專利名稱：一種鐵皮石斛無激素組織培養的方法
技術領域：
本發明屬于農業技術領域，具體涉及ー種鐵皮石斛無激素組織培養的方法。
背景技術：
鐵皮石斛(Dendrobium officinale)為多年生草本,屬附生蘭類,俗名鐵皮楓斗，因其老莖外呈黑色，又名為黑節草，石斛是常用的名貴中藥，應用歷史悠久，在《神農本草經》中被列為上品，現已證實它具有滋陰清熱、生津益胃、止咳潤肺、潤喉明目、提高人體免疫功能、防治腫瘤和心血管疾病以及改善睡眠、防治白內障、延年益壽等功效。但由于生長環境特殊和分布局限，以及長期采挖，自然資源日趨枯竭，已被國家列為重點保護的野生藥材并鼓勵人工大面積栽培鐵皮石斛，變野生為家種，以保障鐵皮石斛資源的可持續性發展和利用。 鐵皮石斛主要分布在亞熱帶地區，我國分布在西南和南方沿海各省，鐵皮石斛種子極小，無胚乳，自然條件下需與某些真菌共生才能萌發，很難用實生苗栽培，而傳統的分株、扦插等方式的繁殖率極低，加上人為地過度采挖，已瀕臨滅絕，為了保持品種的優良性狀，又能快速大量繁殖，通過鐵皮石斛蒴果或者莖尖組織培養技術產生原球莖，在原球莖階段進行增殖培養，再使原球莖分化苗繁育成小植株，I年內可以從原球莖繁育出百萬株試管苗。鐵皮石斛組織培養技術的研究，能有效地挽救這ー瀕臨滅絕的珍稀物種，而且可以使重要的種質資源得以保存。由于鐵皮石斛具有巨大的藥用價值，導致了長期無節制的采摘，致使資源瀕臨枯竭。1987年國家已將鐵皮石斛列為重點保護野生珍稀藥材品種，國家第一批《中國珍稀瀕危保護植物名錄》也將其列入其中。為了更好地保護鐵皮石斛野生資源，變野生為家種，應大力發展規模化人工栽培，切實保障鐵皮石斛資源的可持續利用。從20世紀70年代起，國內外有關機構便開始了鐵皮石斛的研發工作，尤其在鐵皮石斛的組織培養技術領域，但是一般組織培養過程中培養基的配制需要大量激素，比如“一種鐵皮石斛快繁的組培方法”(申請號2008101108704. 5)、“一種鐵皮石斛莖尖組培快速繁殖的育種方法”(申請號200710066480. I)、“通過植物組織培養對鐵皮石斛進行優良植物體的誘導和繼代增殖培養的方法”(申請號201110035697. 2)等，不但消耗了大量的資源，破壞了植物的遺傳多樣性，擾亂了自然生長的規律性，増加了組培生產成本。
發明內容
本發明針對目前鐵皮石斛組培過程中使用各種激素的問題提供ー種更加環保、綠色、低成本、便捷的鐵皮石斛無激素組織培養的方法，該方法減少在培養基配制過程中的資源浪費和時間消耗，為大規模的組培生產提供有利條件。本發明的目的是通過以下方式實現的—種鐵皮石斛無激素組織培養的方法，該方法包括鐵皮石斛種子萌發為圓球莖，圓球莖生長，増殖分化，莖段的生根、壯苗四個組織培養階段，這四個階段所用的培養基依次為無激素的MS培養基、無激素的MS基本培養基+ 土豆泥15 20g/l培養基、無激素的MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+ 土豆泥15 20g/l培養基和無激素的1/2MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+ 土豆泥15 20g/l培養基。所述四個階段采用的培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d。上述組織培養方法具體包括以下步驟a)將成熟鐵皮石斛蒴果 或鐵皮石斛種子經過消毒處理，播入無激素的MS基本培養基中培養25 30天種胚膨大、萌發形成綠色的圓球莖；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；b)將圓球莖轉入無激素的MS培養基+土豆泥15 20g/l培養基中，培養25 30天，圓球莖重疊堆積在無激素培養基中，并有葉原基和分化苗出現；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；c)將圓球莖分化苗轉入無激素的MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+ 土豆泥15 20g/l培養基中，誘導20 30天后有葉原基和高度達到I 2cm小苗出現，繼代培養30天成為中苗；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；d)將中苗轉入1/2MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+ 土豆泥15 20g/l的無激素培養基中，25 30天培育出5cm高以上的大苗并練苗移栽，練苗時保證75% 80%的含水量；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；以上四種培養基pH 5.6 5.8，均含3(^/1蔗糖，68/1瓊脂。土豆泥和香蕉泥均為新鮮土豆和新鮮香蕉的搗碎獲得。本發明所述的無激素的MS基本培養基(又稱MS培養基)以及無激素的1/2MS基本培養基(又稱1/2MS培養基)用水均為普通自來水。由于目前鐵皮石斛組培過程中使用各種激素產生了多種問題，本發明在組培培養基配置過程中不添加任何激素，并且根據不同時期的不同需求，用天然的土豆泥和香蕉泥作為營養成分代替激素，不但大大的降低了生產成本，而且更加環保，符合目前緑色農業的發展需求，培養出的鐵皮石斛苗比有激素組織培養培養出的苗在指標成分高，減少在培養基配制過程中的資源浪費和時間消耗，為大規模的組培生產提供有利條件。與現有技術比較本發明的有益效果鐵皮石斛組織培養過程中培養基的配制非常重要，培養基不但要求在無菌條件下，最重要的是要給鐵皮石斛的生長提供所需的及適宜的生長環境。傳統MS培養基的配制需要大量元素、微量元素、有機物、鐵鹽、蔗糖、激素、瓊脂和蒸餾水，而激素價格昂貴，植株生長容易產生依賴性。