從煙草克隆細胞色素p450基因的制作方法

專利名稱：從煙草克隆細胞色素p450基因的制作方法
從煙草克隆細胞色素P450基因此案是申請日為2004年10月15日、中國申請號為200480030387. X、發明名稱為“從煙草克隆細胞色素P450基因”的發明申請的分案申請。本發明涉及在煙草(Nicotiana)植物中編碼細胞色素P450酶(下文稱為P450和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列來改變植物表型的方法。
背景技術：
細胞色素P450催化各種化學上不同的底物的酶反應，包括內源性和異源底物的氧化、過氧化和還原性代謝。在植物中，P450參與包括植物產物合成在內的生化途徑，所述產物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物堿、職類、脂質、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)和葡糖異硫氰酸鹽(glucosinolates) (ChappeI, Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 198,49:311-343)。細胞色素p450也稱為血紅素-硫醇鹽蛋白(heme-thiolate protein),通常用作多組分電子轉移鏈(稱為含p450的單加氧酶系統)中的末端氧化酶。所催化的特定反應包括脫甲基化、羥基化、環氧化、N-氧化、磺基氧化(sulfooxidation)、N_、S_和O-脫烷基化、脫硫作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團的還原。煙草植物p450酶的各種作用涉及產生各種植物代謝物，例如苯丙素、生物堿、萜類、脂質、生氰糖苷、葡糖異硫氰酸鹽和其它化學物質的宿主。近年來，人們開始了解ー些P450酶影響植物中植物代謝物的組成。例如，長期以來人們希望通過育種改變植物的所選脂肪酸的特性來改善特定植物的風味和香味；然而涉及控制這些葉子組成的水平的機理知之甚少。下調與改變脂肪酸有關的P450酶可有助于積累提供更適宜的葉子表型質量的所需脂肪酸。P450酶的功能及其在植物組成中廣泛的作用仍有待發現。例如，特定類型的P450酶發現可催化脂肪酸分解為揮發性C6-和C9-醛和醇，而主要是這些物質導致水果和蔬菜具有“新鮮翠綠”的氣味。可改變其它作為新目標的P450酶的水平，通過改變煙草葉子中的脂質組成和相關的降解代謝物來提高葉子組成的質量。葉子中的幾種這些成分受老化的影響，而老化刺激葉子質量特性的成熟。其它人也報道P450酶在改變涉及植物病原體相互作用和疾病抗性的脂肪酸中起作用。在其它例子中，已提示p450酶涉及生物堿的生物合成。降煙堿是在煙草(Nicotiana tabaceum)中發現的少量生物堿。推測它是這樣產生的p450介導的尼古丁脫甲基化，然后在N位酰化和亞硝基化,從而產生一系列N-酰基降煙堿(N-acylnonicotine)和N-亞硝基降煙堿。推測的p450脫甲基酶催化的N-脫甲基化被認為是煙草中降煙堿生物合成的主要來源。盡管認為該酶是微粒體酶，但是迄今為止未能成功地純化尼古丁脫甲基化酶，也未能分尚到有關基因。此外，有假說認為(但未證實)p450酶的活性受遺傳控制并且也強烈地受環境因素的影響。例如，當植物達到成熟階段后，認為煙草中尼古丁的脫甲基化作用大大增加。另夕卜，有假說認為(還未證實)脫甲基化基因含有當存在時能抑制RNA翻譯的轉座元件。在本發明之前，p450酶形式的多祥性、其結構和功能的不同使得對煙草p450酶的研究十分困難。此外，對P450酶的克隆至少部分由于這些膜定位的蛋白通常存在量低且經常在純化中不穩定而受阻。因此，需要在植物中鑒定P450酶和與那些p450酶相關的核酸序列。特別是，在煙草中僅有少許細胞色素P450蛋白已見報道。本文所述的發明發現了許多細胞色素P450片段，這些片段基于它們的序列同一性而對應于幾組p450種類。概述本發明針對植物p450酶。本發明還涉及來自煙草的植物p450酶。本發明也涉及其表達由こ烯和/和植物老化誘導的植物中的P450酶。本發明還涉及植物中具有酶活性的核酸序列，例如可分類為氧化酶、脫甲基酶等和其它酶，以及使用那些序列來使這些酶的表達降低和沉默和過度表達。本發明也涉及在含有較高降煙堿水平的植物而非顯示較低降煙堿水平的植物中發現的P450酶。
本發明一方面涉及以下所示的核酸序列SEQ. ID. NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295 和 297。在第2個相關的方面，根據它們在細胞色素P450基序GXRXCX (G/Α)后的第一核酸到終止密碼子的對應區域的同一性，對那些含有大于75%的核酸序列同一性的片段進行分組。代表性的核酸組和各自的種類示于表I。在第3方面，本發明涉及如以下所示的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、I12、I14、I16、I18、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296 和 298。在第4個相關的方面，根據它們在細胞色素p450基序GXRXCX (G/Α)后的第一核酸到終止密碼子的對應區域的同一性，對那些含有大于71%的核酸序列同一性的片段進行分組。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表II。在第5個方面，本發明涉及如以下所示全長基因的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296 和 298。在第6個相關的方面，根據彼此的同一性對那些含有大于85%和更高的氨基酸序列同一性的全長基因進行分組。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表III。
在第7個方面，本發明涉及如SEQ. ID. NO. 299-357所示片段的氨基酸序列。在第8個相關的方面，根據它們在第一細胞色素p450結構域UXXRXXZ到第3細胞色素結構域GXRXO的對應區域的互相同一性，對那些含有大于90%和更高的氨基酸序列同一性的片段進行分組，其中U是E或K，X是任何氨基酸，Z是R、T、S或M。代表性的氨基酸組和各自的種類示于表IV。在第9個相關的方面，p450酶在煙草植物中的減少或消除或過度表達可使用RNA病韋系統瞬時實現。評價得到的轉化或感染的植物的表型改變，包括(但不限于)使用本領域普通技術人員常規可用的技術來分析內源性P450RNA轉錄物、p450表達肽和植物代謝物的濃度。在第10個方面，本發明也涉及產生具有改變的p450酶活性水平的轉基因煙草譜 系。根據本發明，這些轉基因譜系含有有效地特定酶表達減少、沉默或増加，從而在煙草中導致表型效應的核酸序列。這種核酸序列包括SEQ. ID. NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295 和 297。在本發明非常重要的第11方面，與對照植物相比，含有本發明核酸的植物栽培品系在使用全長基因或其片段的下調能力或使用全長基因或其片段的過度表達能力上具有改變的代謝物特性。在本發明的第12方面，含有本發明核酸的植物栽培品系具有對特定外源性化學物質或植物害蟲耐受的用途，所述植物使用全長基因或其片段以更改來源于植物或植物以外的代謝物的生物合成或降解。這種核酸序列包括SEQ. ID. NO. 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295 和 297。在第13個方面，本發明涉及篩選含有與所述核酸序列具有實質核酸同一性的基因的植物，優選煙草。使用本發明有利于鑒定和選擇含有精確的或實質同一性的核酸序列的植物，其中這種植物是傳統或轉基因品種的育種程序、誘變程序或天然存在的不同植物種群的一部分。可使用核酸探針結合核酸檢測方法，包括(但不限干)核酸雜交和PCR分析，通過評價植物的核酸物質來篩選實質核酸同一性的植物。核酸探針可由對應于以下SEQID 的所述核酸序列或其片段構成SEQ ID 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295 和 297。在第14個方面，本發明涉及鑒定與所述核酸序列具有實質性氨基酸同一性的植物基因，優選煙草。可使用核酸探針結合核酸檢測方法，包括(但不限干)核酸雜交和PCR分析，通過篩選植物cDNA文庫來鑒定植物基因，包括cDNA和基因組克隆，優選煙草的cDNA和基因組克隆。核酸探針可由對應于以下SEQ ID的核酸序列或其片段構成1、3、5、7、9、
II、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、
III、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145和 147。在其它第15個方面，可使用針對部分或全部所述氨基酸序列的抗體來篩選表達肽的cDNA表達文庫。這種氨基酸序列包括SEQ ID 2、4、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148。在第16個重要的方面，本發明也涉及產生過度表達p450酶活性水平的轉基因煙草譜系。根據本發明，這些轉基因譜系包括編碼全長基因的氨基酸序列的所有核酸序列，所述基因有效地增加特定酶的表達從而導致煙草中的表型效應。這種氨基酸序列包括 SEQ. ID. 150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296 和298。也提供了含有降煙堿含量降低的煙葉(葉片和/或莖)的煙草產品。該煙草產品包括煙草(含有葉片和/或莖的煙葉)，該煙草來自含有本文所述序列或消除或抑制了編碼煙草特異性亞硝基胺的基因的植物。與用未消除或抑制編碼煙草特異性亞硝基胺的基因的煙草植物制備的煙草產品相比，消除或抑制編碼煙草特異性亞硝基胺的基因有效地降低了煙草產品中約5-10%、或者約10-20%、或者約20-30%、或者30%以上的煙草特異性亞硝基胺。本文使用的煙草產品可包括香煙、雪爺、煙絲、鼻煙、ロ嚼煙(chewing tobacco)、混合了煙草產品的產品和它們的混合物。本申請涉及I. 一種從煙草中分尚的核酸分子,其中所述核酸分子是SEQ. ID. No. : 181。2. 一種從煙草中分尚的核酸分子,其中所述核酸分子與SEQ. ID. No. : 181具有至少81%的序列同一性。3. 一種從煙草中分尚的核酸分子,其中所述核酸分子與SEQ. ID. No. : 181具有至少91%的序列同一性。
