專利名稱：極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的保存、活化及快速擴繁方法
技術領域：
本發明涉及一種極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的保存、活化及快速擴繁方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
干旱化是面臨的全球性的嚴峻問題。干旱不僅造成農業的重大損失，還加劇了生態環境的惡化及土地沙漠化和水土流失。解決此問題的直接辦法是有效節水。植物是人類賴以生存的基礎，怎樣才能使植物抗旱節水？這就需要從耐旱植物為切入點，深入了解植物的耐旱機理及調控機制，從而改善植物的耐旱能力。隨著基因工程和分子生物學技術的迅速發展與完善，抗旱基因資源的搜索和抗旱分子機制研究不斷深入，取得了一定的進展。近年來，叢蘚科植物由于杰出的抗逆性能以及特殊的水化-再水化過程而受關注，成為分子生物學研究領域(尤其是植物抗逆分子機制方面)巨大潛能的材料。苔蘚是水生向陸生的一種過渡形式，是高等植物中最原始的類群，是一種結構簡單的小型非維管植物。它能在高溫、高寒、干旱和弱光等惡劣的自然環境條件下生長繁衍，并具有極強的生命力。并且，苔蘚與高等陸生植物有很多相似特點，為基因功能的研究提供了良好的材料。早在上世紀70年代,科學家就以小立碗蘚(Physcomitrella patens)為植物分子生物學研究材料進行了很多相關研究，取得了一定進展。時代不斷前進中，在本世紀初(2000年)，苔蘚專家Oliver提出耐旱山墻蘚(Tortula rural is)是研究逆境生物學的模式植物，并進行初步的基因組學分析。在本發明前期的研究中，包括齒肋赤蘚的生理和生態方面的研究結果，以及和Oliver課題組研究結果的比較中，我們得出齒肋赤蘚作為分子生物學材料優于山墻蘚。并且首次解決和完善了齒肋赤蘚單株克隆純系材料的培養、保存、活化及擴繁體系。可用于生理生化、抗逆分子生物學及環境修復方面的研究。齒肋赤蘇(Syntrichiacaninervis)隸屬于叢蘇科(Pottiaceae)赤蘇屬(Syntrichia sp.)，分布于干旱半干旱的荒漠地區。我國首次發現于新疆古爾班通古特沙漠。它是荒漠苔蘚中的主要成員之一，作為環境演替過程中主要的先鋒植物，參與土壤生物結皮形成，在防風固沙中起重要作用。它還是一種變水植物，在極端干旱、貧瘠、強風沙的自然條件下，呈休眠狀態，似一層灰黑色的“殼”覆蓋在沙漠表面，形成有重要生態意義的苔蘚生物結皮；一旦遇到降水，能迅速通過再水化過程而“復原”呈鮮活的綠色，并開始執行光合作用。由于這些特殊的生命現象而備受關注，使其有望成為抗逆分子生物學研究的模式植物。經對現有的技術的文獻檢索，中國專利申請號為200910054354. 3提供一種細葉小羽蘚配子體的快繁方法，利用羽狀先端為材料，誘導的新生配子體經過切割剪碎擴繁。該專利可應用于大氣重金屬污染的治理方面；中國專利申請號為200810035554. X提供齒肋赤蘚原絲體為材料，在沙土中擴大培養(共需要4個月)，該專利為沙漠生態恢復及環境綠化提供方法依據；然而，在本發明前期的實驗中發現原絲體在沙土中擴大培養容易污染綠藻，從而影響齒肋赤蘚的擴繁，與200810035554. x相比，本專利是用單株克隆在沙土上擴大，或者直接在培養基中擴大培養，節約培養時間(僅需1-2個個月)，且不容易被綠藻污染。專利申請號為201110084559. 3的專利提供了原絲體的保存方法；然而，前期實驗表明原絲體的活化不如外植體容易(推測是因為外植體已經具備齒肋赤蘚的耐旱特性及復水現象)，因此，本專利在此基礎上改進，保存材料為發育完整的單株克隆。以及中國專利申請號為201110116117. 2的專利提供了齒肋赤蘚單株克隆的培養基為BBM(pH = 8. 0);在本專利的實例中表明，改良的Knop培養基成分更簡單，更經濟，且更適合齒肋赤蘚單株克隆的生長。進一步檢索沒有有關齒肋赤蘚單株克隆系的保存、活化及快速擴繁方面的報道。然而，鑒于齒肋赤蘚將成為模式植物，建立快捷高效的齒肋赤蘚單株克隆系的保存及快繁顯得尤為重要，因 此，本發明重點在于提供一種經濟、高效、快速的齒肋赤蘚組織培養、保存、活化和快速擴繁方法，為齒肋赤蘚遺傳轉化體系的建立奠定基礎，同時為利用齒肋赤蘚構建生物結皮進行荒漠化治理這一 “沙漠地毯工程”提供技術支撐。
