專利名稱：一種利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物線蟲的培養方法，具體涉及一種利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法。
背景技術：
水稻干尖線蟲besseyiChristie, 1942)病最早于 1915 年在日本，在20世紀40年代由日本傳入中國，曾被列為中國對內檢疫對象,后因采取嚴格檢疫和種子處理措施，該病害在20世紀80年代基本受到控制。但是近10多年，該病害的發生范圍和為害嚴重度又開始加大，目前在我國主要稻區均有分布，局部地區發生和為害嚴重。水稻干尖線蟲分布廣泛、幾乎遍布所有的稻產區，在我國廣東、廣西、湖南、湖北、浙江、江蘇、安徽、山東、河北、上海、遼寧、陜西、貴州、四川、云南、臺灣等省及地區的主要稻區均有分布。 水稻干尖線蟲的寄主范圍廣,可以寄生35屬200多種植物。水稻(Oryza sativa)和草莓iFragaria aaaaasa)是水稻干尖線蟲的重要寄主。在水稻上的危害,據報道,該線蟲病在不同地區和不同年代危害造成的損失有差異，在美國為40 50%，在印度為20 60%，在伊朗為 54. 5% ;在日本，Nishizawa 和 Yamamoto (1951)報道為 14. 5 46. 7%, Tamura 和Kegasawka (1959)報道感病品種的損失達60% ;在前蘇聯,Tikhonova (1966)報道為41 71%, Popova (1984)報道為54%。我國江蘇省每年水稻干尖線蟲病發生面積約10萬hm2,一般減產10% 30%，為害嚴重的減產高達50%以上，據估計，2001 2003年江蘇省水稻干尖線蟲病累計發生面積約33萬hm2，至少造成稻谷減產累計超過5億kg，經濟損失約7. 5億元。在臺灣，洪元平(1959)首次調查報道水稻干尖線蟲造成的減產為30 47%，Tsay等(1998)報道在臺灣當植株侵染率超過50%時，產量損失高達45%，從90年代中期，該病害在臺灣的發生也日益嚴重。線蟲的人工培養有多種方法，包括利用真菌和細菌等微生物培養法、活體植株接種培養法、寄主愈傷組織培養法等，不同類型線蟲的培養所采用的具體方法取決于其生物學特性。水稻干尖線蟲是植物寄生線蟲，但也可以取食真菌完成生活史，因此水稻干尖線蟲的人工培養，目前主要是采取利用真菌的培養方法。現有技術中可以培養水稻干尖線蟲的真菌有灰葡萄孢菌(Potrytis ciflerea)、鏈格孢菌(Alterrmriei sp.)、鐮刀菌{Fusariumsp.)、柑橘黑腐病病原真菌ciiri)等。用真菌培養水稻干尖線蟲方法簡單、繁殖率高，但是長期在長菌上培養會影響水稻干尖線蟲對植物的寄生和致病力。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種利用植物愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，該方法即可實現簡單、大量培養繁殖水稻干尖線蟲的目的，又能保持水稻干尖線蟲對植物的寄生和致病力。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，步驟如下(1)制備胡蘿卜愈傷組織新鮮胡蘿卜洗凈，用工業酒精浸泡后灼燒，至胡蘿卜表皮變成暗紅色，削去表皮，切成片放入滅菌培養皿中，封口，置于培養箱中培養至長出胡蘿卜愈傷組織；
(2)線蟲的消毒和接種水稻干尖線蟲用硫酸鏈霉素溶液消毒，然后離心，沉淀用無菌水混勻繼續離心，最后沉淀用無菌水稀釋分散滴在胡蘿卜愈傷組織上；
