專利名稱：一種毛竹體細胞胚胎發生的方法
技術領域：
本發明涉及林木生物技術和組織培養領域，特別涉及到毛竹體細胞胚胎發生。
背景技術：
二十世紀80年代以來，隨著國際上植物生物技術的快速發展，國內外對竹子生物技術研究也逐漸增加，目前國際上和本專利有關的竹子再生體系方面的報道主要有1982年Metha等報道了印度刺竹(Bambusa arundinacea)成熟胚誘導出愈傷組織和再生植株(參考文獻I)。、1983 年 Huang 和 Murashige 從剛竹屬(Phyllostachy)、箬竹屬(Sasa)、簕竹屬(Bambusa)的葉片和嫩莖尖誘導出愈傷組織(參考文獻2)。1985年Rao等以牡竹(Dendrocalamus. strictus)成熟種子誘導了愈傷組織，進而再生植株(參考文獻3)。1986 年 Yeh 和 Chang 用綠竹(B. oldhamii)、吊絲球竹(B. beecheyana)的花序以體細胞胚胎發生方式再生植株(參考文獻4、5)。1987年Hassan等報道了剛竹(Ph. viridis)葉片愈傷組織的植株再生(參考文獻6)。1989年Huang等報道了用綠竹(B. oldhamii)、羅漢竹(Ph. aurea)和箬竹(S. pygmaea)的嫩莖尖進行愈傷組織誘導，僅由BA和NAA誘導的愈傷組織可器官發生，形成再生植株(參考文獻7)。1990年Tsay報道利用麻竹(Sinocalamus Iatiflora)花藥誘導出愈傷組織并實現植株再生(參考文獻8)。2002年Godbole等用版納甜龍竹(D. hamiItonii)桿芽誘導出愈傷組織并實現植株再生(參考文獻9)。2005年Ogita利用毛金竹(Ph. nigra var. henosis)竹笑誘導出愈傷組織,但愈傷組織容易褐變，沒有再生(參考文獻10)。2007年Gillis等利用巴苦竹(B. balcooa)小穗誘導出愈傷組織并建立了高效再生體系(參考文獻11)。2011年Cheah等利用小佛肚竹(B. ventricosa)桿芽誘導出愈傷組織并實現植株再生(參考文獻12)。我國大陸學者在竹子生物技術方面的研究起步較晚。1991年闕國寧等報導了對黃竹(D. membranceus)和印度刺竹(B. arundinacea)的培養(參考文獻13-14)，2008年吳濤等報導了對金絲慈竹(B. affinis ‘Viridiflavus’ )的培養(參考文獻15)，均屬經愈傷組織再生竹株的研究，其外植體均為嫩芽。2009年袁金玲等以孝順竹(B. multiplex)種胚和小穗為外植體誘導出愈傷組織并實現植株再生，以種胚外植體的再生效率較高(參考文獻16)。2010年喬桂榮等以麻竹花藥為外植體誘導出愈傷組織并獲得再生植株(參考文獻17)，同年Zhang et al.以版納甜龍竹的種胚為外植體誘導出愈傷組織并實現植株再生(參考文獻18)。2011裴海燕等以雷竹(Ph. violascens)種胚為外植體，脫分化產生愈傷組織，愈傷組織再生出芽(參考文獻19)。就毛竹而言，周宏(2005)、蘆娟娟(2006)分別利用毛竹筍芽誘導出愈傷組織，但沒有得到再生植株(參考文獻20-21)。李楠利用毛竹種子誘導出愈傷組織，但生長較慢、質地疏松，水潰化嚴重，未能獲得再生植株(參考文獻22)。岳晉軍等研究了不同放置和切割方式對毛竹種胚愈傷組織誘導率和質量的影響，未見實現植株再生(參考文獻23)。綜上所述，散生竹通過愈傷組織的植株再生體系尚不完善，對毛竹的研究僅處于愈傷組織誘導階段，均未見獲得再生植株。穩定高效的毛竹體細胞胚胎發生體系已經成為制約毛竹生物技術育種的關鍵技術障礙。本發明提供了毛竹體細胞胚胎發生的方法 ，將為毛竹的細胞工程、基因工程以及分子生物學的研究提供技術平臺。主要參考文獻I. Mehta UI, Rao VR, Ram HYM. Somatic embryogenesis in bamboo[C]. InProceeding 5th Interenational Cogress of Plant tissue culture&cell Culture，Tokyo, Japan,1982，109-1102.Huang LC， Murashige T. Tissue culture investigations of bamboo
