專利名稱：黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物育種輔助技術，特別是ー種黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記及其應用。
背景技術：
黃瓜(Cucumis sativus L.)生產中,特別是設施栽培過程中,有時會有苦味果實產生，導致收益損失(Rehm et al.，1957 ;顧興芳等，2000 ;Kano et al.，2002)。瓜類植物的苦味是由一類稱為葫蘆素(Cucurbitacins)的物質引起(Rice et al. , 1981 ；Balkema etal.，2003)。葫蘆素屬于葫蘆烷型四環三萜化合物，對大多數生物體有毒(Smyth et al.，2002)。果實苦味是影響黃瓜生產的問題之一。荷蘭黃瓜育種家早在1959已經開始無苦味黃瓜的選育工作，并育成相應的品種，這些品種的營養器官和果實均無苦味(AndeweG andBruyn, 1959)。研究導致黃瓜果實苦味發生的基因的分子標記和遺傳定位，對于利用分子標記輔助選擇(Marker Assisted Selection, MAS)技術培育無苦味黃瓜具有重要意義。已報道的控制黃瓜果實苦味的兩個基因是Bt和Bt-2 (Barham, 1953 ；ffalters,2001)。本實驗室保存的黃瓜材料PI183967 (基因型為BiBiBtBt)含有Bt基因。前人關于黃瓜果實苦味的研究多集中于遺傳規律、基因連鎖、環境影響、品種選育等方面。已有研究表明，Bt和Bt-2基因均符合單基因顯性遺傳，符合質量性狀遺傳的特點(Barham，1953 ；InGGamer and Deponti, 1981 ;Walters et al.,2001)。Bt 基因與黃瓜雌性基因 F 不存在連鎖(Cowen and Helsel，1983 ;顧興芳等，2005)。Bt_2基因與果色一致基因U、暗色果皮基因D、小刺基因ss連鎖(Wehner and Liu, 1998 ；ffalters et al.，2001)。栽培條件影響黃瓜苦味的發生(Kano et al.，2003)，當土壌中的氮素過多或不足、有機肥缺乏、溫度過低或過高、日光照射不足、營養不良、上壤干旱缺水、病蟲害以及植株衰弱多病等條件下，都可誘發葫蘆素的形成和積累，從而形成苦味果實。對于黃瓜果實苦味決定基因Bt分子水平的研究主要是由本實驗室開展進行的。我們從分子水平對果實苦味基因進行了研究并獲得了與Bt基因連鎖的兩個顯性AFLP標記E23M66-101和E25M65-213。這兩個標記與Bt基因的遺傳距離分別為5cM和4cM，并且位于Bt基因的兩側(顧興芳等，2006)。2011年以果實無苦味的黃瓜純合自交系新泰密刺(btbt)和果實有苦味46GBt (BtBt)為親本構建的含有184個單株的F2群體為試材，對其進行SSR標記遺傳連鎖分析，構建了 Bt基因的SSR連鎖群。與Bt基因最近的兩側標記為SSR10795和SSR07081，遺傳距離分別為O. 8cM和2. 5cM (張圣平等，2011)。但是上述標記還存在連鎖距離相對較遠，且標記的檢測準確率相對較低的問題，在進行無苦味黃瓜育種篩選中的選擇效率相對較低。黃瓜果實苦味的遺傳比較復雜，受到營養體苦味基因Bi的影響，隱性bi基因與Bt基因存在互作效應(Gu et al.，2007)。但在純合Bi基因背景下，Bt基因是獨立遺傳的(Barham, 1953 ；ffalters and Wehner, 1998 ；Gu et al.，2007)。為了排除黃瓜營養體苦味基因對果實苦味基因的互作影響，本發明中利用營養體苦味基因純合的基因型，進行了果實苦味Bt基因的SSR分子標記及遺傳定位研究。目前檢測黃瓜苦味的方法多為感觀品嘗和化學檢測，化學檢測雖可檢測大批材料但較為繁瑣，其結果也不夠準確；感觀品嘗僅適于少量材料的檢測，并且無法進行精確定級(顧興芳等，2004)，所以急需建立ー套快速準確鑒定苦味的方法，為培育無苦味黃瓜提供理論依據。分子標記輔助選擇(MAS)技木通過找到與苦味基因緊密連鎖的分子標記可在苗期或直接用種子進行鑒定，簡エ節本，大大縮短育種進程。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術不足，提供了與黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記，并提供了其在選擇無苦味黃瓜種質資源上的應用，采用本發明獲得的SSR標記，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行果實苦味或果實無苦味的篩選，具有高效、限制少、準確的優點，為黃瓜育種選擇無苦味材料提高了選擇效率和準確性。
黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記，序列如下SSR2I558-F/SSR2I558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC (SeqID No. 5和SEQ ID No. 6)，其擴增的特征條帶如Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示。其中Seq ID No. I所示175個核苷酸的片段與果實苦味基因Bt連鎖，Seq ID No. 2所示192個核苷酸的片段與果實不苦基因bt連鎖。SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA (SeqID No. 7和SEQ ID No. 8)，其擴增的特征條帶如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示。其中Seq ID No. 3所示的127個核苷酸的片段與果實苦味基因Bt連鎖，Seq ID No. 4所示108個核苷酸的片段與果實不苦基因bt連鎖； 上述SSR標記在篩選含有無果實苦味基因Bt的黃瓜種質資源中的應用，其步驟如下(I)采用上述SSR標記為引物對黃瓜品種待選材料的基因組DNA分別進行PCR擴
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>曰，(2)對擴增結果進行凝膠電泳檢測，(3)從凝膠電泳檢測的結果中選出沒有出現所述果實苦味特征條帶的材料。所述PCR擴增的體系Green Master Mix 5 μ L, 15ng DNA,正向、反向引物各30nG，其余以ddH20補足至IOyL;PCR擴增的程序為94°C預變性4min ;94°C變性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸30s 35個循環；72°C保溫5min。所述凝膠電泳檢測指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于160V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。本發明以果實有苦味的野生黃瓜PI183967 (Cucumis sativus var. hardwickii)和果實無苦味的黃瓜931純合新泰密刺選系(btbt)為親本構建的含有189個單株的F2群體為試材，對其進行SSR標記遺傳連鎖分析(圖1，2)，構建Bt基因的SSR連鎖群(圖3)。該連鎖群中與Bt基因最近的兩側的連鎖標記之ー為SSR21558，遺傳距離為O. 5cM ;另ー標記SSR20054，遺傳距離為I. OcM0經不同遺傳背景材料驗證，標記SSR21558檢測結果與田間表現型相比驗證的準確率為為95%，SSR20054標記的準確率為75%，使用兩標記相互印證進行驗證的準確率可達95%。與Bt基因緊密連鎖的標記SSR21558和SSR20054可用于對黃瓜品種候選材料快速篩選，特別是可以對黃瓜苗期的材料或種子直接進行分子鑒定從而選出無果實苦味基因的黃瓜材料，不需要等到黃瓜開花結果時對其果實進行品嘗來判斷。分子鑒定比人工品嘗的結果更準確，不受其它因素干擾，而且省エ省時，不受季節影響，大大地縮短了育種周期。為了達到本發明上述的進行黃瓜果實無苦味材料的篩選目的，兩個SSR標記可單獨用于候選材料的篩選。本發明進一歩提供了兩個SSR標記相互印證的篩選方法，提高了候選材料的選擇準確性。
圖I. SSR21558對黃瓜親本材料及F2群體隨機單株的檢測結果 P1 :PI183967(苦);P2:931(不苦)；圖2. SSR20054對對黃瓜親本材料及F2群體隨機單株的檢測結果P1 :PI 183967(苦);P2:931(不苦)；圖3.黃瓜Bt基因F2群體連鎖圖
