米曲霉降解秸稈生產蛋白飼料的方法
【專利摘要】本發明米曲霉降解秸稈生產蛋白飼料的方法，涉及生物工程領域。涉及利用秸稈為主要原料，通過米曲霉（Aspergillusoryzae）發酵，生產蛋白飼料的方法，其生產工藝流程是秸稈經過粉碎、預濕等預處理工藝，米曲霉經過液體搖瓶培養、一級種子培養、與秸稈混合進行固態發酵，得到發酵秸稈的蛋白飼料。此發酵工藝簡便，不會對環境造成污染，也不會對資源造成浪費。采用此方法制得的飼料蛋白質含量15～30%，木質素降解率為34～76%，飼料得率45～60%。飼料由于米曲霉的作用降解木質素、纖維素,因而提高了秸稈的利用率。
【專利說明】米曲霉降解秸稈生產蛋白飼料的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域，特指未經高溫、高壓處理的秸桿通過米曲霉降解秸桿中的木質素、纖維素，生產蛋白飼料的工藝流程。
【背景技術】
[0002]我國是農業大國，每年農作物秸桿年產逾6億噸，除少量被用作紡織、造紙行業，但大部分以堆積、焚燒的形式傾入環境，既浪費了資源也給環境造成了極大地危害。
[0003]秸桿含有植物光合作用所積累的一半以上的能量，富含粗糖、粗蛋白質等有利于家畜家禽所需的成分，作為非競爭性的飼料資源，只要能夠進行合理的加工調制，用來飼喂畜禽，特別是用來飼喂牛、羊等反芻家畜，有可能成為優質的飼料資源。同時，我國又是一個飼料(尤其是蛋白質飼料)嚴重短缺的大國，每年需進口大量的魚粉以彌補蛋白質飼料的不足。能否將秸桿纖維轉化為動物可利用且營養價值高的蛋白質飼料，以解決飼料需求的嚴重不足，就顯得尤為重要。
[0004]植物的秸桿主要有木質素和纖維素構成。木質素是一類由苯酚和非苯酚結構單元通過醚鍵和碳碳鍵等連接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在組分種類和連接鍵類型方面的多樣性，意味著其結構的異質性與不規則性，也決定了對木質素進行生物降解的復雜性和特殊性，且其在植物細胞壁中與半纖維素以共價鍵形式結合后，將纖維素分子包埋在其中，形成堅固的天然屏障，使一般的微生物很難進入其中分解纖維素，因此，木質素的降解也是能否有效利用秸桿資源的關鍵因素。
[0005]目前降解秸桿的主要方法中有代表性的包括蒸汽汽爆預處理、硫酸預處理、氫氧化鈉預處理、氨水預處理和生物預處理等5種方法。蒸汽汽爆則是以高壓蒸汽滲入纖維內部，以氣流的方式從封閉的空隙中釋放出來，纖維發生一定的機械斷裂，使原料中大部分半纖維素和少量木質素、纖維素降解溶出，該方法成分較高，需要大型的設備，木質素還需要處理；酸處理法是利用硫酸水解糖苷鍵、酯鍵等，使玉米秸桿纖維的網狀結構疏松，但是該方法耗用大量的有機酸或無機酸，木質素仍需要進一步處理，不適應大規模的工業化生產。堿處理和氨水處理是利用木質素溶于堿性溶液，與酸處理一樣同樣存在環境污染問題。這由于些方法普遍都存在反應條件較難掌握、反應溫度高、處理時間長、占用空間大、處理效果不理想，不能去除木質纖維素等問題。
[0006]米曲霉能分泌多種酶類如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、植酸酶、糖化酶等，因此該菌在現代工業中的應用領域不斷擴展。Tejomyee S.B.等人從被久效磷污染的土壤中分離得到米曲霉，研究其對農藥久效磷的生物降解作用，研究結果表明在較短時間里米曲霉對久效磷降解的高效性。Truong Q.T.等人研究了用米曲霉處理含有高濃度懸浮體的木薯淀粉加工廢水中的情況，通過改變多種影響米曲霉生長的因素來提高其對廢水的降解效率，其降解率可高達90%。Xiang J.M.等人從煙葉中分離得到了能降解尼古丁的米曲霉，研究利用米曲霉的靜息細胞分析對尼古丁的降解途徑。通過對降解過程中間產物的分析，最終確定了利用真菌降解尼古丁的新途徑。Parshetti G.K.等人研究了米曲霉NCIM-1146對活性藍-25的生物降解作用。研究發現活性藍的脫色是通過真菌的吸收然后才被降解的，在搖床培養條件下比靜置培養具有較快的吸收和脫色。添加葡萄糖后提高了米曲霉對活性藍的降解。由此可見米曲霉具有降解較難降解有機物的能力。
