合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用的制作方法

專利名稱：合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種合胞素基因(或稱為合胞體蛋白基因，英文名稱syncytin)在 血液系統惡性腫瘤診斷治療中的應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
血液系統惡性腫瘤是指原發于造血組織(主要是骨髓及髓外造血器官)的惡性腫 瘤。比較常見的有白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、惡性組織細胞病、骨髓轉移癌 等。腫瘤對人類的生命和健康造成了極大威脅。以白血病為例，白血病是國內10 個高發的惡性腫瘤之一，是35歲以下人群發病率和病死率最高的惡性腫瘤。白血 病具有高度異質性，其特點為白血病細胞異常增生伴分化成熟障礙。白血病的病因 與發病機制非常錢，目前還未完全清楚，病毒因素、遺傳因素、染色體及免疫功 能遺傳都與白血病的發病有關。盡管目前已經發現數以百計的基因與腫瘤發生有 關，但真正育調于血液系統惡性腫瘤診斷及治療的基因為數不多。發現新的基因對 血液系統惡性腫瘤的早期診斷和治療具有重要意義。從治療的角度看，目前認為， 細胞惡性增生和分化及凋亡受阻是惡性月中瘤發病的主要病理學基礎，所以人們試圖 用化療藥物，腫瘤細胞，用生物活性分子誘導腫瘤細胞分化等方法來控制疾病的 發展。然而，這些方法具有作用非特異性及副作用明顯等缺點，在臨床應用中遇到 了阻力。所以尋找新的治療靶點對于開倉恤液系統惡性腫瘤治療新領域具有重要價 值。
人類內源性病毒(HERV)是遠古逆轉錄病毒感染人類基因組后留下的遺跡。 HERV基因家族已發現多年,它是2500 4000萬年前侵入靈長類動物體內的逆轉錄 病毒的基因片段。以往的報道認為，哺乳動物在漫長進化過程中捕獲感染的逆轉錄 病毒部分基因片段整合入自身基因組并在體內加以表達，也稱為"寄生片段(parasitic sequences)",其組成約占人類基因組3% 8%。 HERV的確切功用尚不十分清楚,但目
3前研究認為，HERV影響基因組的有序運作及其生物功能:在分子演變中HERV基因 的某一編碼序列可翻譯出具有特異功能的蛋白風對細胞生物功能起重要作用。人類 內源性病毒在生物學意義上是一種可轉座成力、(transposableelements),兩端由長末 端重，列隔開。如果它再感染或插入一個原癌基因或抑癌基因內部，就有可能引 起癌變。多項研究表明，人類內源性病毒與腫瘤形成息息相關。EST比對分析表明， HERV-K在腦、肌肉、皮膚和胰臟等正常組織中表達，但是在睪丸、乳腺、頭頸部 等癌組織中表達更活躍，而且該內源性病毒家族常常與血小ML癥、紅細胞增多癥 以及慢性骨髓瘤白血病等有關；HERV-H主要在前列腺癌、結腸癌以及骨髓瘤、小 腸癌、膀胱癌、宮頸癌尤其是胃癌中表達；HERV-W多表達于胎盤中，最近的研究 發現合胞素也在乳腺癌中表達。合胞素是人類內源性病毒W家族(HERV-W)的囊 膜蛋白，HERV-W基因全松4kb，其中合胞素基因編碼序歹Ul616bp(見圖l),編碼538 個氮基酸多肽f教見圖2)。在已檢測的23種人體組織中，合胞素主要在胎盤中表達， 少量表達于睪丸。目前已知合胞素蛋白具有高度的融合活性，在胎盤形成中具有重 要作用，其異常表達與先兆子癇等病理妊娠有密切關系。
由于其細胞融合的活性以及特異性地高表達于合胞術茲養層中，合胞素在胎盤 形成中的作用己無爭議。但其他類似的內源性病毒家族與疾病之間的密切關系，以 及具有免疫抑制作用的肽段在合胞素中的發現，使我們有理由推測它與腫瘤發生之 間存在一定的關系。但是迄今為止未見到關于合胞素基因(mRNA及蛋白)與血液 系統惡性腫瘤關系的公開報道，關于合胞素基因在腫瘤的診斷和治療中的應用也未 見公開報道。本研究小組在最近的研究中，發現在多種類型的血液系統惡性腫瘤患 者中，均有合胞素mRNA和蛋白的表達。

發明內容