具體實施例方式I.材料與方法I. I試驗材料供試黃瓜材料為PI183967 (P1),Cucumis sativus var. hardwickii,野生黃瓜，由美國威斯康星大學Jack staub教授饋贈，為現有已知品種，在1998年劉世琦等主編的《蔬菜栽培學》一書中也有記載，本實驗室有保存，保證自申請日起二十年內向公眾發放用于驗證實驗。PI183967表現型為營養體苦且果實苦，含營養體苦味基因Bi和果實苦味基因Bt，基因型為BiBiBtBt。果實卵圓形、深緑色果皮、無光澤、黑刺、刺瘤稀，已完成60X重測序；931 (P2):純合新泰密刺選系，從新泰密刺中經多代自交純化育成，來自中國農業科學院蔬菜花卉研究所黃瓜課題組，為現有已知品種，張鳳鳴等在《北方園藝》1989年第7期發表的文章《保護地優良品種——新泰密刺黃瓜簡介》一文中也有記載，保證自申請日起二十年內向公眾發放用于驗證實驗。931表現型為營養體苦但果實不苦，含營養體苦味基因Bi和果實無苦味基因bt，基因型為BiBibtbt。果皮深緑色、無光澤、白刺、刺瘤密。已完成IOX重測序。以PI183967為母本，931為父本雜交，配制F1,自交獲得F2群體。SSR引物來自國際黃瓜基因組計劃(CUGI)，共2112對(Ren et al.，2009)。詳細結果可以參見Ren等在PloS 0ne2009年第4期在線發表的文章《An inteGrated Geneticand cytoGenetic map of the cucumber Genome》。PCR 實驗使用 ShanGhai PromeGa 公 ロJ的GoTaq Green Master Mix ;凝膠電泳使用盈信陽光公司的40%非變性聚丙烯酰胺,將其稀釋至6%后使用。實施例I.黃瓜果實苦味基因Bt連鎖SSR標記的篩選步驟I.黃瓜果實苦味鑒定供試黃瓜材料于2010年3月14日播種育苗，4月16日定植于中國農業科學院蔬菜花卉所春季溫室。種植親本和F1各30株(3次重復，每重復10株)，F2189株。苗期常規管理。定植后，前期夜溫控制在12°C以下，后期晝溫高于32°C，整個生長期控水，并增施氮月巴，誘使苦味基因充分表達。參照顧興芳等(2004)的方法，采用ロ嘗的方法鑒定果實苦味。從根瓜開始直至試驗結束(I個生長季節)，若每株有4次果實出現苦味，該株即定為果實苦，不再品嘗，否則需繼續品嘗，未出現苦味的單株，需品嘗植株上所有果實，一般每株品嘗7條瓜以上。每株每次由3位對苦味敏感者同時品嘗，以確保試驗結果的準確性。結果顯示在189株F2代群體中，存在果實苦味的有126株，不苦的有57株，經卡方檢測，符合3:1的Mendel遺傳分離比例(X2e=3. 76<X20.05.1 = 3 . 84)，說明黃瓜果實苦味是由單基因(Bt)控制，苦味相對不苦為顯性，該性狀可以按照質量性狀進行分析。這與以往的研究結果相同。步驟2. DNA提取和SSR分析從親本、F1和F2群體單株上取葉片，冷凍處理后，用QuickGene核酸提取儀，使用 DNA試劑盒提取基因組DNA。SSR 反應體系總體積 10 μ L, Green Master Mix 5 μ L，DNA (5nG · μ じ1) 3 μ L，正向、反向引物(50nG· μじ1)各0.6 μ L，其余以ddH20補足10 μしPCR程序為94°C預變性4min ;94°C變性15s ;55°C退火15s ;72°C延伸30s :35個循環；72°C保溫5min。擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠160V恒功率電泳分離，銀染顯色后在觀察燈箱上進行數據分析。步驟3. SSR標記篩選、數據統計及連鎖圖構建先用兩個親本篩選引物，然后分別以6個果實苦味單株和6個果實不苦單株的DNA組成的苦味組和不苦組為模板，用在兩親本間產生多態性的引物進行Bt基因標記的篩選，只要苦味組和不苦組內分別有5株或以上單株的帶型一致，即初步認為該標記與果實苦味性狀相關。篩選了 2112對引物組合，選出在雙親產生多態性的996對引物組合，對苦味組和不苦組的各6個單株進行檢驗，篩選出24對標記，對F2群體進行驗證后，得到了 19對可用標記。