沙地云杉體細胞胚胎發生的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物栽培領域，具體的講，涉及沙地云杉成熟胚體細胞胚胎發生的一種方法。
【背景技術】
[0002]沙地云杉(Picea mongoIica)是分布在內蒙古境內的白音敖包自然保護區的我國特有新種，屬于珍稀植物。沙地云杉作為一個獨特的沙地造林樹種，為在沙地系統中建立能夠維持沙地并向綠洲化方向發展的可持續系統防護林工程提供了一個新的思路。因此，研究沙地云杉快繁具有極大的經濟意義和生態意義；由于沙地云杉種子生產易受到大小年、倒春寒及重齒小蠹等蟲害影響，有性繁殖受到阻礙，而利用成熟胚進行體細胞胚胎發生具有眾多優點，如數量多、繁殖速度快、不受季節影響、植株再生率高等，成為植物無性繁殖的一種主要手段。對沙地云杉種質資源的保存、擴繁及生產實踐中的開發利用都具有重要的意義。
【發明內容】
[0003]本發明目的為了解決運用體細胞胚胎發生技術實現沙地云杉快繁問題，以沙地云杉成熟胚為外植體，以LM為基本培養基附加不同濃度的6-BA、2，4-D、KT、ABA、PEG4000來誘導胚性愈傷組織、胚性愈傷組織增殖、胚胎分化、干化處理以及植株再生，并提供一種誘導、繼代及成苗時的方法及培養條件，以實現植株再生與快繁。
[0004]本發明目的實現由以下技術方案完成:
本發明包括以下生產步驟:
(O將成熟的沙地云杉種子用清水浸泡12?15h，將漂浮于液面的種子舍棄，余下的種子用自來水沖洗3?4次。在超凈工作臺中，將云杉種子先用70?75%酒精浸泡28?32s后用無菌水清洗3?5次，再用2%次氯酸鈉溶液消毒12min,然后用無菌水沖洗3?5次；
(2)將經步驟(I)處理過的種子以手術刀剝取完整的種胚后，接種于下列培養基中:LM培養基+6-BA (2 ?5mg/L)+2, 4-D (4 ?8mg/L)+KT (0.5 ?2.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+結冷膠(2g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行誘導培養20?25d生成愈傷組織；
(3)將步驟(2)所述的愈傷組織接種于以下培養基中:1/2?1/4LM培養基+6-BA(I?4mg/L)+2，4-D (I ?5mg/L)+ KT (0.1 ?1.0mg/L) + 鹿糖(20 ?30g/L) + 結冷膠(2 ?4g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行繼代培養20?25d使愈傷組織進一步生長；
(4)將步驟(3)所述的愈傷組織接種于下列培養基中:1/2?1/4LM培養基+6-BA(1.0 ?1.9mg/L) +2，4-D (1.0 ?1.9mg/L) + KT (0.1 ?0.5mg/L) + 蔗糖(20 ?30g/L)+結冷膠(2?4g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行繼代培養20?25d,得到淡黃色緊密結構的非胚性愈傷組織與白色半透明絲狀的胚性愈傷；
(5)將步驟(4)所述的胚性愈傷組織接種于下列培養基中:1/2?1/4LM培養基+6-BA(0.1 ?1.0mg/L) +2, 4-D (1.0 ?3.0mg/L) + 鹿糖(20 ?30g/L) + 結冷膠(2 ?4g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行增殖培養，每隔20?25d以相同配方繼代培養進行增殖；
(6)將步驟(5)所述的胚性愈傷組織接種于下列培養基中:1/2?1/4LM培養基+ABA(15 ?20mg/L) +PEG4000 (40 ?50g/L) + 蔗糖(20 ?30g/L) + 結冷膠(2 ?4g/L)，pH 控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行分化培養，每隔20d以相同配方進行繼代培養；40?60d后即長出云杉體細胞胚；
(7)將步驟(6)所述的體細胞胚接種于1/2?1/4LM培養基+蔗糖(20?40g/L)+結冷膠(3?7g/L)+PEG4000(50?80g/L)培養7d以上，將體胚平鋪于兩層濕潤的濾紙上，放在一個無菌培養皿中干化處理7天，每個培養皿放置約150個體細胞胚，以上過程均在培養溫度為22±2°C、光照條件為1200LX、光照時間為14h/d的條件下進行從而達到干化目的。
