發明的目的在于提供一種(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯從自有害植物意大利蒼耳提取的方法，以及作為除草劑的應用，這種作為除草劑來源于植物，可以在自然界分解，不污染環境，同時對有害植物進行了廢物利用。本發明具體提供一種(8 α，10 β )-4_氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯從自有害植物意大利蒼耳提取的方法，具體提取步驟如下(I)采集成熟期的意大利蒼耳植株，將果實與其它部位分離，晾干后粉碎備用。(2)將粉碎后的意大利蒼耳果實用五倍體積的95%在室溫下浸泡七天；將浸泡液經過濾后去除殘渣，然后將濾液用旋轉蒸發儀蒸至無醇味；(3)取上述步驟(2)濃縮后的提取物，用蒸餾水攪拌得混懸液；加入等體積石油醚萃取三次，棄掉石油醚部位；(4)上述步驟(3)脫脂后的混懸液再用等體積的三氯甲烷萃取三次，合并三氯甲烷相并用旋轉蒸發儀濃縮至干；(5)將三氯甲烷萃取物用100-200目硅膠柱層析進行分離，采用三氯甲烷甲醇按比例為98 2(v/v)洗脫；(6)洗脫組分濃縮后，取含黃色油狀物組分上S印hadex LH-20柱層析，用三氯甲烷甲醇按比例為I : I洗脫(V/V)，即可得到純度達95%以上的蒼耳皂素。同時，本發明提供了一種(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯作為除草劑的應用。通過將(8 a , 10 β ) -4-氧-I (5) ,2,11 (13)-蒼耳二烯-12,8-內酯，即蒼耳皂素用95%乙醇溶解后，在使用前稀釋10000-20000倍，于雜草出苗前按照噴施濃度 500-1000 μ g/ml 噴灑。通過實施本發明具體的技術內容，可以達到以下有益效果。I.本發明提供的(8 α，10 β )-4_氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯在低濃度40 μ g/ml時，即可對單、雙子葉植物生長產生顯著抑制。當濃度達到200 μ g/ml時，其對雙子葉植物莧菜的根長抑制率達到78%，對生菜達到89%，對單子葉植物小麥為69%，對黑麥草為67%。此外，受試植物的根扭曲變形，顏色變褐，提示已受到較嚴重的毒害。對苗高的抑制率為莧菜58%，生菜67%，小麥36%，40%。幼苗也發生扭曲變形現象。總體來說，本發明提供的(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯對雙子葉植物的抑制作用更為明顯；而當濃度升高到ΙΟΟΟμ g/ml時，可導致所有植物的種子基本完全不發芽而死亡。本發明提供的(8α，10β)-4-氧-1(5)，2，11(13)-蒼耳三烯-12，8_內酯和商業除草劑撲草凈進行比較實驗檢測對上述四種植物的生長抑制作用，結果顯示，當使用濃度高于200 μ g/ml時，則蒼耳皂素對四種植物的抑制作用顯著強于撲草凈。2.當將(g α，10 β )-4-氧-I (5), 2,11 (13)_ 蒼耳二稀-12,8-內酷與水混懸后，以5mg/kg 土壤的比例添加到土壤中進行盆栽實驗時，雙子葉植物生菜在出土發芽一周后基本停止生長，葉片出現枯黃現象，根系出現死亡，隨后植株逐漸死亡；雙子葉植物蘿卜顯示出類似的現象，幼苗出土后生長不良，葉片枯萎變黃，根系首先死亡，植株隨后死亡；作為對照，蒼耳皂素對單子葉植物小麥的影響很小，在處理六周之后植株生長基本正常。3. (8 a , 10 β ) _4-氧-I (5) ,2,11 (13)_蒼耳二稀~12,8~內酷適合應用于農田中進行雜草的防除；由于其對單子葉植物如小麥等的影響遠小于對雙子葉植物的作用，因此蒼耳皂素更適合作為麥田防除雙子葉雜草使用。蒼耳皂素提取自外來入侵有害植物意大利蒼耳，該植物在野外生長繁茂，高度可達兩米以上，生物量高，從中提取除草劑既有利于環保，又對有害植物進行了綜合利用，有利于對其進行防控。蒼耳皂素為天然成分，在自然界可快速分解，不污染環境，可應用于有機農業的雜草防除。本發明通過除草劑專利可以突出它是來源于植物的，可以在自然界分解，環保不污染環境，同時對有害植物進行了廢物利用。