4. 一種從煙草中分離的蛋白質，其中所述蛋白質包括SEQ. ID. No. : 182。5. 一種從煙草中分離的蛋白質，其中所述蛋白質與SEQ. ID. No. :182具有至少80%的序列同一性。6. 一種從煙草中分離的蛋白質，其中所述蛋白質與SEQ. ID. No. : 182具有至少90%的序列同一'注。7. ー種轉基因植物，其中所述轉基因植物含有項1、2或3所述的核酸分子。8.如項7所述的轉基因植物，其特征在于，所述植物是煙草植物。
9. ー種產生轉基因植物的方法，其中所述方法包括以下步驟；(i)將項1、2或3所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產生植物轉化載體；(ii)用步驟(i)的所述植物轉化載體轉化所述植物；(iii)選擇用所述轉化載體轉化的植物細胞；和(iv)從所述轉化的植物細胞再生轉化植物。10.如項9所述的方法，其特征在于，所述植物的降煙堿水平降低。11.如項9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。12.如項9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。13.如項9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。14.如項9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達為雙鏈RNA分子。15.如項9所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物是煙草植物。16. 一種選擇含有核酸分子的植物的方法，其特征在于，分析所述植物中是否存在項1、2或3所述的核酸序列。17.如項16所述的選擇植物的方法，其特征在于，通過DNA雜交法分析所述植物。18.如項17所述的選擇植物的方法,其特征在于,所述DNA雜交是Southern印跡分析。19.如項17所述的選擇植物的方法,其特征在于,所述DNA雜交是Northern印跡分析。20.如項16所述的選擇植物的方法，其特征在于，通過PCR檢測法分析所述植物。21.如項16所述的方法，其特征在于，所述植物是煙草植物。22. 一種增加或降低植物中降煙堿水平的方法，其中所述方法包括以下步驟；(i)將項1、2或3所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產生植物轉化載體；(ii)用步驟(i)所述植物轉化載體轉化所述植物；(iii)選擇用所述轉化載體轉化的植物細胞；和(iv)從所述轉化的植物細胞再生轉化植物。23.如項22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。24.如項22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。25.如項22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。26.如項22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達為雙鏈RNA分子。27.如項22所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物是煙草植物。
28. ー種降煙堿水平的量降低的煙草產品，所述煙草產品含有取自項7所述植物的煙草。29.如項27所述的煙草產品，其特征在于，所述煙草產品選自卷煙、雪茄、煙斗絲、鼻煙、ロ嚼煙、混合有所述煙草產品的產品和它們的混合物。30.如項28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約5-10%。31.如項28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約10-20%。32.如項28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約20_30%。33.如項28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低超過約30%。
34. ー種降煙堿水平的量降低的煙葉，所述煙葉包括取自項7所述植物的煙葉。35.如項30所述的煙葉，其特征在于，用所述煙葉形成ー種煙草產品，而該煙草產品選自卷煙、雪茄、煙斗絲、鼻煙、ロ嚼煙、混合有所述煙草產品的產品和它們的混合物。36. ー種使用項1、2或3所述分離的核酸分子從植物中分離基因的方法。附圖簡述圖I 顯示核酸 SEQ. ID. No. : I 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 2。圖2 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 3 和氨基酸 SEQ. ID. No. :4。圖3 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 5 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 6。圖4 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 7 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 8。圖5 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 9 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 10。圖6 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 11 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 12。圖7 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 13 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 14。圖8 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 15 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 16。圖9 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 17 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 18。


圖10 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 19 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 20。
圖11 顯示核酸 SEQ. ID. No. :21 和氨基酸 SEQ. ID. No. :22。
圖12 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 23 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 24。
圖13 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 25 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 26。
圖14 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 27 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 28。
圖15 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 29 和氨基酸 SEQ. ID. No. 30。
圖16 顯示核酸 SEQ. ID. No. :31 和氨基酸 SEQ. ID. No. :32。
圖17 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 33 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 34。圖 18 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 35 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 36。
圖19 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 37 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 38。圖20 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 39 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 40。圖21 顯示核酸 SEQ. ID. No. :41 和氨基酸 SEQ. ID. No. :42。圖22 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 43 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 44。圖23 顯示核酸 SEQ. ID. No. :45 和氨基酸 SEQ. ID. No. :46。圖24 顯示核酸 SEQ. ID. No. :47 和氨基酸 SEQ. ID. No. :48。圖25 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 49 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 50。圖26 顯示核酸 SEQ. ID. No. :51 和氨基酸 SEQ. ID. No. :52。