[0005](8)將步驟(7)所述的完成干化的體細胞胚接種于1/4?1/2LM培養基+蔗糖(20?30g/L) +瓊脂(5?8g/L)，30d后即可萌發并長成帶根的鍵壯云杉幼苗。
[0006]本發明的優點是以沙地云杉成熟胚為外植體，以LM為基本培養基，附加不同濃度的6-BA、2，4-D、KT、ABA、PEG4000來進行胚性愈傷組織誘導、胚性愈傷組織增殖、胚胎分化、干化處理以及植株再生，并提供一種誘導、繼代及成苗時的方法及培養條件，以實現植株再生與快繁。
[0007]具體實施方案:
實施例1
(1)將成熟的沙地云杉種子用清水浸泡12h，將漂浮于液面的種子舍棄，余下的種子用自來水沖洗三遍。在超凈工作臺中，將云杉種子先用75%酒精浸泡30s后用無菌水清洗3次，再用2%次氯酸鈉溶液消毒12min，然后用無菌水沖洗5次；
(2)將經步驟(I)處理過的種子以手術刀剝取完整的種胚后，接種于下列培養基中:LM培養基+6-BA (3mg/L)+2, 4_D (6mg/L)+KT (lmg/L) + 鹿糖(30g/L)+結冷膠(2g/L)，pH 控制在5.7、溫度為22±2°C、暗條件下進行誘導培養20d生成愈傷組織；
(3)將步驟(2)所述的愈傷組織接種于以下培養基中:1/2LM培養基+6-BA(2mg/L)+2，4-D (3mg/L)+KT (0.2mg/L) + 蔗糖(20g/L) + 結冷膠(2g/L)，pH 控制在 5.7、溫度為22±2°C、暗條件下進行繼代培養20d使愈傷組織進一步生長；
(4)將步驟(3)所述的愈傷組織接種于下列培養基中:1/2LM培養基+6-BA(1.lmg/L)+2，4-D (1.6mg/L)+ KT (0.2mg/L) + 蔗糖(20g/L) + 結冷膠(2g/L)，pH 控制在 5.7、溫度為22±2°C、暗條件下進行繼代培養20d，得到淡黃色緊密結構的非胚性愈傷組織與白色半透明絲狀的胚性愈傷；
(5)將步驟(4)所述的胚性愈傷組織接種于下列培養基中:1/2LM培養基+6-BA(0.8mg/L) +2, 4-D (1.5mg/L) + 蔗糖(20g/L) + 結冷膠(2g/L)，pH 控制在 5.8、溫度為 22±2°C、暗條件下進行增殖培養，每隔20d以相同配方繼代培養進行增殖；
(6)將步驟(5)所述的胚性愈傷組織接種于下列培養基中:1/2LM培養基+ABA(18mg/L)+PEG4000 (45g/L)+蔗糖(30g/L)+ 結冷膠(4g/L)，pH 控制在 5.6 ?5.8、溫度為 22±2°C、暗條件下進行分化培養，每隔20d以相同配方進行繼代培養；50d后即長出云杉體細胞胚；
(7)將步驟(6)所述的體細胞胚接種于1/4LM培養基+蔗糖(20g/L) +結冷膠(5g/L)+PEG4000 (70g/L)培養7d后，將體胚平鋪于兩層濕潤的濾紙上，放在一個無菌培養皿中處理7d，每個培養皿放置約150個體細胞胚，以上過程均在培養溫度為22±2°C、光照條件為1200LX、光照時間為14h/d的條件下進行從而達到干化目的。
[0008](8)將步驟(7)所述的完成干化的體細胞胚接種于1/4LM培養基+蔗糖(20g/L) +瓊脂(6g/L)，30d后即可長成帶根的鍵壯云杉幼苗。
[0009]本發明的優點是以沙地云杉成熟胚為外植體，以LM為基本培養基附加不同濃度的6-BA、2，4-D、KT、ABA、PEG4000來誘導胚性愈傷組織、胚性愈傷組織增殖、胚胎分化、干化處理以及植株再生，并提供一種誘導、繼代及成苗時的方法及培養條件，以實現植株再生與快繁。
[0010]本發明方法胚性愈傷誘導率為12%，增殖期以4.6倍速率增殖，分化期胚性愈傷平均分化產生體細胞胚297個/g，干化處理后體細胞胚萌發率為76.8%。
