專利名稱：一株防治煙草角斑病的生防菌株pa-2的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株生防菌株PA-2,該菌株為銅綠假單胞桿菌iPsmdomoimsaeruginosa),能夠防治煙草角斑病,屬于植物保護技術領域。
背景技術：
煙草角斑病是由假單胞桿菌屬丁香假單胞菌煙草致病變種\_Pseudomonassyingae pv. tabaci (Wolf et Foster.)]侵染引起的,是危害嚴重的、具有毀滅性的煙草細菌性病害之一。目前煙草角斑病已遍布亞洲、非洲、歐洲及南北美洲各地的主產煙區，在環境條件有利于病害發生的情況下可造成煙草絕產。2003 2007年,我國煙草角斑病年發病面積約3. 33萬hm2 ,每年造成的產值損失2643 5782萬元。近年，北方煙區角斑病再度流行，并成為煙草的主要病害之一(李發新、胡玉梅等編寫的《濟源市王屋煙區煙草角斑病發生原因及防控對策》，中國植保導刊，2008，p31 32)。目前采用輪作等農業技術預防煙草角斑病的發生有相當的難度；而長期大量使用化學藥劑，病原菌已產生抗藥性，同時對煙葉出口和卷煙安全性帶來不利影響；而且國內外尚未培育出抗角斑病的品種。因此，為經濟有效防治煙草角斑病，生物防治成為了最直接的途徑，而篩選穩定而高效的有益微生物是保證生物防治獲得成功的條件之一。近年來，國內外廣泛利用有益微生物及其代謝產物來抑制病原菌的生存和活動，使這一防治策略發展迅速，其中生防細菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用，無論是自然發生的生物防治現象還是人們用于生物防治的生物類型中，細菌的作用是非常明顯的。生防細菌用來防治植物病害其主要優勢在于1)細菌的種類和數量眾多，在植物根際和地上部大量存在；2)細菌對病原菌的作用方式較廣，可以通過競爭、生防和寄生、誘導植物產生抗性等方式對病原菌產生影響；3)具有驚人的繁殖速度；4)許多細菌存在于植物根際和地上部，對植物的生態比較適應；5)細菌大多可以人工培養,便于控制,在實踐中易于操作；6)有些細菌不僅能防治病害而且可以增加作物的產量(程亮、游春平等編寫的《生防細菌的研究進展》，江西農業大學學報，2003，p732 737)。綜上所述，開發新的、更為高效和安全的菌株控制煙草角斑病的發生是提高煙草生產總量的需要，同時更是農業安全可持續發展的需要，符合社會發展需求。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中沒有對煙草角斑病有較好的生防菌株的現狀，提供一株防治煙草角斑病的單一生防菌株。本發明的另一目的是提供該菌株的應用方法。 本發明所述的假單胞桿菌，其特征在于經鑒定該菌株(PA-2)為銅綠假單胞桿菌iPseudomonas aerwgifliosa),菌株已于2012年3月27日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No. 5937。所述的生防菌PA-2(保藏號為CGMCC No. 5937)菌液，通過如下方法制備將權利要求I所述的菌種保藏號為CGMCC No. 5937的生防菌株PA-2在優化培養液中28°C 180r/min振蕩培養24h，然后用無菌水進行6倍稀釋，配成濃度約為I X IO9-I X 1010CFU/mL的菌液。上述生防菌液防治煙草角斑病的方法為PA_2菌液在煙草團棵期噴施于煙草葉片上，每隔5d噴施一次,共噴施三次。有益效果
本發明是專門針對煙草角斑病開發的生防菌。由于是生防菌，完全沒有因為化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因此有利于煙草業的無公害生產，農民可以不用或減少其他化學農藥的用量，減少了農民的開支。大田實驗表明該菌液能顯著降低煙草角斑病的發生。培養24h的該菌液可以稀釋6倍后在煙草團棵期進行噴施處理，每隔5d噴施一次，共噴施三次。不遇暴風雨天氣的情況下防效可以達到58. 03%，經發酵條件優化后防效可以達到69. 77%。生物材料保藏信息
防治煙草角斑病的生防菌株PA-2,為銅綠假單胞桿菌iPseudomonas aeruginosa)，子2012年3月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJi址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院研究所，菌種保藏號為CGMCC No. 5937。