圖27 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 53 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 54。圖28 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 55 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 56。圖29 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 57 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 58。圖30 顯示核酸 SEQ. ID. No. :59 和氨基酸 SEQ. ID. No. :60。圖31 顯示核酸 SEQ. ID. No. :61 和氨基酸 SEQ. ID. No. :62。圖32 顯示核酸 SEQ. ID. No. :63 和氨基酸 SEQ. ID. No. :64。圖33 顯示核酸 SEQ. ID. No. :65 和氨基酸 SEQ. ID. No. :66。 圖34 顯示核酸 SEQ. ID. No. :67 和氨基酸 SEQ. ID. No. :68。圖35 顯示核酸 SEQ. ID. No. :69 和氨基酸 SEQ. ID. No. :70。圖36 顯示核酸 SEQ. ID. No. :71 和氨基酸 SEQ. ID. No. :72。圖37 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 73 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 74。圖 38 顯示核酸 SEQ. ID. No. :75 和氨基酸 SEQ. ID. No. :76。圖39 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 77 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 78。圖40 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 79 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 80。圖41 顯示核酸 SEQ. ID. No. :81 和氨基酸 SEQ. ID. No. :82。圖42 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 83 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 84。圖43 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 85 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 86。圖44 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 87 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 88。圖45 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 89 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 90。圖46 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 91 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 92。圖47 顯示核酸 SEQ. ID. No. :93 和氨基酸 SEQ. ID. No. :94。圖48 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 95 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 96。圖49 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 97 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 98。圖50 顯示核酸 SEQ. ID. No. :99 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 100。圖51 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 101 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 102。圖52 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 103 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 104。圖53 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 105 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 106。圖54 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 107 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 108。圖55 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 109 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 110。圖56 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 111 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 112。圖57 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 113 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 114。圖58 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 115 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 116。圖59 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 117 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 118。圖60 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 119 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 120。圖61 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 121 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 122。圖62 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 123 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 124。圖63 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 125 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 126。圖64 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 127 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 128。圖65 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 129 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 130。
圖66 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 131 和氨基酸 SEQ. ID. No.:132。圖67 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 133 和氨基酸 SEQ. ID. No.:134。圖68 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 135 和氨基酸 SEQ. ID. No.:136。圖69 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 137 和氨基酸 SEQ. ID. No.:138。圖70 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 139 和氨基酸 SEQ. ID. No.:140。圖71 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 141 和氨基酸 SEQ. ID. No.:142。圖72 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 143 和氨基酸 SEQ. ID. No.:144。圖73 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 145 和氨基酸 SEQ. ID. No.:146。