圖I為蒼耳皂素對兩種單子葉植物小麥和黑麥草和兩種雙子葉植物莧菜和生菜根長的抑制作用圖，圖中，其作用濃度分別為8，40，200，ΙΟΟΟμ g/ml 0圖2為蒼耳皂素對兩種單子葉植物小麥和黑麥草和兩種雙子葉植物莧菜和生菜苗高的抑制作用圖，圖中，其作用濃度分別為8，40，200，ΙΟΟΟμ g/ml 0圖3為撲草凈對兩種單子葉植物小麥和黑麥草和兩種雙子葉植物莧菜和生菜根長的抑制作用圖，圖中，其作用濃度分別為8，40，200，1000μ g/ml0圖4為撲草凈對兩種單子葉植物小麥和黑麥草和兩種雙子葉植物莧菜和生菜苗高的抑制作用，圖中，其作用濃度分別為8，40，200，1000μ g/ml0圖5為添加蒼耳皂素的生菜幼苗盆栽實驗圖，圖中，左側三盆為對照，未添加蒼耳皂素；右側為添加蒼耳皂素的處理，添加比例為5mg/kg 土壤。 圖6為添加蒼耳皂素的蘿卜幼苗盆栽實驗圖，圖中，左側三盆為對照，未添加蒼耳皂素；右側為添加蒼耳皂素的處理，添加比例為5mg/kg 土壤。圖7為添加蒼耳皂素的小麥幼苗盆栽實驗圖，圖中，左側三盆為對照，未添加蒼耳皂素；右側為添加蒼耳皂素的處理，添加比例為5mg/kg 土壤。圖8為蒼耳皂素化學結構式。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器都為本領域熟知的，其他本領域熟知 的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。實施例一(8 α，10 β )-4_ 氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯的提取本發明具體提供一種(8 α，10 β )-4_氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯從自有害植物意大利蒼耳提取的方法，具體提取步驟如下(I)將意大利蒼耳果實干燥后用粉碎機粉碎首先采集成熟期的意大利蒼耳植株，將果實與其它部位分離，晾干后用粉碎機打碎備用；(2)用五倍體積的95%乙醇浸泡數日并濃縮將粉碎后的意大利蒼耳果實用五倍體積的95%在室溫下浸泡七天；將浸泡液經過濾以去除殘渣，然后將濾液用旋轉蒸發儀蒸至無醇味，95%乙醇為常用乙醇試劑；(3)濃縮后的物質用石油醚脫脂取上述濃縮后的提取物，用溫水攪拌得混懸液；加入等體積石油醚萃取三次，棄掉石油醚部位；(4)脫脂后的剩余物用三氯甲烷萃取并濃縮上述脫脂后的混懸液再用等體積的三氯甲烷萃取三次，合并三氯甲烷相并用旋轉蒸發儀濃縮至干；(5)對三濾甲烷萃取物進行100-200目硅膠柱層析分離將三氯甲烷萃取物用100-200目硅膠柱層析進行分離，采用三氯甲烷甲醇按比例為98 2(v/v)洗脫；(6)洗脫組分濃縮后，取最先洗脫下來的黃色油狀物組分上S印hadexLH-20柱層析，用三氯甲烷甲醇按比例為I : I洗脫(V/V)，即可得到純度達95%以上的蒼耳皂素，蒼耳皂素結構參見附圖8。實施例二 (8 α，10 β )-4_氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯與商業除草劑的作用比較具體實驗方法將純化后的蒼耳皂素用三氯甲烷配制成lmg/ml濃度，然后依次稀釋至8 μ g/ml, 40 μ g/ml, 200 μ g/ml.