[0011]雖然以上對本發明目的構思和實施例作了詳盡說明，但本領域普通技術人員可以認識到，在沒有脫離權利要求限定范圍的前提條件下，仍然可以對本發明作出各種改進和變換，而這種改進和變換仍然應當屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種沙地云杉體細胞胚胎發生的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將成熟的沙地云杉種子用清水浸泡12?15h，將漂浮于液面的種子舍棄，余下的種子用自來水沖洗3?4次；在超凈工作臺中，將云杉種子先用70?75%酒精浸泡28?32s后用無菌水清洗3?5次，再用2%次氯酸鈉溶液消毒12min,然后用無菌水沖洗3?5次； (2)將經步驟(I)處理過的種子以手術刀剝取完整的種胚后，接種于下列培養基中:LM培養基+6-BA (2 ?5mg/L)+2, 4-D (4 ?8mg/L)+KT (0.5 ?2.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+結冷膠(2g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行誘導培養20?25d生成愈傷組織； (3)將步驟(2)所述的愈傷組織接種于以下培養基中:1/2?1/4LM培養基+6-BA(I?4mg/L)+2，4-D (I ?5mg/L)+ KT (0.1 ?1.0mg/L) + 鹿糖(20 ?30g/L) + 結冷膠(2 ?4g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行繼代培養20?25d使愈傷組織進一步生長； (4)將步驟(3)所述的愈傷組織接種于下列培養基中:1/2?1/4LM培養基+6-BA(1.0 ?1.9mg/L) +2，4-D (1.0 ?1.9mg/L) + KT (0.1 ?0.5mg/L) + 蔗糖(20 ?30g/L)+結冷膠(2?4g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行繼代培養20?25d,得到淡黃色緊密結構的非胚性愈傷組織與白色半透明絲狀的胚性愈傷； (5)將步驟(4)所述的胚性愈傷組織接種于下列培養基中:1/2?1/4LM培養基+6-BA(0.1 ?1.0mg/L) +2, 4-D (1.0 ?3.0mg/L) + 鹿糖(20 ?30g/L) + 結冷膠(2 ?4g/L)，pH控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行增殖培養，每隔20?25d以相同配方繼代培養進行增殖； (6)將步驟(5)所述的胚性愈傷組織接種于下列培養基中:1/2?1/4LM培養基+ABA(15 ?20mg/L) +PEG4000 (40 ?50g/L) + 蔗糖(20 ?30g/L) + 結冷膠(2 ?4g/L)，pH 控制在5.6?5.8、溫度為22±2°C、暗條件下進行分化培養，每隔20d以相同配方進行繼代培養；40?60d后即長出云杉體細胞胚； (7)將步驟(6)所述的體細胞胚接種于1/2?1/4LM培養基+蔗糖(20?40g/L)+結冷膠(3?7g/L)+PEG4000(50?80g/L)培養7d以上，將體胚平鋪于兩層濕潤的濾紙上，放在一個無菌培養皿中干化處理7天，每個培養皿放置約150個體細胞胚，以上過程均在培養溫度為22±2°C、光照條件為1200LX、光照時間為14h/d的條件下進行從而達到干化目的；(8)將步驟(7)所述的完成干化的體細胞胚接種于1/4?1/2LM培養基+蔗糖(20?30g/L) +瓊脂(5?8g/L)，30d后即可萌發并長成帶根的鍵壯云杉幼苗。
【專利摘要】本發明為一種沙地云杉體細胞胚胎發生的方法，屬于植物栽培領域種苗技術，具體的講是利用沙地云杉成熟胚誘導體細胞胚胎發生的方法。本發明采用完全成熟的沙地云杉種子，剝取成熟胚為外植體材料，接種到愈傷誘導培養基上培養，兩次繼代后產生胚性愈傷，將上述愈傷增殖從而能達到擴繁目的，再由胚性愈傷分化產生體細胞胚，體細胞胚經干化處理后正常萌發：本發明的優點是，采用本發明所述的沙地云杉成熟胚誘導體細胞胚胎發生，獲得了大量的沙地云杉體細胞胚，擺脫了以幼胚作為外植體而產生的季節上的瓶頸，實現沙地云杉的快速繁殖。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165618
【申請號】
【發明人】白玉娥, 何炎紅, 葉冬梅, 代金玲, 彭鵬, 曾超
【申請人】內蒙古農業大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月10日