本發明的目的在于尋找能應用于血液系統惡性腫瘤診斷和治療的新基因。本研 究采用實時熒光定M轉錄聚合酶鏈式反應和免疫組織化學的方法，確定了合胞素 mRNA和蛋白在胎盤組織有較強表達，而且在白血病和淋巴瘤的各種細胞系及白血病患者外周血中有表達，但是在正常人血漿和白細胞中無表達。由此表明，合胞素
基因(mRNA和編碼蛋白產物)可作為血液系統惡性腫瘤的一個標志分子，對白血 病和淋巴瘤患者進行診斷，能反映疾病的存在或不存在、狀態、進展或治療情況；
還可以作為疾病治療的耙基因。
本發明是這樣實現的將合胞素基因應用在血液系統惡性腫瘤中的診斷、監
領!l、治療中。
本發明將合胞素基因作為標志，應用在血液系統惡性腫瘤的發生、發展、進展 或治療有效性中。
本發明將合胞素基因作為靶分子，應用在血液系統惡性腫瘤基因治療中。 本發明應用合胞素基因作為耙標來篩選和評估治療血液系統惡性腫瘤的藥物療效。
本發明通過檢測合胞素基因mRNA在正常人以及白血病和淋巴瘤患者外周血 中的表達水平，比較合胞素在正常人以及白血病和淋巴瘤患者外周血中的陽性率 和表達量的差異；并M基因工程的方法，表達了合胞素蛋白，通過分離純化表達 蛋白，利用表達蛋白免疫新西蘭大耳白兔獲得抗血清，用抗血清進行免疫組織化學 檢測了各種標本。結果發現該基因在胎盤組織中有表達，在淋巴結、肝臟等組織中 沒有表達；在白血病或淋巴瘤患者有,而正常人卻不表達。根據上述發現，該基 因可作為血液系統惡性腫瘤的標志基因，可以有以下的應用l.建立合胞素的單克 隆或多克隆抗體，禾,抗體建立白血病等血液系統惡性月中瘤的免疫診斷方法，也可 以作為血清腫瘤^^志物的檢測，作為白血病等血液系統惡性腫瘤的早期篩查或診 斷；2.利用抗合胞素蛋白的抗體，作為蛋白基因芯片的檢測位點之一，進行腫瘤蛋 白芯片檢測；3.通艦轉錄聚合酶鏈式反應等進行腫瘤診斷；4.該基因編碼產物具 有高度的細胞融合活性，在白血病復發和緩解的不同時期皿量不同，所以可作為 病情監測的指標之一并作為腫瘤藥物篩選的靶分子用于腫瘤治療藥物的篩選；5.作
5為腫瘤基因治療的目標基因，通過構建針對該基因的基因表達調控系統，進行轉基 因治療白血病等血、鄉中瘤。
本發明的優點是該基因只在血液系統惡性腫瘤患者外周血細胞膜上有陽性信 號，所以可作為血液系統惡性腫瘤特異標志，檢測結果明確，易于判斷；且該基因 產物具有高度的細胞融合活性且在白血病復發和緩解的不同時期表達量不同，用于 白血病治療藥物篩選的靶分子，具有藥物作用特異，治療耙標明確的優點。


圖l.合胞素基因全長cDNA序列，共有1616bp。 圖2.合胞素基因的蛋白產物，共538個氨基酸。
圖3.合胞素基因在白血病細iam和白血病患者中的表逸。
圖4.合胞素基因在白血病細胞系和白血病患者中的表達水平。 圖5.合胞素蛋白在正常胎盤組織中的免疫熒光實驗泰逸結果，表達信號為綠色熒光。 圖6.合胞素蛋白在正常淋巴結組織中的免疫熒光實驗表達結果，無表達信號。 圖7.合胞素蛋白在正常肝臟中的免疫熒光實驗毅結果，無敏信號。 圖8.合胞素蛋白在正常A^卜周血細鵬的免疫熒光實驗表達結果，無表達信號。 圖9.合胞素蛋白在白血病細胞系中的免疫熒光實驗表達結果，表達信號為綠色熒光。 圖10.合胞素蛋白在白血病患者外周血細肚的免疫熒光實驗毅結果，無^ii信號。
具體實施例方式
本發明將合胞素基因應用在血液系統惡性月中瘤中的診斷、監測、治療中。 本發明將合胞素基因作為標志，應用在血液系統惡性腫瘤的發生、發展、進展 或治療有效性中。
本發明將合胞素基因作為靶分子，應用在血液系統惡性腫瘤基因治療中。 本發明應用合胞素基因作為靶標來篩選和評估治療血液系統惡性腫瘤的藥物療效。
本發明可有以下實施方式 l.抗原和抗體的制備
(1) 抗原蛋白獲得
① 利用基因工程表達圖1為合胞素基因編碼序列1616bp，通過聚合酶鏈式反 應擴增獲得編碼框，插入原核親或對亥生物表達載體中，圖2為表達其蛋白編碼 的538個氨基酸多肽鏈；并按基因工程表達產物的純化體系純化蛋白質。
② 通過培養的低分化細胞等合胞素基因表達水平較高的人體來源細胞或組 織，分離純化合胞素蛋白，其純度達到85%以上。
(2) 抗體制備
抗體制備有多種途徑，以下是常見的幾種