本發明鐵皮石斛無激素組織培養的方法中培養基的配制不添加任何激素，根據不同時期的不同需求，用土豆泥或香蕉泥代替激素提供營養成分。本發明采用無激素的改良MS培養基進行組培，不但對鐵皮石斛組織培養四個不同階段的正常生長沒有任何影響，而且大大的降低生產成本，另外，本發明采用自來水代替蒸餾水，也節約了更多的能源物質、減少不必要的浪費，達到了中藥材生產過程中高效、安全、緑色、可控、低成本的要求。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進ー步說明。以下實施例對鐵皮石斛原球莖培養，圓球莖的生長，圓球莖的増殖分化，莖段的壯苗、生根四個階段進行組織培養。實施例I鐵皮石斛無激素組織培養方法a)將從野外收集到的成熟鐵皮石斛蒴果或鐵皮石斛種子經過消毒處理，播入無激素的MS培養基中培養25天種胚膨大、萌發形成緑色的圓球莖；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；b)將圓球莖轉入無激素的基本MS基本培養基+ 土豆泥20g/l培養基中，培養25天，圓球莖重疊堆積在無激素培養基中，并有葉原基和分化苗出現；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；c)將圓球莖分化苗轉入無激素的MS基本培養基+香蕉泥15g/l+ 土豆泥15g/l培 養基中，誘導20 30天后有葉原基和高度達到I 2cm小苗出現，繼代培養后30天成為中苗；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；d)將中苗轉入1/2MS基本培養基+香蕉泥15g/l+ 土豆泥15g/l的無激素培養基中，25 30天培育出5cm高以上的大苗并練苗移栽，練苗時要保證在75% 80%的含水量，保持空氣濕潤；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ；以上四種培養基PH均為5. 8，均含30g/l蔗糖，6g/l瓊脂。其中，無激素的MS基本培養基+香蕉泥15g/l+土豆泥15g/l培養基成分組成(定容時采用普通自來水)
權利要求
1.一種鐵皮石斛無激素組織培養的方法，其特征在于該方法包括鐵皮石斛種子萌發為圓球莖，圓球莖的生長，増殖分化，莖段的生根、壯苗四個組織培養階段，這四個階段所用的培養基依次為無激素的MS培養基、無激素的MS基本培養基+ 土豆泥15 20g/l培養基、無激素的MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+土豆泥15 20g/l培養基和無激素的1/2MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+ 土豆泥15 20g/l培養基。
2.根據權利要求I所述的鐵皮石斛無激素組織培養的方法，其特征在于所述四個階段采用的培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d。
3.根據權利要求I所述的鐵皮石斛無激素組織培養的方法，其特征在于該組織培養方法具體包括以下步驟 a)將成熟鐵皮石斛蒴果或鐵皮石斛種子經過消毒處理，播入無激素的MS基本培養基中培養25 30天種胚膨大、萌發形成綠色的圓球莖；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ； b)將圓球莖轉入無激素的MS培養基+土豆泥15 20g/l培養基中，培養25 30天，圓球莖重疊堆積在無激素培養基中，并有葉原基和分化苗出現；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ； c)將圓球莖分化苗轉入無激素的MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+土豆泥15 20g/l培養基中，誘導20 30天后有葉原基和高度達到I 2cm小苗出現，繼代培養30天成為中苗；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ； d)將中苗轉入1/2MS基本培養基+香蕉泥15 20g/l+土豆泥15 20g/l的無激素培養基中，25 30天培育出5cm高以上的大苗并練苗移栽，練苗時保證75% 80%的含水量；培養條件培養溫度23 27°C，光照度1500 20001x，光照時間12h/d ； 以上四種培養基pH 5. 6 5. 8，均含30g/l蔗糖，6g/l瓊脂。
4.根據權利要求I所述的鐵皮石斛無激素組織培養的方法，其特征在于所述的無激素的MS基本培養基以及無激素的1/2MS基本培養基用水均為普通自來水。
全文摘要
本發明公開一種鐵皮石斛無激素組織培養的方法，該方法包括鐵皮石斛種子萌發為圓球莖，圓球莖的生長，增殖分化，莖段的生根、壯苗四個組織培養階段，這四個階段所用的培養基依次為無激素的MS培養基、無激素的MS基本培養基+土豆泥15～20g/l培養基、無激素的MS基本培養基+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l培養基和無激素的1/2MS基本培養基+香蕉泥15～20g/l+土豆泥15～20g/l培養基。本發明無激素培養和有激素培養得到的鐵皮石斛培養物多糖和總生物堿含量增加，鐵皮石斛的生長狀況正常，保護了植物品種的遺傳多樣性，本發明使得鐵皮石斛的組織培養更加方便、綠色環保，節約資源。
文檔編號A01H4/00GK102613086SQ20121010203
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者向增旭, 楊嵐 申請人:南京農業大學