在直徑9cm的培養皿中放置濾紙,然后加入3ml的不同濃度的蒼耳皂素溶液，依次是8 μ g/ml，40 μ g/ml，200 μ g/ml、1000 μ g/ml。待三氯甲烷徹底揮發干凈后，在每個培養皿中加入3ml蒸餾水，并在每個培養皿中加入10粒莧菜，生菜，小麥，黑麥草種子；用封口膜封好后置于25°C培養箱中培養4天后測量覓菜,生菜,小麥的苗高和根長，5天后測量黑麥草的苗高和根長；采用商業除草劑撲草凈用同樣方法進行試驗。數據統計方法首先用單因素方差檢測各組數據間的差異是否達到，之后用LSD方法分析數據，標記有*者與對照差異達到顯著，水平為> O. 05。結果本發明提供的(8a , 10 β ) ~4~ 氧-I (5), 2,11 (13)_ 蒼耳二稀-12,8-內酯，即蒼耳皂素在濃度較低的40μ g/ml時，即對受試植物產生顯著抑制作用；當濃度達到200 μ g/ml時，其對雙子葉植物莧菜的根長抑制率達到78%，對生菜達到89%，對單子葉植物小麥為69%，對黑麥草為67%;此外，受試植物的根扭曲變形，顏色變褐，提示已受到較嚴重的毒害；對苗高的抑制率為莧菜58%，生菜67%，小麥36%，40%;幼苗也發生扭曲變形現象。總體來說，本發明提供的(8 a , 10 β )-4-氧-I (5), 2,11 (13)_蒼耳二稀-12,8-內酯，即蒼耳皂素對雙子葉植物的抑制作用更為明顯。而當濃度升高到1000 μ g/ml時，可導致所有植物的種子基本完全不發芽而死亡，參見附圖1、2。和商業除草劑撲草凈進行比較實驗檢測對上述四種植物的生長抑制作用，結果顯示使用濃度低于200μ g/ml時，蒼耳皂素對四種植物的抑制作用略低于撲草凈；但是當使用濃度高于200 μ g/ml時，則蒼耳皂素對四種植物的抑制作用顯著強于撲草凈，參見附圖3、4。實施例三(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯作為除草劑的應用。具體實驗方法將本發明提供的(8 α，10 β ) _4_氧-I (5), 2,11 (13)-蒼耳二烯-12，8-內酯，即蒼耳皂素純品與水混懸后，以5mg/kg 土壤的比例添加到直徑20厘米的花盆中進行盆栽實驗。實驗用植物為莧菜，生菜，小麥，黑麥草。常規灌溉，未施肥。數周后進行觀測。
結果雙子葉植物生菜在出土發芽一周后基本停止生長，葉片出現枯黃現象，根系出現死亡，隨后植株逐漸死亡。參見附圖5為培養四周后的生菜幼苗。雙子葉植物蘿卜顯示出類似的現象，幼苗出土后生長不良，葉片枯萎變黃，根系首先死亡，植株隨后死亡。參見附圖6為培養三周后的蘿卜幼苗。作為對照，蒼耳皂素對單子葉植物小麥的影響很小，在處理六周之后植株生長基本正常。參見附圖7為培養六周后的小麥幼苗。結論I.本發明提供的(8 α，10 β )-4_氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯在低濃度40 μ g/ml時，即可對單、雙子葉植物生長產生顯著抑制。當濃度達到200 μ g/ml時，其對雙子葉植物莧菜的根長抑制率達到78%，對生菜達到89%，對單子葉植物小麥為69%，對黑麥草為67%。此外，受試植物的根扭曲變形，顏色變褐，提示已受到較嚴重的毒害。對苗高的抑制率為莧菜58%，生菜67%，小麥36%，40%。幼苗也發生扭曲變形現象。總體來說，蒼耳皂素對雙子葉植物的抑制作用更為明顯。而當濃度升高到ΙΟΟΟμ g/ml時，可導致所有植物的種子基本完全不發芽而死亡。其作用與商業除草劑撲草凈相當。效果參見附圖I至圖4。2.當將(8 a , 10 β )-4-氧-I (5), 2,11 (13)_蒼耳二稀-12,8-內酷，即蒼耳阜素與水混懸后，以5mg/kg 土壤的比例添加到土壤中進行盆栽實驗時，雙子葉植物生菜在出土發芽一周后基本停止生長，葉片出現枯黃現象，根系出現死亡，隨后植株逐漸死亡。