① 細胞融合法利用制備的合胞素蛋白，免疫動物(包括老鼠、兔子、山羊 等)獲得脾臟細胞，再與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，并按常規單克隆抗體制 備技術制備單克隆抗體；
② 利用噬菌體表面展示技術，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區并表達成基因工 程單克隆抗體；
③ 利用基因工程重組合胞素蛋白作免疫原，通過免疫動物(如家兔)，收集血 清，從中分離純化出抗人合胞素蛋白多克隆抗體；
2.通過檢測血液或組織中合胞素基因的核酸7jC平，在血液系統惡性腫瘤診斷、監測、 治療中的應用-
適用于這一目的的方法包括(但不限于)定量逆轉錄聚合S每鏈式反應(RT-PCR)、 競爭性逆轉錄聚合酶鏈式反應、實時逆轉錄聚合酶鏈式反應、差異顯^I轉錄聚合 Kl連式反應、Northern印跡法(核糖核酸印跡法)、原位雜交、核酸陣列(包括微珠 陣列)、差異顯示技術(DD-PCR)、基因表達的連續分析(SAGE)、代表性差異分析法(RDA)、消減雜交和總基因表達分析(TOGA)、狹縫印記法、核酸酶保護分析等， 禾擁這些方法檢測合胞素基因是否表達及表達水平，表達水平可為鄉樹表達水平， 或經標準化的表達水平或相對水平。基因表達水平越高者患血液系統惡性腫瘤的可 能性越大，反之則低。并且可通過對不同狀態樣品所表達蛋白質的動態差異分析， 可作為判斷患者臨床結果的預后標志，結合其它臨床結果標準(諸如癥狀緩解/ 未纟激 、進展時間、完全反應、部分反應、穩定或進展)協助選取治療方案。
3. 通過檢測血液或組織中合胞素基因的蛋白質產物，在血液系統惡性腫瘤診斷、監
測、治療中的應用
適用于這一目的的方法包括(但不限于)用制備的抗體(多抗或單抗)進行免
疫分析，例如ELISA (酶聯免疫吸附實驗)，RIA (方婦才免疫分析)、FACS (熒光活 化細胞分揀器)、Western印跡法、斑點印跡法、用免疫組織化學方法或基于抗體的 方M成像、蛋白質分析、高通量蛋白質測序、蛋白芯片、二維SDS—PAGE凝膠電 泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)禾口質譜法(mass spectrometry jMS)等。 此外，還可以用合胞素蛋白的生物學活性(如蛋白質與DNA結合活性)來測量合 胞素基因的蛋白表ifeK平。
同樣，蛋白表ifeR平越高者患血液系統惡性腫瘤的可能性越大，反之則低。并 且可通，不同狀態樣品所表達蛋白質的動態差異分析，可作為判斷患者臨床結果 的預后標志，結合其它臨床結果標準(諸如癥狀緩解/未緩解、進展時間、完全反 應、部分反應、穩定或進展)協助選取治療方案。
4. 應用合胞素基因作為耙標來篩選和i啊古治療血液系統惡性月中瘤的藥物療效
以合胞素蛋白為靶分子，與藥物進行結合反應，然后用核磁共振(NMR)及其 它測試方法檢測結合分子，并通過相應方法測定藥物分子結構，從而確定候選藥物 分子，并進行后續的篩選工作。
5. 應用合胞素基因作為靶分子的血液系統惡性腫瘤基因治療基因
8a)反義基因治療構建反義表達體系，通過導入反義序歹蜮編碼反義序列的表達 載體，矯正這難因的異常表達根據5驢互補酉瀏的原理，人工合成或生物體內合
成一段寡聚脫氧核糖核酸與合胞素基因中正義鏈或mRNA某片段特異互補，封閉 或阻斷合胞素基因的表達，使惡變的細胞逆轉，進入分化或成熟階段，或使細胞凋 亡、逆轉耐藥。
(2) 通過RNA干擾(RNAi)來抑制合胞素基因，RNA干擾屬于轉錄后基因沉 默(PTGS)技術，可特異性消除耙基因的活性。
(3) 以合胞素基因產物為靶分子設計的基因治療比如導入某基因，其產物對 合胞素基因的表達有抑制作用，或對合胞素蛋白活性有抑制作用等途^J行基因治 療。
(4) 特異性識別合胞素基因編碼的多肽的抗體，減低或抑制疾病基因的活性。 本發明的適當抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化 抗體、單鏈抗體、Fab片段或由Fab表達文庫產生的片段。