[0007]
【發明內容】
[0008]本發明人經過深入的研究，摸索出一種以秸桿為主要原料，通過米曲霉菌體固體培養降解秸桿中的木質素、纖維素，生產蛋白飼料的工藝。該工藝不同于過去的方法在于所使用的菌種是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協會(AAFCO)、我國農業部認定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑的米曲霉菌種，采用秸桿作為主要原料，通過固態發酵獲得蛋白飼料。
[0009]本發明目的是提供了一種以米曲霉為菌種，以秸桿為原料進行固態發酵的生產蛋白飼料的工藝，包括以米曲霉為出發菌株，進行試管擴大培養、液體搖瓶培養、一級種子培養和固體發酵培養，得到降解秸桿的蛋白飼料。
[0010]本發明所用的菌種是米曲霉任何一種菌種，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、國家獸醫微生物菌種保藏中心(CVCC)和抗生素菌種保藏管理中心等等保藏的菌種。
[0011]本發明所使用的原料是任意一種秸桿，如玉米秸桿、稻草秸桿、麥秸桿、高粱秸桿、大豆秸桿、棉花秸桿等等所有含有木質素的農作物秸桿，秸桿首先經過粉碎，過20?100目的篩。
[0012]本發明所述的發酵工藝中，其試管擴大培養基為馬鈴薯蔗糖培養基。
[0013]本發明所述的發酵工藝中，其液體搖瓶培養基和一級種子培養基均為(克/升):葡萄糖5?30，酒石酸銨0.1?5，苯甲醇0.2?3，硫酸鎂0.2?1，吐溫80 0.5?10，磷酸二氫鉀2?9，鄰苯二甲酸3?18，pH 5?8，120?140°C滅菌20?40分鐘；
其中所述的搖瓶培養工藝條件為，接種一環米曲霉試管斜面孢子于裝有16?48% (體積比)培養基的三角瓶中，在轉速:150轉/分，25?35°C，培養24?72小時；
其中所述的一級種子培養工藝為，按I?20% (體積比)的接種量將搖瓶培養種子液接種到一級種子培養基中，在溫度25?35°C，攪拌轉速50?200轉/分，通氣量0.2?2:1體積/體積/每分鐘(通氣氣體體積/發酵液體積/每分鐘),培養18?72小時；
本發明所述的固體發酵培養中，其固體發酵培養基組成為:秸桿10千克，水20?60千克，葡萄糖0.5?3千克，尿素0.05?0.2千克；硫酸銅5?15克，硫酸亞鐵5?15克，硫酸錳5?20克，該培養基各成分可以按同等此比例放大；
其中所述的固體發酵培養發酵工藝為:按2?20%(種子液體積/發酵培養基重量)，培養料厚度為0.1?0.4米，料寬0.5?2米，長度不限，通氣量為0.3?1.5:1 (氣體體積/發酵培養基重量)/每分鐘，培養時間為3天?23天，中途翻料I?2次。
[0014]在本發明所述的發酵工藝中，在進行搖瓶培養之前，首先將米曲霉菌種接入新配置的馬鈴薯蔗糖培養基中進行培養，培養溫度25?35°C，培養時間48?144小時；4?10 °C保存備用。[0015]由本發明獲得秸桿發酵物含有大量的黃色米曲霉孢子，發酵物色質米黃色至褐色，具有酒香味，木質素降解率為34-76%，蛋白質含量為15-40%，飼料得率為45-60%。
[0016]根據本發明所述的發酵培養工藝，結合本領域的基本知識，可以根據生產需要，增加二級、三級甚至四級種子罐，進一步擴大固態發酵生產規模，以進行工業化生產。二級、三級甚至四級種子罐采用的培養基與搖瓶培養基和一級種子培養基相同，接種量為5-20%，培養條件同于一級種子培養。
[0017]采用此工藝的優點采用固態發酵，并且不經高溫高壓處理，這樣不會給環境造成污染，也不會浪費資源。
[0018]為了進一步闡述本發明的技術方案所涉及的材料及工藝，給出了以下實施例，但是這些實施例不以任何形式限制本發明的范圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