圖74 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 147 和氨基酸 SEQ. ID. No.:148。圖75 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 149 和氨基酸 SEQ. ID. No.:150。圖76 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 151 和氨基酸 SEQ. ID. No.:152。圖77 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 153 和氨基酸 SEQ. ID. No.:154。圖78 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 155 和氨基酸 SEQ. ID. No.:156。圖79 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 157 和氨基酸 SEQ. ID. No.:158。圖80 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 159 和氨基酸 SEQ. ID. No.:160。圖81 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 161 和氨基酸 SEQ. ID. No.:162。圖82 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 163 和氨基酸 SEQ. ID. No.:164。圖83 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 165 和氨基酸 SEQ. ID. No.:166。圖84 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 167 和氨基酸 SEQ. ID. No.:168。圖85 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 169 和氨基酸 SEQ. ID. No.:170。圖86 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 171 和氨基酸 SEQ. ID. No.:172。圖87 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 173 和氨基酸 SEQ. ID. No.:174。圖88 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 175 和氨基酸 SEQ. ID. No.:176。圖89 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 177 和氨基酸 SEQ. ID. No.:178。圖90 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 179 和氨基酸 SEQ. ID. No.:180。圖91 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 181 和氨基酸 SEQ. ID. No.:182。圖92 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 183 和氨基酸 SEQ. ID. No.:184。圖93 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 185 和氨基酸 SEQ. ID. No.:186。圖94 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 187 和氨基酸 SEQ. ID. No.:188。圖95 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 189 和氨基酸 SEQ. ID. No.:190。圖96 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 191 和氨基酸 SEQ. ID. No.:192。圖97 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 193 和氨基酸 SEQ. ID. No.:194。圖98 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 195 和氨基酸 SEQ. ID. No.:196。圖99 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 197 和氨基酸 SEQ. ID. No.:198。
圖100 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 199 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 200。
圖101 顯示核酸 SEQ. ID. No. :201 和氨基酸 SEQ. ID. No. :202。
圖102 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 203 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 204。
圖103 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 205 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 206。
圖104 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 207 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 208。
圖105 顯示核酸 SEQ. ID. No. :209 和氨基酸 SEQ. ID. No. :210。
圖106 顯示核酸 SEQ. ID. No. :211 和氨基酸 SEQ. ID. No. :212。
圖107 顯示核酸 SEQ. ID. No. :213 和氨基酸 SEQ. ID. No. :214。
圖108 顯示核酸 SEQ. ID. No. :215 和氨基酸 SEQ. ID. No. :216。
圖109 顯示核酸 SEQ. ID. No. :217 和氨基酸 SEQ. ID. No. :218。
圖110 顯示核酸 SEQ. ID. No. :219 和氨基酸 SEQ. ID. No. :220。
圖111 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 221 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 222。
圖112 顯示核酸 SEQ. ID. No. :223 和氨基酸 SEQ. ID. No. :224。
圖113 顯示核酸 SEQ. ID. No. :225 和氨基酸 SEQ. ID. No. :226。
圖114 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 227 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 228。
圖115 顯示核酸 SEQ. ID. No. :229 和氨基酸 SEQ. ID. No. :230。
圖116 顯示核酸 SEQ. ID. No. :231 和氨基酸 SEQ. ID. No. :232。
圖117 顯示核酸 SEQ. ID. No. :233 和氨基酸 SEQ. ID. No. :234。
圖 118 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 235 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 236。
圖119 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 237 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 238。
圖120 顯示核酸 SEQ. ID. No. :239 和氨基酸 SEQ. ID. No. :240。
圖121 顯示核酸 SEQ. ID. No. :241 和氨基酸 SEQ. ID. No. :242。
圖122 顯示核酸 SEQ. ID. No. :243 和氨基酸 SEQ. ID. No. :244。
圖123 顯示核酸 SEQ. ID. No. :245 和氨基酸 SEQ. ID. No. :246。
圖124 顯示核酸 SEQ. ID. No. :247 和氨基酸 SEQ. ID. No. :248。
圖125 顯示核酸 SEQ. ID. No. :249 和氨基酸 SEQ. ID. No. :250。
圖126 顯示核酸 SEQ. ID. No. :251 和氨基酸 SEQ. ID. No. :252。
圖127 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 253 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 254。
圖128 顯示核酸 SEQ. ID. No. :255 和氨基酸 SEQ. ID. No. :256。
圖129 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 257 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 258。
圖130 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 259 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 260。
圖131 顯示核酸 SEQ. ID. No. :261 和氨基酸 SEQ. ID. No. :262。
圖132 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 263 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 264。