(5) 核酸核酶基因治療核酸核酶是一類有催化活性的RNA分子，可序列特異 地與靶RNA分子酉SX寸，'對底物進fi^刀割，鵬mRNA的降解，從而使其失去生物 學功能。禾,這種特性，人工設計合成具有催化活性的核酶，針對合胞素的RNA 序列進行剪切，使其失活，從而抑制其，。
6.結合實施例對本發明做進一步地說明，但本發明并不受限于下述實施例
(1)通過熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應檢測外周血合胞素基因相對表達水平，診
斷和監測血液系統惡性腫瘤
①對照為健康的志愿獻血者，白血病或淋巴瘤等血液系統惡性腫瘤患者的血液和 骨髓標本由云南省第一人民醫院、昆明醫學院第一和第二附屬醫院提供。疾病的診 斷的類型根據骨髓涂片、免疫組化染色、流式細胞儀測定細胞因子并結合患者臨床 表現等判定。 1
9② RNA提取根據TRI Reagent -BD (Molecular Research Center Inc.)說明書要求提 取患者或正常人全血總RNA。 RNA的純度經iy。瓊脂糖凝膠電泳檢領U后用比色法 測定其濃度，
③ .實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應根據產品說明書a One Step SYBR 逆轉錄 聚合酶f連式反應Kit (TaKaRaBiotechnology Co.， Ltd.)要求進行定量。樣品中殘留的 基因組DNA用DNase I (Fermentas Life Sciences,存EN0521)處理去除。設三個平行 反應，1個含有經DNase I-處理的RNA模板和逆轉錄酶，另外兩個(對照) 一個不 加RNA模板，另一個不加無逆轉錄酶。合胞素(gi.21326140)和GADPH(gU82860) 的引物分別為
合胞素F: 5'-AGGAGCTTCGAAACACTGGA-3，
合胞素R: 5,-GTGAGCTAAGTTGCAAGCCC誦3,
GADPHF: 5，-CGGGAAGCTTGTGATCAATGG-3，
GADPHR: 5，-GGCAGTGATGGCATGGACTG-3， 合胞素的預期PCR產物大小為494bp， GADPH產物的理論大小為358bp.反應^f牛 為42。C，15射中;95。C2 ^H中，然后95 °C 5秒，60 °C 34 seconds擴增35個循 環。擴增產物的特異性通過逆轉錄聚合藤連式反應的熔解曲線分析和瓊脂糖凝膠電 泳來驗i正。電泳檢測的部分結果見圖3。
④ 合胞素基因轉錄產物的相對表ifcK平
采用2—Ma方法對合胞素mRNA水平(與GADPH mRNA水平相比)進行相 對定量.GADPH為穩定表達的看家基因，可認為所有細胞中的GADPH轉錄水平 相似。圖4顯示了不同患者合胞素mRNA相對7K平。
(2)通過熒光定 轉錄聚合酶鏈式反應檢測合胞素蛋白的表達，診斷和監測血液系 統惡性腫瘤
①制備合胞素蛋白特異性多克隆抗體
提取人細胞的基因鄉5DNA，擴增合胞素片段并插入原核表達載體pET-30a，經測序證實序列正確后轉化大腸桿飾L21細胞，^QPTG誘導下可觀察到合胞素的表達， 將誘導后菌液進行SDS—PAGE分析，切取分子量約為43kDa的高豐度蛋白條帶，研 磨后與等體積完全福氏佐劑充分混合、乳化，背部皮下多點注射新西蘭大耳白兔誘 導產生免疫應答，4周后，相同量抗原與不完全福氏佐齊梳分混合、乳化，再次皮 下多點注射；4周后，重復第二次免疫；末次免疫一周后耳,脈采血，收集血清， -20'C保存。并制備兔抗人合胞素蛋白多克隆抗體。鄉還LISA測定抗體滴度大于1: 10000。
② 免疫組織化學檢測不同組織合胞素蛋白的表達
檢測切片常規脫蠟(二甲苯、梯度乙斷水化后,2。/。BSA室溫封閉l小時，滴加合 胞素特異性多克隆抗體(1: 200稀釋)，置于濕盒內4。C過夜。加入l: 50稀釋的FITC 標記羊抗兔二抗，置于濕盒內37。C孵育45—60分鐘后50%緩沖甘油封片。共聚焦顯 微徵ZeissLSM510META)下觀察熒光信號并拍照。結果見圖5、圖6及圖7，僅正常 胎盤組織可以觀察至腫寺異性熒光信號，正常淋巴結和肝臟都沒有熒光信號，結果和 文獻報道一致，且證實抗體具有很好的特異性。