圖1是本發明米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0019]根據此工藝采用的蛋白質測定方法為采用南京建成生物工程公司生產的考馬斯亮蘭試劑盒測定方法。準確稱取I克蛋白飼料，溶于50mL水中，室溫振蕩2小時，抽濾，濾液定容至50mL，即為樣品液，用于蛋白質測定。測定操作步驟按試劑盒說明書進行。蛋白質含量按下列公式計算:
【權利要求】
1.米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于按照下述步驟進行:以秸桿為原料進行固態發酵的生產蛋白飼料的工藝，包括以米曲霉為出發菌株，進行試管擴大培養、液體搖瓶培養、一級種子培養和固體發酵培養，得到降解秸桿的蛋白飼料。
2.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于所用的菌種是米曲霉任何一種菌種，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、國家獸醫微生物菌種保藏中心(CVCC)和抗生素菌種保藏管理中心等等保臧的菌種。
3.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于所使用的原料是任意一種秸桿，如玉米秸桿、稻草秸桿、麥秸桿、高粱秸桿、大豆秸桿、棉花秸桿等等所有含有木質素的農作物秸桿，秸桿首先經過粉碎，過20?100目的篩。
4.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于所述的發酵工藝中，其試管擴大培養基為馬鈴薯蔗糖培養基。
5.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于所述的發酵工藝中，其液體搖瓶培養基和一級種子培養基均為克/升:葡萄糖5?30，酒石酸銨0.1?5，苯甲醇0.2?3，硫酸鎂0.2?I，吐溫80 0.5?10，磷酸二氫鉀2?9，鄰苯二甲酸3?18，pH 5?8，120?140°C滅菌20?40分鐘； 根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于其中所述的搖瓶培養工藝條件為，接種一環米曲霉試管斜面孢子于裝有體積比16?48%培養基的三角瓶中，在轉速:150轉/分，25?35°C，培養24?72小時。
6.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于其中所述的一級種子培養工藝為，按體積比I?20%的接種量將搖瓶培養種子液接種到一級種子培養基中，在溫度25?35°C，攪拌轉速50?200轉/分，通氣量0.2?2:1體積/體積/每分鐘(通氣氣體體積/發酵液體積/每分鐘),培養18?72小時。
7.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于所述的固體發酵培養中，其固體發酵培養基組成為:秸桿10千克，水20?60千克，葡萄糖0.5?3千克，尿素0.05?0.2千克；硫酸銅5?15克，硫酸亞鐵5?15克，硫酸錳5?20克，該培養基各成分可以按同等此比例放大。
8.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于其中所述的固體發酵培養發酵工藝為:按種子液體積/發酵培養基重量的2?20%，培養料厚度為0.1?0.4米，料寬0.5?2米，長度不限，通氣量為0.3?1.5:1 (氣體體積/發酵培養基重量)/每分鐘，培養時間為3天?23天，中途翻料I?2次。
9.根據權利要求1所述的米曲霉降解秸桿生產蛋白飼料的方法，其特征在于在本發明所述的發酵工藝中，在進行搖瓶培養之前，首先將米曲霉菌種接入新配置的馬鈴薯蔗糖培養基中進行培養，培養溫度25?35°C，培養時間48?144小時；4?10°C保存備用。
【文檔編號】A23K1/14GK103444988SQ201210169686
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月29日 優先權日:2012年5月29日
【發明者】張志才, 陳鈞, 任曉鋒, 黃達明 申請人:江蘇大學