(3)線蟲的培養繁殖和保存將接種了水稻干尖線蟲的胡蘿卜愈傷組織正置放入黑暗培養箱內，在25°C 30°C培養或20°C 25°C保存。植物寄生線蟲不同屬間的生物學特性差異較大，并非所有的植物線蟲都可以采用統一的方法進行培養，現有技術中可以用胡蘿卜愈傷組織培養香蕉穿孔線蟲，但香蕉穿孔線蟲與水稻干尖線蟲在分類地位上屬于不同的目，寄主不同；利用胡蘿卜愈傷組織法可以培養墊刃目短體屬(如香蕉穿孔線蟲)的種類，此類線蟲的口針比較粗壯，便于穿刺寄主表皮獲得營養，而胡蘿卜是其自然寄主，所以最早發明胡蘿卜愈傷組織方法用于培養此類線蟲；水稻干尖線蟲屬于滑刃目，口針不發達，目前成功培養出來此類的線蟲種類多以真菌培養為主，尚未有在植物組織上進行培養的報道；利用真菌培養水稻干尖線蟲可以獲得大量的線蟲，但在后續的分子生物學特性或者致病性等方面的研究過程中，容易受其食物的影響，此外經常以真菌為食對其致病能力有影響，所以選擇以植物組織為食可以避免此類的問題；由于胡蘿卜不是水稻干尖線蟲的寄主，所以很難想到可以利用胡蘿卜愈傷組織培養該線蟲，所以本發明的實現為水稻干尖線蟲的培養提供了一種經濟有效、操作簡便、收集線蟲簡便干凈且保存和繼代培養都比較方便相對長久的方法。上述利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，還包括線蟲繼代培養的步驟，是用無菌水清洗保存線蟲的培養皿中的線蟲，再重復步驟(2)和(3)的操作，即消毒、離心、接種培養。保存線蟲的培養皿取出后，因為要繼代培養線蟲，所以其清潔度一定要保證，使用無菌水可以避免讓線蟲再接觸其他微生物。在進行繼代培養時，挑取的線蟲最好為雌蟲，以獲得最大量的線蟲。上述步驟(I)中酒精浸泡時間優選為2min。酒精選用工業酒精即可，培養皿封口可以使用封口膜或者保鮮膜，培養箱溫度最好設置為25°C，培養箱設置為黑暗條件，2周左右即可長出愈傷組織。上述步驟(2)中水稻干尖線蟲的消毒用O. 2% (質量百分含量)硫酸鏈霉素處理3h或以上，可以達到消毒目的，不影響其正常的繁殖發育。上述步驟(2)所述離心條件優選為4000rpm下2min,最好能重復兩次。線蟲稀釋液最好滴在胡蘿卜愈傷組織表面的靠近邊緣處。上述步驟(3)培養溫度最佳為30°C，雖然水稻干尖線蟲不同種群的最適培養溫度有差異，但多數種群的最適培養溫度是30°C，在培養3周后即可繁殖大量的線蟲，培養7周后繁殖的線蟲量最大，可看到愈傷組織變成淡黃色或暗黃色。保存溫度為2(T25°C的情況下可以保存3 4個月。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明的方法即可實現簡單、大量培養繁殖水稻干尖線蟲的目的，又能保持水稻干尖線蟲對植物的寄生和致病力。I.用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲，與真菌培養方法相比，操作方法更加簡、便，培養材料更易獲得。水稻干尖線蟲是植物寄生線蟲，其長期在真菌上培養會導致其對植物寄生和致病力的退化，在胡蘿卜愈傷組織長期培養則能避免此情況發生。2.用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲，在Γ5周達到最大繁殖量后，不需馬上轉到新的愈傷組織上進行繼代培養，可以將培養皿移到比繁殖溫度低5°C的黑暗培養箱中保存3-4月后，胡蘿卜愈傷組織仍不腐爛并有部分活蟲存在，這時再進行繼代培養。而用真菌培養，在:Γ5周達到最大繁殖量后，菌絲被線蟲吃完，必須轉到新培養的菌絲上繼代培養。因此，胡蘿卜愈傷組織培養法不僅可以快速獲得大量線蟲，而且還可以用于長期保存，減少繼代培養次數。3.用胡蘿卜愈傷組織來繁殖香蕉穿孔線蟲可以取得很好的效果，但是用濃度為95%的酒精噴灑于胡蘿卜表面進行消毒不夠徹底，表皮表面的空隙或者芽眼中可能會殘留病原菌，所以在經濟實惠的工業酒精中浸泡2 min可以達到深層卻不傷害胡蘿卜次生韌皮部和形成層的消毒目的，有利于愈傷組織的正常生長；此外，可以直接將切成片的胡蘿卜放進滅菌的培養皿中，封口后放入培養箱培養愈傷組織，不需要任何培養基。所以該方法簡便 且經濟實用。
圖I.經過消毒后切好的胡蘿卜。圖2.2周后長出愈傷組織的胡蘿卜。圖3.接種水稻干尖線蟲5周的胡蘿卜愈傷組織。圖4.接種水稻干尖線蟲4個月后的胡蘿卜愈傷組織。
具體實施例方式下面結合實施例進一步解釋本發明，實施例中如無特殊說明，均為本領域常規實驗技術手段。實施例I水稻干尖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖歷期