③ 間接免疫熒光法檢測外周血合胞素蛋白的表達
用密度梯度離心法分離患者及正常對照外周血單個核細胞(PBMC)。重懸細胞 后用細胞甩片機制備細胞涂片，把細胞片^A冷丙酮中固定20分鐘，2% BSA室溫 封閉30，，滴加30pL合胞素特異性多克隆抗體(1: 200稀釋)，置于濕盒內4。C過 夜。滴加l: 50稀釋的FITC標記羊抗兔二抗，置于濕盒內37。C孵育45—60分鐘后50 ^緩沖甘油封片。激光共聚焦顯微徵ZeissLSM510META)下觀察熒光信號并拍照。 圖8、圖9、圖10顯示了白血病細胞系以及部分患者外周血合胞素蛋白的表達情況。 (3)應用合胞素基因作為靶分子的血液系統惡性腫瘤基因治療 ①構建重組Syncytin-shRNA表達載體
首先是針對合胞素基因設計siRNA設計有效針對耙基因的特異性雙鏈小RNA。 根據Syncytin基因cDNA序列，利用美國Ambion公司在線shRNA設計軟件設計針對
iiSyncytin基因shRNA序列，纟5Blast分析與合胞素基因有10()n/。同源性并與其他基因無 交叉，才確定為合胞素基因的特異性序歹lj。與PsilencercM-V4.1載體連接后并經測 序證實序列正確后進行后續實驗。 ②建立短暫性和穩定性下調syncytin基因表達的細胞系
提取高純度載體DNA，當細胞培養至最佳狀態時，用Lipofectamine2000轉染細 脫加入G418篩選至少兩周，擴大培養G418抗性細胞克隆，提取細胞RNA和蛋白 質，檢測合胞素mRNA和蛋白質表;feK平。
(D利用建立的穩定轉染細胞株，通過干擾前后腫瘤細胞生物學特性的改變(如對增 殖和凋亡水平的影響等)，比較shRNA干擾合胞素表達后對腫瘤細胞的凋亡、增殖 活性等細胞生物學特性的變化。結果表明shRNA干擾合胞素,后腫瘤細胞相， 因包括p53、 Bel—2、 Bel—1、 caspase—3和caspase—9表達水平下降；同時，shRNA 干擾合胞素表達后腫瘤細IM化療藥物敏感性的增加。 (4)應用合胞素基因作為耙標來篩選和評估治療血液系統惡性腫瘤的藥物療效
選擇高表達合胞素的白血病或淋巴瘤細胞系，加入不同濃度的藥物，在不同時 間點檢測合胞素基因的轉錄產物和蛋白產物的魏水平，可根據合胞素基因表達產 物是否減低以及降低的程度評估該藥物對血液系統惡性腫瘤治療的效果。
權利要求
1、合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用，其特征是，合胞素基因在血液系統惡性腫瘤診斷、監測、治療中的應用。
2、 根據權利要求1所述的合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用，其特征是， 將合胞素基因作為標志，在血液系統惡性腫瘤的發生、發展、進展或治療有效性中應 用。
3、 根據權利要求1所述的合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用，其特征是， 在血液系統惡性腫瘤基因治療中，應用合胞素基因作為耙分子。
4、 根據權利要求1所述的中合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用，其特征 是，應用合胞素基因作為耙標來篩選和評估治療血液系統惡性腫瘤的藥物療效。
全文摘要
合胞素基因在血液系統惡性腫瘤中的應用，本發明將合胞素基因應用在血液系統惡性腫瘤的診斷、監測、治療中；本發明的優點是該基因只在血液系統惡性腫瘤患者外周血細胞膜上有陽性信號，所以可作為血液系統惡性腫瘤特異標志，檢測結果明確，易于判斷；且該基因產物具有高度的細胞融合活性且在白血病復發和緩解的不同時期表達量不同，用于白血病治療藥物篩選的靶分子，具有藥物作用特異，治療靶標明確的顯著優點。
文檔編號A61P35/00GK101575646SQ20091009412
公開日2009年11月11日 申請日期2009年2月24日 優先權日2009年2月24日
發明者鹥 孫, 歐陽東云, 鄭永唐 申請人:中國科學院昆明動物研究所