圖133 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 265 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 266。
圖134 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 267 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 268。
圖135 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 269 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 270。
圖136 顯示核酸 SEQ. ID. No. :271 和氨基酸 SEQ. ID. No. :272。
圖137 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 273 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 274。
圖138 顯示核酸 SEQ. ID. No. :275 和氨基酸 SEQ. ID. No. :276。
圖139 顯示核酸 SEQ. ID. No. :277 和氨基酸 SEQ. ID. No. :278。
圖140 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 279 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 280。
圖141 顯示核酸 SEQ. ID. No. :281 和氨基酸 SEQ. ID. No. :282。
圖142 顯示核酸 SEQ. ID. No. :283 和氨基酸 SEQ. ID. No. :284。
圖143 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 285 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 286。
圖144 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 287 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 288。
圖145 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 289 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 290。
圖146 顯示核酸 SEQ. ID. No. :291 和氨基酸 SEQ. ID. No. :292。
圖147 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 293 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 294。圖 148 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 295 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 296。
圖149 顯示核酸 SEQ. ID. No. : 297 和氨基酸 SEQ. ID. No. : 298。
圖150顯示序列組群的比較。
圖151顯示序列組的比較。
圖152A-152E顯示了全長克隆的對比。
圖153顯示通過PCR克隆細胞色素p450cDNA片段的方法。發明詳述定義除非另有定義，本文使用的所有技術和科技術語均與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的具有相同的意義。Singleton等，(1994)《微生物和分子生物學字典〉〉(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),弟ニ版，John Wiley andSons (紐約)為技術人員提供了許多關于本發明所用術語的通用字典。本文所提及的所有專利和出版物均納入本文作為參考。出于本發明的目的，下列術語如下定義。“酶活性”包括脫甲基化、羥基化、環氧化、N-氧化、磺基氧化、N-、S-和O-脫烷基化、脫硫作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團的還原。術語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的，或有義或反義的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，并且除非另有限制，該術語包括能以類似于天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有指出，特定的核酸序列包括其互補序列。術語“可操作性連接”、“可操作性結合”和“以可操作性順序”指核酸表達控制序列(例如啟動子、信號序列或轉錄因子結合位點的陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列影響對應于第二序列的核酸的轉錄和/或翻譯。當術語“重組體”用于指細胞時，它指該細胞復制異源核酸，表達所述核酸或表達異源核酸編碼的肽、異源肽或蛋白質。重組細胞可以有義或反義形式表達在細胞的天然形式(非重組)中未發現的基因或基因片段。重組細胞也可表達在細胞的天然形式中發現的基因，但其中該基因通過人工方式被改變并重新引入細胞。“結構基因”是含有編碼蛋白質、多肽或其部分的DNA片段的基因的一部分，并且不包括啟動轉錄的5’序列。或者結構基因可編碼不可翻譯的產物。結構基因可是在細胞中正常發現的基因，或者它是引入的而非在細胞或細胞位置中正常發現的基因，在這種情況下稱為“異源基因”。異源基因可全部或部分來源于本領域已知的任何來源，包括細菌基因組或附加體、真核生物的、核的或質粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學合成的DNA。結構基因可含有一種或多種修飾，這些修飾可影響生物活性或其特性、表達產物的生物活性或化學結構、表達速率或表達控制的方式。這種修飾包括(但不限干)一個或多個核苷酸的突變、插入、刪除和取代。結構基因可構成不間斷的編碼序列或可包括ー個或多個與合適的剪接接頭結合的內含子。結構基因可以是可翻譯或不可翻譯的，包括反義方向(antisenseorientation) 0結構基因可以是來源于多種來源和多種基因序列的復合物(天然存在的或合成的，其中合成的指化學合成的DNA)。“來源干”用來指從某種來源(化學和/或生物的)取得、獲得、接受得、追溯、復制或傳下的。可通過對原始來源的化學或生物學操作(包括，但不限于取代、添加、插入、刪除、提取、分離、突變和復制)產生衍生物。涉及DNA序列的術語“化學合成的”指部分核苷酸組分在體外裝配。可使用已良好建立的方法(Caruthers, ((DNA和RNA測序的方法》(Methodology of DNA and RNASecquencing), (I983) ,Weissman 編，Praeger Publishers, New York,第 I 章)實現 DNA 的手工化學合成；可使用許多市售可得的機器的ー種進行自動化學合成。
可通過以下方法進行序列的最佳對比Smith和Waterman (Adv. App I.Math. 2:482 (1981))的局部同源性算法、Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970))的同源性算法、Pearson 和 Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 85:2444 (1988))的相似性檢索方法、這些算法的計算機化的工具(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, ffis.)或通過檢驗。可從幾種來源(包括生物信息國家中心(NCBI，Bethesda, Md.)和因特網)獲得NCBI基礎局部序列比對檢索工具(BLAST) (Altschul等，1990)與序列分析程序blast、blastn、blastx、tblastn和 tblastx聯合使用。該工具可在htp://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/獲得。如何使用該程序檢測序列同一性描述于http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/blast help.html。本文使用并應用于氨基酸序列的術語“實質氨基酸同一性”或“實質氨基酸序列同一性”表示多肽的ー種特性，其中與參考組在所翻譯肽的細胞色素P450基序GXRXCX (G/A)后的第一氨基酸到終止密碼子的對應區域相比，所述肽含有至少70%的序列同一性、優選80%氨基酸序列同一性、更優選90%氨基酸序列同一性、最優選至少99-100%序列同一性的序列。本文使用并應用于核酸序列的術語“實質核酸同一性”或“實質核酸序列同一性”表示多核苷酸序列的ー種特性，其中與參考組在所翻譯肽的細胞色素P450基序GXRXCX (G/A)后的第一核酸到終止密碼子的對應區域相比，所述多核苷酸含有至少75%的序列同一性、優選81%序列同一性、更優選91%序列同一性、最優選至少99-100%序列同一性的序列。核苷酸序列實質相同的另ー個指標是兩個分子在嚴格條件下是否可雜交。嚴格條件視序列而定，在不同情況下是不同的。嚴格條件一般選擇比給定離子強度和PH時特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-20°C，通常是約10-15°C。Tm是在給定離子強度和pH時50%靶序列與匹配的探針雜交的溫度。嚴格條件通常是鹽濃度為約0. 02摩爾，pH是7，溫度是至少約60°C。例如，在標準的Southern雜交方法中，嚴格條件包括于42°C在6XSSC中初次洗滌，然后于至少約55°C (通常是約60で，更常見是約65で)在0.2父55(進行ー次或多次額外洗滌。出于本發明的目的，當核苷酸序列編碼的多肽和/或蛋白質實質性相同時，核苷酸序列也實質性相同。