專利名稱：具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酯化物的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酷化物的制備方法及應用，具體涉及ー種具有增強免疫活性、抗病毒活性的生物飼料添加劑川明參多糖硫酸酷化物及其制備方法及應用。
背景技術：
藥物飼料添加劑由于其具有促進畜禽生長和預防疾病等作用，提高了生產率和飼養經濟效益，在我國畜禽養殖業中起著重要作用。然而，隨著藥物飼料添加劑的長期使用，尤其是抗生素、化學合成藥物在飼料中的濫用，出現了耐藥性、藥物殘留、環境污染等問題。這不僅降低了畜產品的質量，還會通過生物鏈影響到人類健康和生態平衡。隨著我國加入 WTO后國際市場化的步伐加快，以及人們對生活質量要求的提高，發展無公害畜牧業，生產緑色畜產品已成為我國政府畜牧主管部門的首要任務，尋找緑色、安全、高效的飼料添加劑替代抗生素、化學藥物等的無公害綠色飼料添加劑成為加快我國畜禽業可持續發展的當務之急。中藥多糖是中藥的主要活性成分之一，其生物活性近年來受到廣泛關注，研究表明其既具有資源豐富，安全低毒，無污染，無殘留等優點，又具有抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗病毒、抗輻射、調節免疫、調血脂等功能。然而植物多糖自身不具有某些生物活性或生物活性很弱，因而限制了其應用。如何利用現有的科學技術手段改造多糖以提高其生物活性已成為ー個重要問題。
發明內容
鑒于植物多糖的上述不足，本發明通過大量的研究和實踐，提供ー種具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酯化物的制備方法及應用。為了提高植物多糖的生物活性，本發明采用了以下技術方案ー種具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酷化物的制備方法，提取和精制中藥川明參中多糖，然后在川明參多糖中添加酷化試劑制備成川明參多糖硫Ife酷化物。所述川明參多糖的制備方法如下川明參干燥粉末置于索式提取器中，用I : UV/V)的こ醇、こ醚混合液加熱回流脫脂2 6h，過濾后藥渣置于室溫下干燥。將蒸餾水按料液比I 10 20 (g/ml)加入藥渣中，80 100°C提取3次，每次I 3h，合并提取液，濃縮至最小體積，用流水透析24 48h后蒸餾水透析12 24h，透析袋內加入體積為提取液1/5的三氯甲烷，隨后再加入體積為三氯甲烷1/5的正丁醇，劇烈振搖10 20min，離心去除水層與有機層交界處的變性蛋白質，水層仍按照此方法反復除蛋白3 5次。濃縮后加入I 3倍量95%こ醇(V/V)靜置過夜。離心收集沉淀，依次用無水こ醇、丙酮洗滌后，離心分離，沉淀物置于30 40°C真空干燥得川明參多糖。所述川明參多糖硫酸酷化物的制備方法如下
(I)酷化試劑的制備將氯磺酸與吡啶按按照I : 6 I : 10的體積比，在冰鹽浴以及不斷攪拌下，逐滴加入到預冷的50mL無水吡啶中，其中氯磺酸應在20 30min內滴加完畢；(2)均勻分布于無水甲酰胺的川明參多糖的制備將100 300mg川明參多糖邊攪拌邊加入到10 20mL無水甲酰胺中，繼續攪拌20 30min使川明參多糖在無水甲酰胺中均勻分布；(3)將酯化試劑加入到含有川明參多糖的無水甲酰胺溶液中，在40 60°C水浴溫度下攪拌反應I 2h。反應完畢后，冷卻至室溫，再加入15% NaOH溶液調pH值至7. O 8. 0，流水透析48 72h后蒸餾水透析12 24h。こ醇沉淀，丙酮、無水こ醚分別洗滌，真空干燥12 24h后得到川明參多糖硫酸酷化物。 所述的具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酷化物的應用，作為ー種抗病、促生長和無殘留的生物飼料添加劑用于畜禽。本發明中的多糖硫酸酷化物主要通過氯化鋇一明膠法測定其硫酸取代度。本發明經藥效學研究表明，川明參多糖硫酸酷化物具有增強免疫活性和抗病毒活性。