具體實施例方式實施例I能夠防治煙草角斑病的生防細菌-銅綠假單胞桿菌iPseudomonasaeruginosa) PA-2 的篩選
具體步驟如下
稗草中細菌的分離從稗草植株上用滅菌剪刀剪下約2 g放置于滅過菌的研缽中，加ImL無菌水研磨成勻漿，將勻漿10倍系列稀釋至10_ 7倍，將10_4至10_ 7稀釋液各吸取100UL涂于NA平板上，每濃度設3次重復，28°C培養疒3 d。挑取不同類型的菌落，在NA平板上劃線純化培養后，挑取單個菌落移入PDA斜面編號保存備用；也可編號保存于40%甘油中置-80°C冰箱中保存。細菌發酵液的制備分別挑取煙草角斑病菌和從稗草中分離到的細菌培養物分別放入裝50 mL NB培養液的250 mL三角瓶中，將三角瓶放置到恒溫振蕩培養箱中28°C下180r/min震蕩培養24h，并用無菌水配制成濃度為3 X IO8 cfu/mL的菌懸液備用。生防細菌的篩選取5 mL病原菌發酵液，加入到冷卻至55°C的100 mL滅菌NA培養基中，混勻，倒入滅菌的培養皿中，冷卻成平板。用移液槍吸取70 UL待測細菌菌懸液在冷卻好的平板上劃線，以未接菌的等量NB培養液為空白對照，實驗設3次重復。28°C培養2 3d后觀察，具有一定抑菌帶寬度的即為所需要的菌株。經篩選，得到抑菌直徑最大的菌株PA-2，抑菌帶寬為15.3 _，經鑒定為銅綠假單胞桿菌iPseudomonas aeruginosa)。該菌株已于2012年3月27日保藏在“中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No. 5937。
菌株PA-2 (保藏號CGMCC No. 5937)的形態特征是在NA培養基上菌株生長良好，單菌落形態為圓形或近圓形，扁平狀且周圍不規則，中等大小，表面光滑，半透明，產生藍綠色色素，周圍產生藍綠色暈圈，且隨著培養時間的延長，培養基的藍綠色變深，菌落表面呈現黏稠狀。革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，不產生芽孢。經NB培養液震蕩培養，菌液呈綠色。菌株PA-2 (保藏號CGMCC No. 5937)部分生理生化特征是革蘭氏染色為陰性，最適生長溫度28°C，在4°C下不能生長，41°C生長良好。能夠利用葡萄糖、檸檬酸鹽，不能利用蔗糖，能夠產生膿青素，具有運動性。生理生化實驗結果詳見表I.
權利要求
1.一株用于防治煙草角斑病的生防菌株PA-2,為銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa),該菌株已于2012年3月27日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No. 5937。
2.權利要求I所述的菌種保藏號為CGMCCNo. 5937的生防菌株PA-2在制備防治煙草角斑病的生防菌液中的應用。
3.根據權利要求2所述的生防菌液，其特征在于通過如下方法制備將權利要求I所述的菌種保藏號為CGMCC No. 5937的生防菌株PA-2在優化后的NB培養液和最佳培養條件下進行培養，然后用無菌水進行6倍稀釋，配成濃度約為I X IO9-I X 1010CFU/mL的菌液。
4.權利要求3所述的優化后的NB培養液組分為氮源1%(牛肉膏蛋白胨=3:5)，葡萄糖0. 3%, NaCl 0. 5%, KNO3 0. 3% ;最佳培養條件為發酵溫度28°C，培養基pH 7. 0 7. 5，接種量4%，裝液量為250 mL三角瓶中裝液50 mL, 180 r/min震蕩培養24h。
全文摘要
本發明屬于植物保護技術領域，公開了一株防治煙草角斑病的生防菌株PA-2，為銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，菌株已于2012年3月27日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.5937。用所述的生防菌株PA-2制備的生防菌液總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。所述的生防菌液可在防治煙草角斑病方面應用，是一株極具研究開發價值的菌株。
文檔編號A01N63/02GK102703353SQ20121018552
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月7日 優先權日2012年6月7日
發明者孫劍萍, 文景芝, 楊曉敏 申請人:東北農業大學