因此，當一條核酸序列與第二條核酸序列編碼的多肽實質性相同吋，這兩條核酸序列是實質性相同的，即使由于遺傳密碼所允許的簡并性造成它們在嚴格條件下不會雜交(對密碼子簡并性和遺傳密碼的解釋參見Darnell等，(1990)《分子生物學》(Molecular Cell Biology),果ニ版，Scientific American Books ff. H. Freeman andCompany,New York)。可通過許多本領域熟知的方式,例如蛋白質樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后基于染色通過目測來表征蛋白質純度或均一性。出于特定的目的，可能需要高分辨率并可利用HPLC或類似的裝置。本文使用的術語“載體”指將DNA片段轉移入細胞的核酸分子。載體可由于復制DNA并可在宿主細胞中獨立地復制。術語“運載體”有時可與“載體”互換使用。本文使用的術語“表達載體”指重組DNA分子，該分子含有所需的編碼序列和用于在特定宿主生物體中表達操作性相連的編碼序列所需合適的核酸序列。通常，原核生物中表達所需的核酸序列通常含有啟動子、操縱子(任選)與核糖體結合位點，以及其它序列。已知真核細胞可利用啟動子、增強子以及終止和聚腺苷酸化信號。為再生完全經遺傳工程改造的具有根的植物，可在植物細胞中插入核酸，例如通過諸如體內接種的任何技術或通過任何已知的體外組織培養技術來產生可再生為完整植物的轉化植物細胞。因此，例如可通過病原性或非病原性根瘤土壤桿菌(A. tumefacien)的體外接種來插入植物細胞。也可使用其它這樣的組織培養技木。 “植物組織”包括分化或未分化的植物組織，包括，但不限于根、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織以及培養物中細胞的各種形式，例如單細胞、原生質體、胚和愈傷組織。植物組織可在植物中(in planta)或器官中，組織或細胞培養物中。本文使用的“植物細胞”包括植物中的植物細胞和培養物中的植物細胞和原生質體。“cDNA”或“互補DNA” 一般指核苷酸序列與RNA分子互補的單鏈DNA分子。cDNA是通過逆轉錄酶在RNA模板作用形成的。獲得核酸序列的方案根據本發明，從轉化體和非轉化體煙草譜系的煙草組織中提取RNA。提取的RNA然后用于產生cDNA。然后使用兩種方案產生本發明的核酸序列。在第一方案中，從植物組織中提取富含polyA的RNA并通過逆轉錄PCR制備cDNA。然后使用簡并引物加上寡聚d(T)反向引物，用單鏈cDNA產生p450特異性PCR群。以高度保守的P450基序為基礎設計引物。特定的簡并引物的例子示于圖I。進ー步分析含有合適大小插入物的質粒的序列片段。這些插入物的大小一般是約300-800個核苷酸，視采用何種引物而定。在第二方案中，首先構建cDNA文庫。使用簡并引物加上在質粒上作為反向引物的T7引物，使用質粒中的cDNA產生p450特異的PCR群。如第一方案中一祥，進ー步分析含有合適大小插入物的質粒的序列片段。已知產生高水平降煙堿的煙草植物譜系(轉化體)和降煙堿水平檢測不到的植物譜系可用作起始材料。然后可從植物上取下葉子并用こ烯處理以激活本文所定義的p450酶活性。示于本領域已知的技術提取總RNA。然后使用如
圖153所述的寡聚d(T)引物經PCR(RT-PCR)產生cDNA片段。然后可完全地構建本文實施例所述的cDNA文庫。p450型酶的保守區域可用作簡并引物(圖75)的模板。可通過PCR使用簡并引物擴增P450特異性條帶。表示p450樣酶的區帶可通過DNA測序鑒定。可使用鑒定合適的候選對象的BLAST檢索、算法或其它工具來表征PCR片段的特性。已鑒定片段的序列信息可用于開發PCR引物。這些引物與cDNA文庫中的質粒引物聯合用于克隆全長P450基因。進行大規模Sourthern反向分析來檢測所有獲得的片段克隆以及在一些情況中全長克隆的差別表達。在本發明的這個方面，為篩選所有克隆的插入物，可用不同組織的標記的總cDNA作為探針來與克隆的DNA片段雜交，進行大規模反向Sourthern 測定。也用非放射性和放射性(P32)Northern印跡測定來鑒定克隆p450片段和全長克隆。通過衍生它們的氨基酸序列與選擇抗原性和對其它克隆獨特的肽區域來制造針對幾種全長克隆的肽特異性抗體。制造了針對偶聯于運載體蛋白的合成肽的家兔抗體。使 用這些抗體對植物組織進行Western印跡分析或其它免疫學方法。可使用病毒誘導的基因沉默技術(VIGS,Baulcombe,CurrentOpinions in PlantBiology, 1999，2:109-113)檢測以上鑒定的核酸序列。通過衍生它們的氨基酸序列與選擇可能的抗原性和對其它克隆獨特的肽區域來制造針對幾種全長克隆的肽特異性抗體。制造了針對偶聯于運載體蛋白的合成肽的家兔抗體。使用這些抗體進行Western印跡分析。在本發明的另一方面，使用干擾RNA(RNAi)技術在本發明的煙草植物中進ー步鑒定細胞色素P450酶活性。描述該技術的以下參考文獻納入本文作為參考，Smith等，Nature,2000,407:319-320 ；Fire 等，Nature，1998，391:306-311 ；ffaterhouse 等，PNAS，1998,95:13959-13964 ；Stalberg 等，Plant Molecular Biology,1993,23:671-683 ；Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology,1999,2:109-113 和 Brigneti 等,EMBOJournal, 1998，17(22) :6739_6746。可使用RNAi技術、反義技術或所述的各種其它方法來轉化植物。有幾種技術將外來遺傳物質引入植物細胞并獲得穩定地維持和表達所引入基因的植物。這種技術包括加速包裹在微粒上的遺傳物質進入細胞(授予Cornell的美國專利4，945, 050和授予DowElanco的美國專利5，141, 131)。可使用土壤桿菌技術來轉化植物，參見授予 University of Toledo 的美國專利 5，177，010 ;授予 Texas A & M 的 5，104, 310 ；Schilperoot的歐洲專利申請0131624B1、歐洲專利申請120516、159418B1、歐洲專利申請 120516、159418B1 和 176，112 ;授予 Schilperoot 美國專利 5，149，645 ;5，469，976 ；5，464，763 ;4，940，838 和 4，693，976 ；MaxPlanck 的歐洲專利申請 116718,290799,320500 ；Japan Nicotiana的歐洲專利申請604662和627752 ；Ciba Geigy的歐洲專利申請0267159、0292435和美國專利5，231，019 ;授予Calgene的美國專利5，463，174和4，762，785 ;授予Agracetus的美國專利5，004，863和5，159，135。其它轉化技術包括whiskers技術，參見，例如授予Zeneca的美國專利5，302, 523和5，464，765。電穿孔技術也用于轉化植物，參見，Boyce Thompson Institute 的 W 87/06614、Dekalb 的 5，472，869 和 5，384，253 ；PGS 的W09209696和W09321335。所有這些轉化專利和出版物引作參考。除了許多轉化植物的技術以外，與外來基因接觸的組織的類型也可變。這種組織包括，但不限于胚胎發生組織、I和II型愈傷組織、下胚軸、分生組織等。使用技術人員已知的合適的技術幾乎可轉化所有分化過程中的植物組織。
引入植物的外來遺傳物質可包含選擇標記。具體的標記可由技術人員判斷，但以下選擇標記可與任何其它可用作選擇標記的本文未列出的基因一起使用。這種選擇標記包括，但不限于編碼抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的轉座子Tn5(Aph II)的氨基糖苷磷酸轉移酶基因，以及編碼對N-膦酰甲基甘氨酸、潮霉素、氨甲喋呤、草銨膦(phosphinothricin) (bar)、咪唑啉酮、橫酸服和三唑并卩密唳除草劑，例如chlorosulfuron、溴苯腈、茅草枯等具抗性或耐受性的那些基因。除了選擇標記以外，可能需要使用報道基因。在一些例子中，可使用報道基因而無需選擇標記。報道基因是通常不存在于或不表達于受者生物體或組織中的基因。報道基因通常編碼提供ー些表型改變或酶性能的蛋白質。這種基因的例子見納入本文作為參考的K. Weising等，Ann. Rev. Genetics, 22,421 (1988)。優選的報道基因包括,但不限于葡糖醒酸酶(GUS)基因和GFP基因。一旦引入植物組織后，可通過任何本領域已知的方法來評價結構基因的表達，可 以mRNA轉錄、蛋白質合成或發生沉默基因的量來檢測表達(參見納入本文作為參考的美國專利號5，583，021)。用于體外培養植物細胞和在許多情況中，用于再生完整植物的技術是已知的(歐洲申請號88810309. 0)。本領域的技術人員已知將引入的表達復合物變為商業有用品種的方法。一旦獲得表達所需水平的p450酶的植物細胞，可使用本領域熟知的方法和技術再生植物組織和完整的植物。再生的植物可通過常規方法繁殖，引入的基因可通過常規植物育種技術轉入其它品系或品種。以下實施例描述了實施本發明的方法并且應理解為是說明性的，而非基于此來限制本發明在權利要求中所定義的范圍。
實施例實施例I植物組織的發育和こ烯處理植物牛長將植物種在盆中，在溫室中生長4周。將4周齡的幼苗移到單獨的盆中，溫室中生長2個月。生長過程中，每天給植物澆水2次，水中含有150ppm的NPK肥料。將展開的綠葉與植物分離，以進行下面所述的こ烯處理。細胞系78379由肯塔基大學發放的煙草品系78379用作植物材料的來源，它是ー種白肋(burley)煙草品系。用本領域種植煙草的標準方法培養100株植物，移植，并且用不同的數字(1-100)給它們貼注標簽。用推薦的方法施肥和進行田間管理。100株植物中的3/4將20-100%的煙堿轉化為降煙堿。100株中的1/4將小于5%的煙堿轉化為降煙堿。植株87轉化率最低(2% )，而植株21的轉化率為100%。將轉化率小于3%的植株分類為非轉化株。對植株87和21自花授粉的種子以及雜交(21 X 87和87 X 21)的種子進行遺傳差異和表型差異的研究。來自植株21自花授粉種子的植物是轉化株，99%的來自植株87自花授粉種子的植物是非轉化株。剰余1%的來自植株87自花授粉種子的植物有較低的轉化率(5-15%)。雜交種均為轉化株。細胞系4407
煙草品系4407用作植物材料來源，它是ー種白肋品系。選擇均一的并且具代表性的植物(100)并貼上標簽。在這100株植物中，97株是非轉化株，3株是轉化株。植株56的轉化率最低(I. 2%)，植株58的轉化水平最高(96%)。將這兩株植物進行自花授粉和雜交。來自植株58自花授粉種子的植株產生3 I的分離比(轉化株非轉化株=