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發明內容
一種毛竹(Phyllostachys heterocycla var. pubescens)體細胞胚胎發生的方法，其特征包括外植體消毒，愈傷組織誘導與增殖，胚狀體誘導、萌發與植株再生，以及壯苗、煉苗和移栽過程，具體步驟如下(I)外植體消毒選擇健康飽滿的種實，先用75% (v/v)的乙醇處理I分鐘；再用每升加5-6滴吐溫-80的0. 2%次氯酸鈉處理15-20分鐘；然后用無菌水沖洗數次；最后用無菌紙吸干表面水分后接種；(2)愈傷組織誘導與增殖將消毒后的外植體接種到誘導培養基上，暗培養20-30天使愈傷組織形成，愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎，添加l_8mg/L的2，4-D、0. l-5mg/L的ZT、10g/L的卡拉膠、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；然后將淡黃色致密的愈傷組織分離出來，接種到繼代培養基上增殖培養70-90天，增殖培養基是以MS培養基為基礎，添加l_8mg/L的2，4-D、10g/L的卡拉膠、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；(3)胚狀體誘導、萌發與植株再生將增殖培養后的愈傷組織接種到胚狀體誘導 培養基上，暗培養20-40天，使胚狀體形成，胚狀體誘導培養基是以MS培養基為基礎，添加
l-8mg/L的ZT、l-3mg/L的BA、l_5mg/L的KT、30g/L的麥芽糖、10g/L的卡拉膠；然后將胚狀體接種到分化培養基上，光照培養30-50天，胚狀體逐漸萌發形成再生植株；分化培養是以MS培養基為基礎，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的卡拉膠；光照時間12小時/日，光照強度800-20001ux ；(4)壯苗、煉苗和移栽將體細胞胚胎再生的小植株接種到壯苗培養基上培養50-60天，開瓶煉苗5-7天，取出小苗清洗根部的培養基，再用0. I %的高錳酸鉀溶液清洗根部，然后將小苗栽植到滅菌的介質中，遮陰散射光培養一個月后，幼苗成活；所述的壯苗培養基是以MS培養基為基礎，添加l_4mg/L的NAA、0. 2-0. 5mg/L的TDZ、10g/L的卡拉膠。
具體實施例方式下面結合毛竹(Phyllostachysheterocycla var. pubescens)實例對本發明進行詳細說明。(I)挑選飽滿健康種實,先用75% (v/v)乙醇處理I分鐘；再用每升加5-6滴吐溫-80的0. 2%的次氯酸鈉處理15-20分鐘；然后用無菌水沖洗數次；最后用無菌紙吸干表面水分后待接種；(2)將消毒后的外植體接種到愈傷組織誘導培養基上，誘導培養基是以MS培養基為基礎，添加4mg/L的2,4-D、0. lmg/L的ZT、10g/L的卡拉膠、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白，26°C暗培養20-30天，外植體形成米粒大小的愈傷組織；將淡黃色致密的愈傷組織分離出來，接種到繼代增殖培養基上，增殖培養基是以MS培養基為基礎，添加2mg/L的2,4-D、10g/L的卡拉膠、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白，暗培養30天即可增殖一倍以上；(3)將繼代增殖的胚性愈傷組織接種到胚狀體誘導培養基上，胚狀體誘導培養基是以MS培養基為基礎，添加4mg/L的ZTU. 5mg/L的BA,2. 