雙子葉植物蘿卜顯示出類似的現象，幼苗出土后生長不良，葉片枯萎變黃，根系首先死亡，植株隨后死亡。作為對照，蒼耳皂素對單子葉植物小麥的影響很小，在處理六周之后植株生長基本正常。效果參見附圖5至圖7。將本發明提供的(8 a , 10 β ) ~4~氧-I (5) ,2,11 (13)-蒼耳二稀-12,8-內酷，即蒼耳皂素適合應用于農田中進行雜草的防除；由于其對單子葉植物如小麥等的影響遠小于對雙子葉植物的作用，因此蒼耳皂素更適合作為麥田防除雙子葉雜草使用。蒼耳皂素提取自外來入侵有害植物意大利蒼耳，該植物在野外生長繁茂，高度可達兩米以上，生物量高，從中提取除草劑既有利于環保，又對有害植物進行了綜合利用，有利于對其進行防控。蒼耳皂素為天然成分，在自然界可快速分解，不污染環境，可應用于有機農業的雜草防除。本發明通過提供的(8 α , 10 β ) -4-氧-I (5), 2,11 (13)-蒼耳二烯-12,8-內酯除草劑可以突出它是來源于植物的，可以在自然界分解，環保不污染環境，同時對有害植物進行了廢物利用。
權利要求
1.一種(8 α , 10 β ) _4_氧-I (5), 2,11 (13)-蒼耳二稀-12,8_內酷從意大利蒼耳提取的方法，其特征在于，所述的具體提取步驟如下 (1)采集成熟期的意大利蒼耳植株，將果實與其它部位分離，晾干后粉碎備用； (2)將粉碎后的意大利蒼耳果實用五倍體積的95%在室溫下浸泡七天；將浸泡液經過濾以出去殘渣，然后將濾液用旋轉蒸發儀蒸至無醇味； (3)取上述步驟(2)濃縮后的提取物，用溫水攪拌得混懸液；加入等體積石油醚萃取三次，棄掉石油醚部位； (4)上述步驟(3)脫脂后的混懸液再用等體積的三氯甲烷萃取三次，合并三氯甲烷相并用旋轉蒸發儀濃縮至干； (5)將三氯甲烷萃取物用100-200目硅膠柱層析進行分離，采用三氯甲烷甲醇按比例為98 2 (ν/ν)洗脫； (6)洗脫組分濃縮后，取最先洗脫下來的黃色油狀物組分上S^hadexLH-20柱層析，用三氯甲烷甲醇按比例為I : I洗脫(ν/ν)，即可獲得純度達95%以上的(8α，10β ) -4-氧-I (5), 2,11 (13)-蒼耳二稀-12,8-內酷，即獲得蒼耳阜素。
2.一種如權利要求I所述的(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11 (13)-蒼耳三烯-12，8-內酯作為除草劑的應用，其特征在于，通過將權利要求I所提供的(8 α，10 β )-4-氧-I (5)，2，11(13)-蒼耳三烯-12，8-內酯，即蒼耳皂素用95%乙醇溶解后，經稀釋10000-20000倍，在雜草出苗前按照噴施濃度500-1000 μ g/ml噴灑。
全文摘要
本發明公開了一種從意大利蒼耳提取純化(8α，10β)-4-氧-1(5)，2，11(13)-蒼耳三烯-12，8-內酯的提取方法及其作為除草劑的應用。意大利蒼耳果實用95％乙醇浸提后經石油醚脫脂及一次硅膠柱層析和一次凝膠柱層析后得到純度達95％以上的本化合物，將其用95％乙醇溶解后，經稀釋10000-20000倍，于雜草出苗前噴灑，噴施濃度500-1000μg/ml。作為植物源除草劑，該化合物在自然界易于分解，不污染環境，并對有害植物進行了廢物利用，具有重要的實用價值。
文檔編號A01P13/02GK102617530SQ20121006044
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者張丙昌, 張弛, 王敬竹, 邵華, 黃小麗 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所