3 I)。植株58-33和58-25分別被鑒定為純合轉化株和非轉化株植物品系。植株58-33下一代后裔中的分析確證了該植株的穩定轉化率。細朐系PBLBOlPBLBOl是由ProfiGen，Inc.研究開發的一種白肋品系，用作植物材料的來源。從PBLBOl的第一代(foundation)種子中選擇轉化株植株。乙烯處理方法 將綠色葉片從溫室生長2-3個月的植物分離，噴施O. 3 %的こ烯溶液(商品名Ethephon(Rhone-Poulenc))。將姆片經噴施的葉子懸掛在配有加濕器的養護架(curingrack)上，覆蓋塑料膜。在處理期間，用こ烯溶液定期噴施樣品葉片。こ烯處理后約24-48小時，收集葉子提取RNA。取同一組樣品的另外ー份(sup-sample)用于代謝成分分析以測定葉片代謝物的濃度以及感興趣的更具體的成分如多種生物堿的分析。例如，可如下進行生物堿分析。樣品(O. I克)和O. 5毫升2N NaOH以及含有喹啉(作為內標)和甲基叔丁基こ醚的5毫升提取液在150rpm振蕩。在配有FID檢測器的HP6890GC上分析樣品。250°C的溫度用于檢測器和上樣器(injector)。使用含有與5%苯酚和95%甲基娃酮(methyl silicon)交聯的熔融娃石的HP柱(30m_0. 32nm_lm),溫度梯度為姆分鐘10°C，110-185°C。該柱在100°C工作，用氦氣作為運載氣體，流速為I. 7cm3min_l，分流比為40 I，上樣體積為2 · I。實施例2 :分離RNA對于RNA的提取，如上所述用こ烯處理2月齡溫室植物的中等大小的葉片。O和24-48小時的樣品用于RNA提取。在有些情況下,從打頂(flower-head removal)后10天的植物取處于衰老過程的葉片樣品。這些樣品也用于提取。用Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen, Inc. , Valencia, California)按照生產商的方法分離總 RNA。用DEPC處理過的研缽和杵在液氮中將組織樣品研磨為細粉。將約100毫克磨碎的組織轉移到滅菌的I. 5毫升印pendorf管中。將樣品管置于液氮中，直到收集完所有樣品。然后，將試劑盒中提供的450 μ I RLT緩沖液加入各管中。劇烈振蕩樣品，然后在56°C溫育3分鐘。將裂解物加在放于2毫升收集管中的QIAshredder 旋轉柱上，最大速度離心2分鐘。收集流出液，加0.5體積的こ醇到澄清的裂解液中。充分混合樣品，轉移到放在2毫升收集管中的小旋轉柱中。10，OOOrpm離心樣品I分鐘。然后，吸取700 μ I RWl緩沖液到Rneasy 柱上,10，OOOrpm離心I分鐘。吸取RPE緩沖液到置于新收集管中的Rneasy 柱上，10，OOOrpm離心I分鐘。再將RPE緩沖液加到Rneasy 旋轉柱上，以最大速度離心2分鐘以使膜干燥。為了除掉殘留的こ醇，將膜置于一空收集管上，再以最大速度離心I分鐘。將Rneasy '柱轉移到一個新的I. 5毫升收集管中,將40 μ I不含RNA酶的水直接吸到Rneasy 膜上。該最終洗脫物在10，OOOrpm離心I分鐘。用變性甲醛凝膠和分光光度計分析總RNA的質量和數量。按照生產商的方法用01igotex poly A+RNA純化試劑盒(Qiagen Inc.)分離Poly (A) RNA。使用溶于最大為250 μ I體積的約200 μ g總RNA。將250 μ I OBB緩沖液和
15μ I Oligotex 懸浮液加到250 μ I總RNA中。通過吸打使這些物質徹底混合，在加熱器(heating block)上70°C保溫3分鐘。然后,將樣品置于室溫約20分鐘。最大速度離心2分鐘得到oligotex:mRNA復合物團塊。從微離心管中除去全部上清液，僅剩約50 μ I。再用OBB緩沖液處理樣品。通過渦旋將0lig0tex:mRNA團塊重新懸浮在400 μ I 0W2緩沖液中。將該混合物轉移到置于新管中的小旋轉柱上，以最大速度離心I分鐘。將旋轉柱移到新管中，再往該柱中加入400μ1 0W2緩沖液。然后，以最大速度離心該管。將旋轉柱轉移到最終的I. 5毫升微量離心管中。用60 μ I熱的(70°C)0EB緩沖液洗脫樣品。用變性甲醛凝膠和分光光度計分析Poly A產物。實施例3 :反轉錄-PCR
按照生產商的方法用SuperScript反轉錄酶(Invitrogen, Carlsbad, California)制備第一鏈 cDNA。富集了 poly A+RNA 的寡聚 dT 引物混合物由少于 5 μ g 的總 RNA、1 μ I IOmM dNTP 混合物、I μ I Oligo cKT) 12-18 (O. 5 μ g/μ I)和至多10 μ I的經DEPC處理的水組成。各樣品在65°C溫育5分鐘，然后置于冰上至少I分鐘。按順序加入下列各組分，以制備反應混合物2μ I 10Χ RT緩沖液、4 μ I 25mM MgCl2,
2μ 10. IM DTT 和 I μ I 去除 RNA 酶的重組 RNA 酶抑制劑(Rnase OUT Recombinant RNaseInhibitor)。吸取9 μ I反應混合物到各RNA/引物混合物，輕柔混合。42°C溫育2分鐘，在各管中加入I μ I Super Script II RT，42°C溫育50分鐘。在70°C終止反應15分鐘，冰上冷卻。離心收集樣品,在各管中加入I μ I RNase H, 37°C溫育20分鐘。用200pmoles正向引物(如圖75所示的變性引物，SEQ ID NO. 149-156)和IOOpmoles反向引物(18堿基的寡聚d (T)，接ー個隨機堿基)進行第二次PCR。反應條件是94°C 2分鐘；然后進行40個循環的PCR: 94°C I分鐘，45_60°C 2分鐘，720C 3分鐘；最后72°C再延伸額外的10分鐘。用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析10微升的擴增樣品。將大小正確的條帶從瓊脂糖凝膠上純化出來。實施例4 PCR片段群體的產牛按照生產商的方法將實施例3得到的PCR片段連接到pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, Wisconsin)中。用連接產物轉化JM109感受態細胞，涂在LB培養基平板上，進行藍/白選擇。選擇克隆，置于96孔板上在I. 2毫升LB培養基中37°C生長過夜。對于所有選出的集落保留凍存管。用Beckman' s Biomeck 2000小制備機器人技術(minipreprobotics)以Wizard SVMiniprep試劑盒(Promega)從平板上純化質粒。用100 μ I水洗脫質粒DNA，存貯于96孔板中。用EcoRl消化質粒，并用I %瓊脂糖凝膠分析以確證DNA的量和插入片段的大小。用CEQ 2000測序儀(Beckman, Fullerton, California)測序含有400-600bp插入片段的質粒。用BLAST捜索將測得的序列與Genbank數據庫進行比對。鑒定與P450相關的片段并進一歩分析。或者，將p450片段從差減文庫中分離出來。如上所述分析這些片段。實施例5 :⑶NA文庫的構津如下所述從こ烯處理的葉片中制備總RNA以構建cDNA文庫。首先，用改良的酸酚和氯仿提取方法從こ烯處理的煙草品系58-33葉片中提取總RNA。改良的方法是用I克組織進行研磨，隨后在5毫升加入了 5毫升苯酚(pH5. 5)和5毫升氯仿的提取緩沖液(IOOmMTris-HCl, pH 8. 5;200mM NaCl; IOmM EDTA; O. 5%SDS)中渦旋。將提取的樣品離心，保留上清。該提取步驟再重復2-3次直到上清變得澄清。加入約5毫升氯仿以除去痕量的苯酚。加入3倍體積的ETOH和1/10體積的3M NaOAc (pH5. 2)以從混合的上清組分中沉淀RNA,在-20°C存貯I小時。轉移到Corex玻璃容器中以后，在4°C 9，000RPM離心RNA組分45分鐘。離心下來的團塊用70%こ醇洗滌，4°C 9，000RPM離心5分鐘。團塊干燥以后，將RNA團塊溶解在O. 5毫升不含Rnase的水中。RNA團塊溶解在O. 5毫升不含Rnase的水中。分別用變性甲醛和分光光度計分析總RNA的質量和數量。以下述步驟用Oligo (dT)纖維素方法(Invitrogen)和微離心旋轉柱(Invitrogen)從得到的總RNA中分離poly A+RNA。約20mg總RNA進行兩次純化以獲得高質量的poly A+RNA。用變性甲醛和隨后的已知全長基因的RT-PCR(確保高質量的mRNA)來分析PolyA+RNA產物。接著，以poly A+RNA作模板用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA 合成試劑盒和 ZAP-c!)NA；!<) GigapackOi- III 金克隆試劑盒(gold cloning kit) (Stratagene, LaJolla, California)來產生cDNA文庫。其中的方法按照生產商規定的步驟來進行。用約
8μ g polyA+RNA來構建cDNA文庫。初級文庫的分析顯示約有2. 5xl06_lxl07pfu。用IPTG和X-gal進行了互補分析，以檢測文庫的質量背景，其中重組噬菌斑的表達高出背景反應100倍以上。用隨機PCR對文庫進行的更為定量的分析表明，插入的cDNA的平均大小約為1.2kb。該方法采用了如下所述的兩步法PCR。對于第一歩，反向引物的設計是基于從p450片段獲得的初級序列信息。設計的反向引物和T3 (正向)引物用于從cDNA文庫中擴增相應的基因。PCR反應物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割高分子量的相應條帶，純化、克隆并測序。在第二步中，用根據P450的5' UTR或翻譯起始區域設計的新引物作為正向引物，和反向引物一起(根據P450的3' UTR設計)用于下ー步的PCR以獲得全長p450克隆。如實施例3所述(反向引物除外)從構建的cDNA文庫中用PCR擴增獲得p450片段。用位于質粒上cDNA插入片段下游(見圖75)的T7引物作為反向引物。如實施例4所述分離、克隆和測序PCR片段。從構建的cDNA文庫中用PCR方法分離全長p450基因。用基因特異性反向引物(根據P450片段的下游序列設計)和正向引物(位于文庫質粒上的T3)來克隆全長基因。分離、克隆并測序PCR片段。如果需要，可進行第二步PCR。在第二步PCR中，用根據克隆的p450的5' UTR設計的新正向引物和根據p450的3' UTR設計的反向引物來進行下ー步的PCR反應，以獲得全長P450克隆。然后對克隆測序。實施例6 :克降片段的鑒定一反向SOUTHERN印跡分析在以上實施例中鑒定的所有p450克隆上進行非放射性大規模反向southern印跡試驗以檢測差異性表達。觀察到不同P450基因簇之間的表達水平非常不同。在高水平表達的克隆上又進行了實時檢測。非放射性southern印跡方法按如下所述進行。I)如實施例2所述用Qiagen Rnaeasy試劑盒從こ烯處理和未處理的轉化株(58-33)和非轉化株(58-25)葉片提取總RNA。