5mg/L的KT、30g/L的麥芽糖、10g/L的卡拉膠，26°C暗培養20-40天，多數愈傷形成胚狀體；然后將胚狀體接種到分化培養基上，分化培養是以MS培養基為基礎，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的卡拉膠，光照培養30-50天，光照時間12小時/日，光照強度1200-20001uX，胚狀體逐漸萌發形成再生植株；(4)壯苗、煉苗和移栽將體細胞胚胎再生的小植株接種到壯苗培養基中，壯苗培養基是以MS培養基為基礎，添加4mg/L的NAA、0. 2mg/L的TDZ、10g/L的卡拉膠，培養50-60天，開瓶煉苗5-7天，取出小苗清洗根部的培養基，再用低濃度高錳酸鉀溶液清洗根部，然 后將小苗栽植到滅菌的介質(山地黃壤土 蛭石泥炭土 = 1:1:1)中，遮陰散射光培養一個月后，幼苗成活。
權利要求
1.一種毛竹(Phyllostachys heterocycla var. pubescens)體細胞胚胎發生的方法，其特征包括外植體消毒，愈傷組織誘導與增殖，胚狀體誘導、萌發與植株再生，以及壯苗、煉苗和移栽過程，具體步驟如下 (1)外植體消毒選擇健康飽滿的種實，先用75%(v/v)的乙醇處理I分鐘；再用每升加5-6滴吐溫-80的0. 2%次氯酸鈉處理15-20分鐘；然后用無菌水沖洗數次；最后用無菌紙吸干表面水分后接種； (2)愈傷組織誘導與增殖將消毒后的外植體接種到誘導培養基上，暗培養20-30天使愈傷組織形成，愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎，添加l_8mg/L的2，4-D、.0. l-5mg/L的ZT、10g/L的卡拉膠、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白；然后將淡黃色致密的愈傷組織分離出來，接種到繼代培養基上增殖培養70-90天，增殖培養基是以MS培養基為基礎，添加l_8mg/L的2，4-D、10g/L的卡拉膠、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白； (3)胚狀體誘導、萌發與植株再生將增殖培養后的愈傷組織接種到胚狀體誘導培養基上，暗培養20-40天，使胚狀體形成，胚狀體誘導培養基是以MS培養基為基礎，添加.l-8mg/L的ZT、l-3mg/L的BA、l_5mg/L的KT、30g/L的麥芽糖、10g/L的卡拉膠；然后將胚狀體接種到分化培養基上，光照培養30-50天，胚狀體逐漸萌發形成再生植株；分化培養是以MS培養基為基礎，添加500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、.10g/L的卡拉膠；光照時間12小時/日，光照強度800-20001ux ； (4)壯苗、煉苗和移栽將體細胞胚胎再生的小植株接種到壯苗培養基上培養50-60天，開瓶煉苗5-7天，取出小苗清洗根部的培養基，再用0. I %的高錳酸鉀溶液清洗根部，然后將小苗栽植到滅菌的介質中，遮陰散射光培養一個月后，幼苗成活；所述的壯苗培養基是以MS培養基為基礎，添加l_4mg/L的NAA、0. 2-0. 5mg/L的TDZ、10g/L的卡拉膠。
全文摘要
本發明公開了一種毛竹(Phyllostachys heterocycla var.pubescens)體細胞胚胎發生的方法，它是通過對外植體進行適宜消毒后，在誘導培養基上誘導出愈傷組織，愈傷組織經增殖培養后首先在分化培養基上形成胚狀體，然后胚狀體在萌發培養基上完成萌發并形成再生植株，最后再生植株經壯苗培養、煉苗后移栽成活。本發明解決了毛竹體細胞胚胎發生的技術難題，為實現以毛竹為代表的散生竹類的生物技術育種提供了技術平臺。
文檔編號A01H4/00GK102657093SQ20121016245
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者岳晉軍, 袁金玲, 顧小平 申請人:岳晉軍, 袁金玲, 顧小平