接著，將這19對標記對整個F2群體進行分析，統計條帶的分離情況。共顯性標記的統計方法為來自母本P1的帶型記為a，來自父本P2的帶型記為b，雜合的帶型記為h，未擴增或模糊不清的記為U。顯性標記的統計方法為若P1為顯性，則F2單株中與P1帶型ー致的記為山與P2帶型一致的記為b ;若P2為顯性，則F2單株中與P1帶型一致的記為a，與P2帶型一致的記為C。最后利用JoinMap4. O (van Ooijen & Voorrips, 2001)作圖軟件構建Bt基因的SSR連鎖群(圖3)，LOD閾值5. O，分析數據，獲得Bt基因的SSR連鎖圖。將Bt基因定位于黃瓜第5染色體短臂的一端I. 5cM的范圍內，其中與Bt基因兩側最近的標記分別為SSR21558和SSR20054，遺傳距離分別為O. 5cM和I. OcM0SSR21558-F/SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAACCSeq ID No. 5和 SEQ IDNo. 6)，其擴增的特征條帶如 Seq ID No. I 所示(175bp)和 Seq ID No. 2 所示(192bp)。SSR20054-F/SSR20054-R GTTTGTGAGGGAAACGCAAT /TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA (Seq ID No. 7 和 SEQ IDNo. 8)，其擴增的特征條帶如Seq ID No. 3所示(127bp)和Seq ID No. 4所示(108bp)。步驟4. PCR擴增所得差異片段的回收純化及測序(I)目的片段的回收采用煮沸法。具體操作為先從膠上將目標條帶挖下來裝入I. 5mL的Eppendorf管內，向管內加入100 μ L超純水，加水量視膠帶顏色深淺而定；常溫下浸泡24h，轉入95°C水浴鍋(或PCR儀)中煮30min后,5000rpm離心3min。產物即可取上清3 μ L做模板進行PCR擴增，剩余產物置_20°C保存備用。(2)目的片段的純化用PCR產物直接純化方法。在PCR產物中加入2倍體積的無水こ醇，_20°C過夜放置，I, 2000rpm離心5min就可以得到純化產物。(3)目的片段與載體的連接反應體系為10 μ L PMD18-T Vectorl. OyL ；LiGation buffer I 5· 0 μ L ;目的片段4· 0μし
在超凈工作臺上加樣，混勻反應物，暫短離心，16°C連接約lh，過夜也不影響連接效率。(4)連接產物的轉化I)取出感受態細胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；2)感受態(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 預冷去離子水;3)用冷卻的無菌槍頭將上述懸浮液分裝到I. 5mL離心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，輕旋混勻；4) 42°C水浴熱激90s，注意不要晃動離心管；5)快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻3 5min ；6)加入500 μ L LB液體培養基。在37°C，150rpm搖床上預培養Ih ；7)將菌液涂布到含有 100 μ G ^mr1Amp,25 μ G ·ι じ1 IPTG 和 40 μ G mL^X-GAL 的 LB固體培養基上，用一無菌的彎頭玻棒輕輕的將菌液均勻涂開，置于室溫直至液體被吸收；8)倒置平板，37°C培養12 16h。(5)重組質粒的藍白斑篩選經37°C培養后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出現少量藍色菌落和較多的白色菌落，其中白色菌落為重組克隆子。挑取白色單菌落涂抹在劃好方格的LB液體培養基中，37°C,150rpm過夜培養。(6)菌落PCR的檢測吸取I μ L菌液作為模板進行PCR擴增。取4 μ L PCR產物，經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與PCR Marker標準分子量相比較檢測插入片段的大小，與插入目的片段大小一致的克隆即為陽性克隆。