發明內容
本發明的目的在于，針對國內外有關齒肋赤蘚培養和保存的技術現狀，提供一種極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的保存、活化及快速擴繁方法，該方法是將剝離出復水后的野生齒肋赤蘚鮮綠的葉片，接種至改良的Knop固體培養基上培養產生原絲體，再轉接至新鮮改良的Knop固體培養基中可生成大量單株克隆再生苗；將再生苗緩慢干燥后，置于超低溫冰箱長期保存；保存的材料經緩慢復水后，再進行擴大培養獲得大批量的純系材料。活化的齒肋赤蘚單克隆株系具有比野生的外植體更強更快的分化能力。本發明所述方法可從一個葉片或外植體在1-2個月內快速克隆出大批量的單克隆系，為齒肋赤蘚作為抗旱研究的模式植物提供持續的純系材料，同時為“沙漠地毯工程”提供方法依據。為抗逆基因組學、正向、反向遺傳學研究提供純系材料，推進齒肋赤蘚作為抗逆分子生物學研究模式材料的進程。實現齒肋赤蘚單克隆純系材料的永續獲得以及擴大。本發明所述方法簡便、成本低、周期短、獲得的單株克隆系發育程度一致。本發明所述的一種極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的培養、保存、活化及快速擴繁方法，按下列步驟進行齒肋赤蘚的組織培養a、將野外采集的齒肋赤蘚洗凈后，剝離假根、莖和葉子，剝離出復水后的野生齒肋赤蘚鮮綠的葉片，無菌水震蕩洗滌5次，然后接種至改良的Knop固體培養基上，置于光照培養箱中培養，培養溫度為白天25°C，晚上15°C，光照周期為白天14h，晚上10h，光照強度為40001x，濕度為50%，培養2-3周，產生的大量原絲體；b、將步驟a中產生的原絲體繼代至新鮮的Knop固體培養基上繼續培養7_10天，培養溫度為白天25°C，晚上15°C，光照周期為白天14h，晚上10h，光照強度為40001x，濕度為50%，產生大量的齒肋赤蘚單株克隆再生苗；齒肋赤蘚的保存C、將步驟b齒肋赤蘚單株克隆再生苗，經室溫緩慢干燥24小時后裝于滅菌的
I.5mLEP管中，置于超低溫冰箱長期保存；齒肋赤蘚單株克隆的活化
d、取出超低溫保存的齒肋赤蘚單株克隆，置于室溫或冰上放置30min后，接種至改良的knop固體培養基中，置于光照培養箱中復蘇I天，然后將完整植株切割剪碎或將完整的植株接種至改良的Knop固體培養基或將完整的植株在沙土基質中擴繁；齒肋赤蘚單株克隆的快速擴繁e、將完整植株切割剪碎活化的單株克隆系用噴灑的方式接種再生苗的碎片，在改良的Knop固體培養基中10天就開始出現大量的原絲體和單株克隆小苗雛形；或將完整的植株接種至改良的Knop固體培養基上繼代培養，每隔10-15天繼代一次，培養溫度為白天25°C，晚上15°C、光照周期為白天14h，晚上10h，光照強度為40001x，濕度為50%，即可獲得大量的單克隆株系；土培苗的擴繁培養先將沙土用改良的Knop液體培養基浸濕，將活化后的完整的植株噴灑至沙土培養基中，室溫培養，光照白天12h，晚上12h，濕度為50%，光強為40001x，即可獲得大量的單克隆株系。所述方法中涉及的改良的Knop固體培養基為0. 25g/L KH2PO4、KCI和MgSO4-7H 20,lg/L Ca (NO3) 2. 4H20 和 0. 0125g/L FeSO4 7H20 組成，pH 值為 6. 5。本發明所述的一種極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的培養、保存、活化及快速擴繁方法，該方法經過了大量的篩選試驗齒肋赤蘚培養基篩選野外采集的齒肋赤蘚樣品洗凈后，剝離綠色葉片，用滅菌水震蕩洗滌5次，分別接種60片葉子至BCD、ppNH4、BBM、BGll、Knop和改良的Knop培養基。各培養基配方見表1，置于光照培養箱中培養，培養條件溫度為白天25°C，晚上15°C、光周期為白天14h，晚上10h，光照強度為40001x，濕度為50%，10天后統計原絲體發生率，原絲體的面積及密度見顯微觀察