2)用生物素加尾標記從上述步驟產生的富含poly A+的RNA中衍生的單鏈cDNA來制備探針。該標記的單鏈cDNA是如實施例3所述用轉化株和非轉化株的總RNA(Invitrogen)進行RT-PCR產生的,但用了生物素化的寡聚dT作為引物(Promega)。這些用作探針與克隆的DNA雜交。3)用限制性內切酶EcoRl消化質粒DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳。將這些凝膠同時干燥并轉到兩個尼龍膜上.(BiodyneB )·^ —個膜與轉化株探針雜交，另一個膜與非轉化株探針雜交。在雜交之前將膜進行紫外線交聯(自動交聯設備，254nm, Stratagene, btratalinkerノ。或者，用位于P-GEM兩臂上的序列，T3和SP6作為引物從各質粒中PCR擴增插入片段。PCR產物在96孔的即時(Ready-to-run)瓊脂糖凝膠上電泳以進行分析。經確證的插入片段點到兩個尼龍膜上。一個膜與轉化株探針雜交，另ー個膜與非轉化株探針雜交。 4)按生產商的說明書將這些膜雜交并洗滌，其中對洗滌的嚴格性進行了改變(Enzo MaxSence 試劑盒，Enzo Diagnostics, Inc, Farmingdale, NY)。膜與雜交緩沖液(2xSSC緩沖的甲酰胺，含有去垢劑和雜交增強劑)在42°C預雜交30分鐘，與10 μ I變性的探針42°C雜交過夜。然后室溫用IX雜交洗滌緩沖液洗滌雜交膜一次，10分鐘；68°C洗滌15分鐘，4次。然后可以對雜交膜進行檢測。5)按生產商提供的檢測方法(Enzo Diagnostics, Inc.),經洗漆的膜用堿性磷酸酶標記，然后用NBT/BCIP顔色檢測方法進行檢測。用IX封閉液室溫封閉雜交膜I小時，用IX檢測試劑洗滌10分鐘(3次)，用IX預顯影反應緩沖液洗滌5分鐘(2次)，然后在顯影液中顯影直到出現點狀印跡。所有的試劑都由生產商提供(Enzo Diagnostics, Inc)。此外，還用KPL southern雜交和檢測試劑盒 按生產商的方法(KPL, Gaithersburg, Maryland)進行了大規模反向Southern試驗。實施例7 :克隆的鑒定一NORTHERN印跡分析除Southern印跡分析之外，如Northern印跡分析的實施例所述,一些膜進行了Northern雜交和檢測。如下所述，采用Northern雜交檢測煙草中差異表達的mRNA。采用隨機引發方法從克隆的p450制備探針(Megaprime DNA標記系統，AmershamBiosciences)。混合下述組分25ng變性的DNA模板；未標記的dTTP、dGTP和dCTP各4 μ I ；5ul反應緩沖液；P32標記的dATP和2ul Klenow I ；以及水，使反應體系達到50 μ I。該混合物在37°C溫育1-4小吋，然后以2ul0. 5M的EDTA終止。使用前，95°C溫育5分鐘使探針變性。從幾對煙草品系經こ烯處理和未經處理的新鮮葉片中制備RNA樣品。在有些情況下，使用了 富含 poly A+ 的 RNA。用 DEPC 水(5-10 μ I)使約 15ug 總 RNA 或 I. 8ug mRNA (RNA或mRNA提取方法如實施例5所述)的體積相同。加入等體積的上樣緩沖液(lx M0PS; 18. 5%甲醛;50%甲酰胺;4%Ficoll400;溴酚藍)和O. 55 μ I EtBr (O. 5 μ g/ μ I)。將樣品變性，準備用電泳分離RNA。將樣品用1ΧΜ0Ρ緩沖液(O. 4Μ嗎啉丙磺酸；0. IMこ酸鈉_3χ Η20; IOmM EDTA;用NaOH調pH至7. 2)在甲醛凝膠(1%瓊脂糖，Ix M0PS, O. 6M甲醛)上電泳。用毛細方法在IOXSSC 緩沖液(I. 5M NaCl; O. 15M 檸檬酸鈉)中將 RNA 轉移到 Hybond-N+ 上(Nylon, AmershamPharmaciaBiotech) 24小時。在雜交前，將有RNA樣品的膜紫外交聯(自動交聯設備，254nm, Stratagene, Stratalinker)。膜和5-10毫升預雜交緩沖液(5x SSC; 50%甲酰胺；5x Denhardt , s_溶液；1%SDS; 100g/ml熱變性的平端非同源DNA)在42°C預雜交1_4小吋。將舊的預雜交緩沖液棄去，加入新的預雜交緩沖液和探針。雜交在42°C過夜進行。用2 X SSC室溫洗滌膜15分鐘，然后用2 X SSC洗滌一次。本發明的ー個主要焦點是發現了可被こ烯處理誘導的新基因或者在煙草葉片的質量和成分中起主要作用的新基因。如下表所示，Northern印跡和反向Southern印跡可用于測定哪些基因受こ烯處理的誘導(相對于不受誘導的植株)。令人感興趣的是，在轉化株和非轉化株植株中并非所有的片段都受到相似的影響。對感興趣的細胞色素P450片段部分測序以確定它們的結構相關性。該信息被用于后續分離和鑒定感興趣的全長基因克隆。
權利要求
1.一種從煙草中分尚的核酸分子，其中所述核酸分子是SEQ. ID. No. :181。
2.一種從煙草中分尚的核酸分子，其中所述核酸分子與SEQ. ID. No. : 181具有至少81%的序列同一性。
3.一種從煙草中分尚的核酸分子，其中所述核酸分子與SEQ. ID. No. : 181具有至少91%的序列同一性。
4.一種從煙草中分離的蛋白質，其中所述蛋白質包括SEQ. ID. No. :182。
5.一種從煙草中分離的蛋白質，其中所述蛋白質與SEQ. ID. No. :182具有至少80%的序列同一'注。
6.一種從煙草中分離的蛋白質，其中所述蛋白質與SEQ. ID. No. :182具有至少90%的序列同一'注。
7.—種轉基因植物，其中所述轉基因植物含有權利要求1、2或3所述的核酸分子。
8.如權利要求7所述的轉基因植物，其特征在于，所述植物是煙草植物。
9.ー種產生轉基因植物的方法，其中所述方法包括以下步驟； (i)將權利要求1、2或3所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產生植物轉化載體； ( )用步驟(i)的所述植物轉化載體轉化所述植物； (iii)選擇用所述轉化載體轉化的植物細胞；和 (iv)從所述轉化的植物細胞再生轉化植物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物的降煙堿水平降低。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。
13.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。
14.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達為雙鏈RNA分子。
15.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物是煙草植物。
16.—種選擇含有核酸分子的植物的方法，其特征在于，分析所述植物中是否存在權利要求1、2或3所述的核酸序列。
17.如權利要求16所述的選擇植物的方法，其特征在于，通過DNA雜交法分析所述植物。
18.如權利要求17所述的選擇植物的方法,其特征在于,所述DNA雜交是Southern印跡分析。
19.如權利要求17所述的選擇植物的方法,其特征在于，所述DNA雜交是Northern印跡分析。
20.如權利要求16所述的選擇植物的方法，其特征在于，通過PCR檢測法分析所述植物。
21.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述植物是煙草植物。
22.—種增加或降低植物中降煙堿水平的方法，其中所述方法包括以下步驟； (i)將權利要求1、2或3所述的核酸分子與在所述植物中具有功能的啟動子操作性相連以產生植物轉化載體； ( )用步驟(i)所述植物轉化載體轉化所述植物；(iii)選擇用所述轉化載體轉化的植物細胞；和 (iv)從所述轉化的植物細胞再生轉化植物。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于反義方向。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于有義方向。
25.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子處于RNA干擾方向。
26.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述核酸分子表達為雙鏈RNA分子。
27.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物是煙草植物。
28.ー種降煙堿水平的量降低的煙草產品，所述煙草產品含有取自權利要求7所述植物的煙草。
29.如權利要求27所述的煙草產品，其特征在于，所述煙草產品選自卷煙、雪茄、煙斗絲、鼻煙、ロ嚼煙、混合有所述煙草產品的產品和它們的混合物。
30.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約5-10%。
31.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約10-20%。
32.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低約20-30%。
33.如權利要求28所述的煙草產品，其特征在于，所述降煙堿的水平降低超過約30%。
34.ー種降煙堿水平的量降低的煙葉，所述煙葉包括取自權利要求7所述植物的煙葉。
35.如權利要求30所述的煙葉，其特征在于，用所述煙葉形成ー種煙草產品，而該煙草產品選自卷煙、雪茄、煙斗絲、鼻煙、ロ嚼煙、混合有所述煙草產品的產品和它們的混合物。
36.ー種使用權利要求1、2或3所述分離的核酸分子從植物中分離基因的方法。
全文摘要
本發明涉及p450酶和在煙草中編碼p450酶的核酸序列，以及使用這些酶和序列來改變植物表型的方法。
文檔編號A01H5/12GK102703477SQ20121017179
公開日2012年10月3日 申請日期2004年10月15日 優先權日2003年10月16日
發明者D.徐 申請人:美國無煙煙草有限責任公司