供試水稻干尖線蟲種群見下表I，各種群均保存于華南農業大學。表I供試的水稻干尖線蟲種群及其來源 _
譯號I種群編號I來源地I寄主
I_HN-2_河南省羅山_7jC稻(Oryzasa ti va )_
2~N80 江蘇省淮安市淮陰區袁集鎮袁集村灰稻⑷safjVa)—
3~ NlO _江蘇省南京市六合區雄州鎮紅星村水稻(fl 4~ A-I 安徽省淮南宮集鎮一
5_JZ_湖北省宑j州長江大學試驗田_7jC稻(6>. sativa)_
6_Hq2_貴州省貴陽花溪區花溪鎮小寨村_7jC稻(6>. sativa)_
7_YQ3_貴州省余慶縣白泥鎮陸家寨村_7jC稻(6>. sativa)_
8_Xi_福建省廈門同安區五顯鎮西洋村~_7jC稻(6>. sativa)_
9_X5_福建省廈門翔安區新圩鎮馬塘村_水稻(6>. sativa)_
10~Hb _海南省海口市獅子嶺水稻(β
ΤΓ~ HC6 _廣東省惠州市陳江鎮洋嶺村水稻(0. saOVa)
12~G27 廣東省茂名茂南區山閣鎮灰稻⑷MOVa)—
13~ J12 廣東省江門市新會區大澤鎮北洋村永稻⑷—
ΤΓ~ Gb _廣東省廣州華南農業大學岑村農場水稻(ft saOVa)
15 S24_廣東省深圳市龍崗區同樂基地_{Fragariaananasa )_具體步驟如下
(I)胡蘿卜愈傷組織培養基的制備
市場上購買新鮮的胡蘿卜，沖洗干凈后，切去前端和末端，再用蒸餾水水沖洗，在工業酒精中浸泡2 min，然后在酒精燈上灼燒，至胡蘿卜的表皮由桔紅色變為暗紅色；用滅菌的削皮刀削去胡蘿卜的表皮，然后將胡蘿卜切成厚度為5_左右的薄片，薄片單層放入滅菌培養皿中，每個培養皿放一片(見圖1)，用保鮮膜封口，然后放入25°C培養箱中黑暗培養2周作用，長出愈傷組織備用(圖2)。水瓊脂培養基配制10g瓊脂粉放入IOOOmL蒸餾水中煮沸，得到10g/L水瓊脂培養基，分裝與培養瓶中封口，高壓(121°C，20min)滅菌。(2)水稻上的水稻干尖線蟲分離
將水稻的葉片、葉鞘和穗分別剪碎，用貝曼漏斗法分離線蟲[謝輝.2005.植物線蟲 分類學(第二版)·北京高等教育出版社，P38-40]。(3)水稻干尖線蟲的消毒和接種
分別挑取每個供試的水稻干尖線蟲種群20條雌蟲放入裝有O. 2 %硫酸鏈霉素的I. 5mL離心管中，放置3h以上，4 000 rpm離心2 min，去除上清，用無菌水清洗兩次，在超凈工作臺上，去除上清液，吸取離心管中的線蟲懸浮液，接種到制備好的胡蘿卜愈傷組織表面，用保鮮膜封好，放入20°C、25°C和30°C培養箱中黑暗培養7d、14 d、21d、28d和35 d。每個處理5個重復。(4)水稻干尖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上培養一定時間后線蟲的收集
將接種水稻干尖線蟲的胡蘿卜愈傷組織置于供試條件下達到設定的培養時間后取出，先將培養皿蓋子上的線蟲用清水沖洗到燒杯中，然后把胡蘿卜愈傷組織放入攪拌器中，力口適量水攪拌，將攪拌后得到的懸浮液通過100目(孔徑150 Mffl),500目(孔徑26 Mm)的組合篩，用自來水反復沖洗后，用洗瓶沖洗收集500目篩上的線蟲至小燒杯中。(5)水稻干尖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上培養后的蟲數統計和分析
將從每個處理重復的胡蘿卜愈傷組織上分離出的水稻干尖線蟲配制成10 mL線蟲懸浮液，充分混均后，吸取I mL線蟲懸浮液于潔凈的培養皿(直徑5mL)中，在體視顯微鏡統計線蟲數量，重復3次，其平均值X 10，即為該胡蘿卜愈傷組織上培養繁殖的水稻干尖線蟲數量。供試的15個水稻干尖線蟲接種在胡蘿卜愈傷組織上在供試溫度和時間內的繁殖結果表明(表2、3、4，表中數據為5次重復的平均值,括號內的數值為標準誤(S. E);表中同一行數據后字母相同者表示在O. 05水平上差異不顯著(DMRT法))，這些種群在不同溫度下達到最大繁殖率所經歷的時間存在差異。