圖1，結果表明改良的Knop培養基的原絲體發生率、面積及密度最高。表I本發明所用的培養基成分表
權利要求
1.一種極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的培養、保存、活化及快速擴繁方法，其特征在于按下列步驟進行齒肋赤蘚的組織培養a、將野外采集的齒肋赤蘚洗凈后，剝離假根、莖和葉子，剝離出復水后的野生齒肋赤蘚鮮綠的葉片，無菌水震蕩洗滌5次，然后接種至改良的Knop固體培養基上，置于光照培養箱中培養，培養溫度為白天25°C，晚上15°C，光照周期為白天14h，晚上10h，光照強度為 40001x，濕度為50%，培養2-3周，產生的大量原絲體；b、將步驟a中產生的原絲體繼代至新鮮的Knop固體培養基上繼續培養7_10天，培養溫度為白天25°C，晚上15°C，光照周期為白天14h，晚上10h，光照強度為40001x，濕度為 50%，產生大量的齒肋赤蘚單株克隆再生苗；齒肋赤蘚的保存C、將步驟b齒肋赤蘚單株克隆再生苗，經室溫緩慢干燥24小時后裝于滅菌的I. 5mLEP 管中，置于超低溫冰箱長期保存；齒肋赤蘚單株克隆的活化d、取出超低溫保存的齒肋赤蘚單株克隆，置于室溫或冰上放置30min后，接種至改良的knop固體培養基中，置于光照培養箱中復蘇I天，然后將完整植株切割剪碎或將完整的植株接種至改良的Knop固體培養基或將完整的植株在沙土基質中擴繁；齒肋赤蘚單株克隆的快速擴繁e、將完整植株切割剪碎活化的單株克隆系用噴灑的方式接種再生苗的碎片，在改良的 Knop固體培養基中10天就開始出現大量的原絲體和單株克隆小苗雛形；或將完整的植株接種至改良的Knop固體培養基上繼代培養，每隔10-15天繼代一次，培養溫度為白天25°C， 晚上15°C、光照周期為白天14h，晚上10h，光照強度為40001x，濕度為50%，即可獲得大量的單克隆株系；土培苗的擴繁培養先將沙土用改良的Knop液體培養基浸濕，將活化后的完整的植株噴灑至沙土培養基中，室溫培養，光照白天12h，晚上12h，濕度為50%，光強為 40001x,即可獲得大量的單克隆株系。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于該方法中涉及的改良的Knop固體培養基為0.25g/L KH2PO4' KCl 和 MgSO4 7H20、lg/L Ca (NO3) 2. 4H20 和 0. 0125g/L FeSO4 7H20 組成， pH值為6. 5。
全文摘要
本發明涉及一種極端耐旱齒肋赤蘚單株克隆系的保存、活化及擴繁方法，該方法是將剝離出復水后的野生齒肋赤蘚鮮綠的葉片，接種至改良的Knop固體培養基上，再轉接至新鮮改良的Knop固體培養基中生成大量單株克隆再生苗；將再生苗緩慢干燥后，置于超低溫冰箱長期保存；保存的材料經緩慢復水后，再進行擴大培養獲得大批量的純系材料。本發明所述方法可從一個葉片或外植體在1-2個月內快速克隆出大批量的單克隆系，為齒肋赤蘚作為抗旱研究的模式植物提供持續的純系材料，同時為“沙漠地毯工程”提供方法依據。實現齒肋赤蘚單克隆純系材料的永續獲得以及擴大。本發明所述方法簡便、成本低、周期短、獲得的單株克隆系發育程度一致。
文檔編號A01H4/00GK102626050SQ20121012328
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月25日 優先權日2012年4月25日
發明者張元明, 張道遠, 李小雙, 楊紅蘭 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所