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例I川明參多糖的制備稱取300g的川明參干燥粉末置于索式提取器中，用I : 1(V/V)的こ醇、こ醚混合液加熱回流脫脂6h，過濾后藥渣置于室溫下干燥。將蒸餾水按料液比I 20 (g/ml)加入藥渣中，100°C提取3次，每次3h，合并提取液，濃縮至小體積，用流水透析48h后蒸餾水透析24h，透析袋內液體積為提取液1/5的三氯甲烷，隨后再加入體積為三氯甲烷1/5的正丁醇，劇烈振搖20min，離心除去水層與有機層交界處的變性蛋白質，水層仍按照此方法反復除蛋白5次。濃縮后加入3倍量95%こ醇(V/V)靜置過夜。離心收集沉淀，依次用無水こ醇、丙酮洗滌后，離心分離，沉淀物置于40°C真空干燥得川明參多糖。制備酯化試劑氯磺酸與吡啶I : 6的體積比(V/V)，在冰鹽浴以及不斷攪拌下，將氯磺酸逐滴加入到預冷的50mL無水吡啶中；將300mg川明參多糖邊攪拌邊加入到20mL無水甲酰胺中，繼續攪拌30min使多糖在無水甲酰胺中分布均勻；然后加入酷化試劑，在60°C水浴溫度下攪拌反應2h。反應完畢后，冷卻至室溫，再加入質量百分濃度為15% NaOH溶液調pH值至7. 0-8. 0，流水透析72h后蒸餾水透析24h。こ醇沉淀，丙酮、無水こ醚分別洗滌，真空干燥24h后得到川明參多糖硫酸酷化物。經氯化鋇一明膠法測定其硫酸取代度為1.37。實施例2川明參多糖的制備稱取200g的川明參干燥粉末置于索式提取器中，用I : 1(V/V)的こ醇、こ醚混合液加熱回流脫脂4h，過濾后藥渣置于室溫下干燥。將蒸餾水按料液比I 15 (g/ml)加入藥渣中，90°C提取2次，每次2h，合并提取液，濃縮至小體積，用流水透析36h后蒸餾水透析18h，透析袋內液加入體積為提取液1/5的三氯甲烷，隨之再加入體積為三氯甲烷1/5的正丁醇，劇烈振搖15min，離心除去水層與有機層交界處的變性蛋白質，水層仍按照此方法反復除蛋白3次。濃縮后加入2倍量95%こ醇(V/V)靜置過夜。離心收集沉淀，依次用無水こ醇、丙酮洗滌后，離心分離，沉淀物置于35°C真空干燥得川明參多糖。制備酯化試劑氯磺酸按與吡啶I : 8的體積比(V/V)，在冰鹽浴以及不斷攪拌下，將氯磺酸逐滴加入到預冷的50mL無水吡啶中；將300mg川明參多糖邊攪拌邊加入到20mL無水甲酰胺中，繼續攪拌30min使多糖在無水甲酰胺中分布均勻；然后加入酷化試劑，在60°C水浴溫度下攪拌反應2h。反應完畢后，冷卻至室溫，再加入質量百分濃度為15% NaOH溶液調pH值至7. 0-8. 0，流水透析72h后蒸餾水透析24h。こ醇沉淀，丙酮、無水こ醚分別洗滌，真空干燥24h后得到川明參多糖硫酸酷化物。經氯化鋇一明膠法測定其硫酸取代度為O. 95。實施例3川明參多糖的制備稱取IOOg的川明參干燥粉末置于索式提取器中，用I : 1(V/V)的こ醇、こ醚混合液加熱回流脫脂4h，過濾后藥渣置于室溫下干燥。將蒸餾水按料液比 I 10加入藥渣中，100°C提取2次，每次I. 5h，合并提取液，濃縮至小體積，用流水透析24h后蒸餾水透析12h，透析袋內液加入體積為提取液1/5的三氯甲烷，隨之再加入體積為三氯甲烷1/5的正丁醇，劇烈振搖lOmin，離心分去水層與有機層交界處的變性蛋白質，水層仍按照此方法反復除蛋白4次。濃縮后加入I. 5倍量95%こ醇(V/V)靜置過夜。離心收集沉淀，依次用無水こ醇、丙酮洗滌后，離心分離，沉淀物置于40°C真空干燥得川明參多糖。制備酯化試劑氯磺酸按與吡啶I : 10的體積比(V/V)，在冰鹽浴以及不斷攪拌下，將氯磺酸逐滴加入到預冷的50mL無水吡啶中；將300mg川明參多糖邊攪拌邊加入到20mL無水甲酰胺中，繼續攪拌30min使多糖在無水甲酰胺中分布均勻；然后加入酷化試劑，在60°C水浴溫度下攪拌反應2h。反應完畢后，冷卻至室溫，再加入質量百分濃度為15% NaOH溶液調pH值至7. 0-8. O,流水透析72h后蒸餾水透析24h。こ醇沉淀，丙酮、無水こ醚分別洗滌，真空干燥24h后得到川明參多糖硫酸酷化物。