20°C時，達到最大繁殖倍數的歷期A-I種群是14d，Xi是21d，HN_2、YQ3、X5、G27和Gb是28d，其他8個種群均是35d，其中Hq2在28d和35d的繁殖率相同，有4個種群最大繁殖倍數超過100，其中達到最大繁殖量所需培養時間最短的A-I種群的最大繁殖率在所有供試種群中也最小僅為3. 4。在25°C時，達到最大繁殖倍數的歷期HN-2種群是14d，Hb、G27、J12和S24種群是21d, N80、Xi、X5和HC6種群是28d，其他6個種群均是35d，有11個種群最大繁殖倍數超過100，其中達到最大繁殖量所需培養時間最短的HN-2種群的最大繁殖率在所有供試種群中也最小僅為2. 45。在30°C時，達到最大繁殖量的歷期Xi、X5和Hb種群是21d，N80、N10、A-1、HC6、G27和Gb種群是28d，其他6個種群均是35d，所有種群的最大繁殖倍數均超過100。可見用胡蘿卜愈傷組織上，繁殖水稻干尖線蟲的合適溫度和時間是25 30°C培養21-35 d。繁殖水稻干尖線蟲的合適溫度和時間是25 30°C培養 21-35d。 表2 20°C下水稻干尖線蟲不同種群在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖率
權利要求
1.一種利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，其特征在于步驟如下 (1)制備胡蘿卜愈傷組織新鮮胡蘿卜洗凈，用工業酒精浸泡后灼燒，至胡蘿卜表皮變成暗紅色，削去表皮，切成片放入滅菌培養皿中，封口，放入培養箱培養至長出胡蘿卜愈傷組織； (2)線蟲的消毒和接種水稻干尖線蟲用硫酸鏈霉素溶液消毒，然后離心，沉淀用無菌水混勻繼續離心，最后沉淀用無菌水稀釋分散滴在胡蘿卜愈傷組織上； (3)線蟲的培養繁殖和保存將接種了水稻干尖線蟲的胡蘿卜愈傷組織放入黑暗培養箱內，在25°C 30°C培養或20°C 25°C保存。
2.根據權利要求I所述利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，其特征在于還包括線蟲繼代培養的步驟，是用無菌水清洗保存線蟲的培養皿中的線蟲，再重復步驟(2)和(3)的操作。
3.根據權利要求I所述利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，其特征在于步驟(I)中工業酒精浸泡時間為2min。
4.根據權利要求I所述利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，其特征在于步驟(I)中培養箱內的培養溫度為25°C，黑暗培養。
5.根據權利要求I所述利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，其特征在于步驟(2)所述硫酸鏈霉素的消毒濃度為O. 2wt. %，消毒時間3h以上。
6.根據權利要求I所述利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，其特征在于步驟(2)離心條件為4000rpm下2min。
全文摘要
本發明公開了一種利用胡蘿卜愈傷組織培養水稻干尖線蟲的方法，屬于植物線蟲培養保存技術領域。該方法的具體步驟為新鮮胡蘿卜洗凈，用酒精浸泡后灼燒，至胡蘿卜表皮變成暗紅色，削去表皮，切成片放入裝有水瓊脂培養基的滅菌培養皿中，封口，放入培養箱中培養至長出胡蘿卜愈傷組織；水稻干尖線蟲用硫酸鏈霉素溶液消毒，然后離心，沉淀用無菌水混勻繼續離心，最后沉淀用無菌水稀釋分散滴在胡蘿卜愈傷組織上；將接種了水稻干尖線蟲的胡蘿卜愈傷組織放入黑暗培養箱內，在25℃~30℃培養或20℃~25℃保存。本發明的培養方法即可實現簡單、大量培養繁殖水稻干尖線蟲的目的，又能保持水稻干尖線蟲對植物的寄生和致病力。
文檔編號A01K67/033GK102696554SQ20121014770
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者徐春玲, 王珂, 程曦, 裴艷艷, 謝輝 申請人:華南農業大學