(7)克隆后載體的測序與分析取3個陽性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存兩份，一份-20°C保藏，ー份送去測序。實施例2. Bt基因雙側翼SSR標記的驗證利用本課題收集的20份不同生態類型的黃瓜材料，對與Bt基因兩側緊密連鎖標記進行驗證確定標記SSR21558和SSR20054用于分子標記輔助選擇的準確性。這20個單株的表型為18株果實不苦；2株果實苦。利用標記SSR21558分析結果表明，在20份材料中均擴增出目的條帶，與田間表現型相比，檢測的正確率為95. 0%。將與Bt基因連鎖的另ー標記SSR20054對上述材料進行驗證，在20份DNA中均擴增出目的條帶，與田間表現型相比，檢測的正確率為75. 0%，使用兩標記相互印證進行驗證的準確率可達95. 0 %。本研究中構建了黃瓜果實苦味Bt基因的SSR連鎖圖，所獲得的SSR標記(SSR21558和SSR20054)與Bt的遺傳距離分別O. 5cM和I. OcM，這兩個與黃瓜果實苦味基因緊密連鎖的SSR標記為黃瓜分子標記輔助選擇育種奠定良好的基礎。
權利要求
1.黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記，序列如下SSR21558-F/SSR21558-R: GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC，其擴增的特征條帶如 Seq ID No. I 所示和Seq ID No. 2所示， SSR20054-F/SSR20054-R:GTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA，其擴增的特征條帶如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示。
2.權利要求I所述的SSR標記在選擇無果實苦味基因Bt的黃瓜種質資源中的應用，其步驟如下 (1)采用所述SSR標記為引物對黃瓜待選材料的基因組DNA分別進行PCR擴增， (2)對擴增結果進行凝膠電泳檢測， (3)從凝膠電泳檢測的結果中選出沒有出現所述果實苦味特征條帶的材料。
3.根據權利要求2或3所述的應用，所述PCR擴增的體系GoTaqGreenMasterMix5 μ L(PromeGa)，15n⑶NA，正向、反向引物各30nG，其余以ddH20補足至10 μし
4.根據權利要求2或3所述的應用，PCR擴增的程序為94°C預變性4min;94°C變性15s ;55°C退火 15s ;72°C延伸 30s ；35 個循環；72°C保溫 5min。
5.根據權利要求2 4任一所述的應用，所述凝膠電泳檢測指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于160V恒電壓電泳分離，最后銀染顯色。
全文摘要
本發明“黃瓜果實苦味基因Bt緊密連鎖的SSR標記及其應用”，涉及生物育種輔助技術。標記序列如下SSR21558-F/SSR21558-R:GTGGGGGATGTGATTCAGAC/CATCATCCATTCCCCTCAAC，其擴增的特征條帶如Seq ID No.1所示(175bp)和Seq ID No.2所示(192bp)。SSR20054-F/SSR20054-RGTTTGTGAGGGAAACGCAAT/TCAAAAAGCTTCCTTCCTTCA，其擴增的特征條帶如Seq ID No.3所示(127bp)和Seq ID No.4所示(108bp)。本發明的兩個標記與Bt基因的連鎖更加緊密，對于黃瓜果實苦味的分子標記輔助育種體系的建立更有幫助；采用本發明獲得的SSR標記，可以在黃瓜候選材料的任何階段對其進行果實苦味或果實無苦味的篩選，具有高效、限制少、準確的優點，為黃瓜育種選擇無苦味材料提高了選擇效率和準確性。
文檔編號A01H1/04GK102690823SQ201210185989
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者張圣平, 王燁, 苗晗, 顧興芳 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所