經氯化鋇一明膠法測定其硫酸取代度為O. 69。實施例4川明參多糖硫酸酷化物對新城疫免疫雛雞的免疫增強活性研究本試驗采用I日齡三黃雞200羽，隨機平均分為四組，包括川明參多糖硫酸酷化物高、中、低劑量組和對照組，各組的試驗雞于7日齡時(HI低于31og2，平均體重120g)通過點眼滴鼻進行新城疫活疫苗免疫。高、中、低劑量組的雞只分別按照100mg/kg.d、50mg/kg. d、25mg/kg. d的劑量ロ服給予O. 5ml川明參多糖硫酸酷化物，對照組則ロ服O. 5ml的生理鹽水，連續5d。于14、21、28日齡時測定其血清抗體滴度、淋巴細胞増殖、紅細胞玫瑰花環率和紅細胞免疫復合物花環率的測定。結果表明川明參多糖硫酸酷化物能顯著增強雛雞血清中抗體的水平并且能維持較長時間(見表I);顯著提高T淋巴細胞的増殖(見表2);顯著提高雞紅細胞玫瑰花環率(見表3)，提高其清除免疫復合物的速率(見表4)。表I川明參多糖硫酸酯化物對雞血清抗體的影響
權利要求
1.ー種具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酷化物的制備方法，其特征在干提取和精制中藥川明參中多糖，然后在川明參多糖中添加酯化試劑制備成川明參多糖硫酸酯化物。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述川明參多糖的制備方法如下川明參干燥粉末置于索式提取器中，用I : I (V/V)的こ醇、こ醚混合液加熱回流脫脂2 .6h,過濾后藥洛置于室溫下干燥。將蒸懼水按料液比I : 10 20 (g/ml)加入藥洛中，80 .100°C提取3次，每次I 3h，合并提取液，濃縮至最小體積，用流水透析24 48h后蒸餾水透析12 24h，透析袋內加入體積為提取液1/5的三氯甲烷，隨后再加入體積為三氯甲烷.1/5的正丁醇，劇烈振搖10 20min，離心去除水層與有機層交界處的變性蛋白質，水層仍按照此方法反復除蛋白3 5次。濃縮后加入I 3倍量95%こ醇(V/V)靜置過夜。離心收集沉淀，依次用無水こ醇、丙酮洗滌后，離心分離，沉淀物置于30 40°C真空干燥得川明參多糖。
3.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述川明參多糖硫酸酷化物的制備方法如下 (1)酷化試劑的制備將氯磺酸與吡啶按按照I: 6 I : 10的體積比，在冰鹽浴以及不斷攪拌下，逐滴加入到預冷的無水吡啶中，其中氯磺酸應在20 30min內滴加完畢； (2)均勻分布于無水甲酰胺的川明參多糖的制備將川明參多糖邊攪拌邊加入到無水甲酰胺中，繼續攪拌20 30min使川明參多糖在無水甲酰胺中均勻分布； (3)將酯化試劑加入到含有川明參多糖的無水甲酰胺溶液中，在40 60°C水浴溫度下攪拌反應I 2h。反應完畢后，冷卻至室溫，再加入15% NaOH溶液調pH值至7. O 8. 0，流水透析48 72h后蒸餾水透析12 24h。こ醇沉淀，丙酮、無水こ醚分別洗滌，真空干燥.12 24h后得到川明參多糖硫酸酷化物。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法制備的植物多糖硫酸酯化物的應用，作為ー種抗病、促生長和無殘留的生物飼料添加劑用于畜禽。
全文摘要
本發明公開了一種具有免疫增強活性和抗病毒功效的植物多糖硫酸酯化物及其制備方法。其制備方法為從中藥川明參中提取和精制多糖，然后將川明參多糖均勻分布于無水甲酰胺中，加入酯化試劑，在一定的溫度下制成川明參多糖硫酸酯化物。所制備的川明參多糖硫酸酯化物具有免疫增強活性以及體外抗新城疫病毒、鴨瘟病毒活性，可作為一種抗病、促生長和無殘留的生物飼料添加劑在畜禽中使用。
文檔編號A23K1/16GK102690366SQ20121019142
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月11日 優先權日2012年6月11日
發明者宋旭, 徐嬌, 殷中瓊, 程安春, 賈仁勇 申請人:殷中瓊