專利名稱：一種用于保存胚胎的冷凍液、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于保存胚胎的冷凍液，特別涉及一種用于保存取樣胚胎的冷凍液。本發明還涉及所述冷凍液的制備方法及應用。
背景技術：
胚胎的冷凍是胚胎的保存方法，將胚胎置于冷凍液中保護并采取特殊的降溫程序，使胚胎在超低溫(液氮_196°C，液氦_269°C )下停止代謝。需要使用胚胎時，再通過特定的解凍程序使其恢復生存能力，從而達到長期保存胚胎的目的。為了性別鑒定和其它基因檢測與分析，常常需要利用顯微操作技術將胚胎組織切割下一小部分用于分析，將剩余部分冷凍保存備用。 但胚胎被切割取樣后會對胚胎造成損傷，如透明帶破損、胚胎細胞數量減少、破壞細胞連接等，使胚胎對冷凍的耐受性降低。凍后的胚胎無論在形態正常率、凍后回收率，還是在胚胎發育率等方面都不夠理想。冷凍液主要包括兩種慢速程序化冷凍液和玻璃化冷凍液。常規冷凍就是慢速程序化冷凍，慢速程序化冷凍液的組成和配比不是固定不變的，目前最常用的是乙二醇+蔗糖或者再添加些其他成分的，一般在牛胚胎的冷凍上研究較多。由于胚胎的質量、種屬、發育階段和培養條件的不同，使得冷凍效果存在差異，冷凍液的組成也會隨之變化，但用于保存取樣胚胎的效果較好的冷凍液鮮有報道。1983年Lehn-Jensen發現透明帶在冷凍解凍過程中起一種物理屏障作用,可抵抗病毒和微生物。目前，針對取樣胚胎冷凍的報道較少，且有關的報道，冷凍效率都很一般。而常規的由乙二醇和蔗糖組成的乙二醇冷凍液，由于冷凍保護劑選擇不當，大都存在冷凍取樣胚胎效率低以及取樣胚胎凍后的發育率和移植成功率較低的問題。因此，急需一種可保存取樣胚胎的冷凍液。阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan, AG),分子量為530000,為高分子量非滲透性抗凍保護劑，在藥物和食品工業中應用較多，經常被用作食品添加劑，并具有免疫等活性，所以對細胞毒性較小，但將其作為冷凍保護劑的報道幾乎沒有，且在常規冷凍保護液中添加高分子量非滲透性抗凍保護劑，此前從未有過報道。
發明內容
為解決上述領域的需求和不足，本發明提供一種用于保存胚胎的冷凍液，其制備方法及應用。本發明冷凍液通過在常規胚胎冷凍液中添加特定濃度的高分子量非滲透性抗凍保護劑阿拉伯半乳聚糖，解決了常規乙二醇冷凍液用于冷凍取樣胚胎發育率低的問題。一種用于保存胚胎的冷凍液，含乙二醇和蔗糖，其特征為還含有阿拉伯半乳糖、含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS，其配比為阿拉伯半乳糖0.4 5g :乙二醇75 85ml:鹿糖30 40g::含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 910 930ml。
所述含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS中，所述牛血清白蛋白在緩沖溶液中的含量為 0. 0021g/ml ；配制時，將乙二醇、蔗糖和阿拉伯半乳糖溶解于含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS中。當所述冷凍液各組分的配比為阿拉伯半乳糖0. 46 4. 6g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS920ml時，本發明冷凍液胚胎發育率高于對照組的胚胎發育率，根據本領域常識，本發明冷凍液總體效果優于對照組。當所述冷凍液各組分的配比為阿拉伯半乳糖2. 76 3. 68g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS920ml時，根據對比數據，本發明冷凍液總體效果較佳，這個區間內的冷凍液效果差異不顯著，且冷凍效果比較穩定，沒有忽高忽低的變化。將阿拉伯半乳聚糖的濃度提高或者降低，則都不能達到如此好的效果。 當所述冷凍液各組分的配比為阿拉伯半乳糖2. 76g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 920ml時，冷凍效果達到最好。所述冷凍液各組分的用量為阿拉伯半乳糖0. 0276g，乙二醇0. 8ml，蔗糖0. 315008g，含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS9. 2ml，為最佳比值，在這個比值下，本發明冷凍液效果最好。上述冷凍液中，所述胚胎是經切割取樣的取樣胚胎。上述冷凍液的制備方法，包括如下步驟(I)將阿拉伯半乳聚糖加入容器中，再加入緩沖溶液PBS，4°C靜置溶解；(2)再加入蔗糖，4°C靜置溶解；(3)再加入牛血清白蛋白BSA，勿搖動，4°C靜置溶解；(4)再加入緩沖溶液PBS，得到混合液；(5)取步驟(4)所得混合液與乙二醇相混合，密封，4°C冰箱靜置；上述各成分的配比為阿拉伯半乳糖0. 4 5g :乙二醇75 85ml:鹿糖30 40g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS910 930ml，所述牛血清白蛋白在緩沖溶液中的含量為 0. 0021g/ml。上述冷凍液在保存取樣胚胎中的應用。技術效果本發明是在常規冷凍液中添加非滲透性的高分子抗凍保護劑阿拉伯半乳聚糖、BSA(牛血清白蛋白)等，這些物質不能透過細胞膜，在急速降溫過程中其黏滯性增加，對損傷創面有膠性保護作用，而且細胞外液濃度高，有助于細胞內液脫出，防止細胞內部大冰晶的形成，所以對胚胎起到保護作用。阿拉伯半乳聚糖是一種重要的植物活性多糖，早期在食品和日用化工中作添加齊U，近年來發現其具有明顯的免疫活性，成為一種新型的免疫促進劑。阿拉伯半乳聚糖對細胞毒性小，且其具有膠性的特質，當對胚胎進行冷凍時，細胞內部就不會形成大的冰晶從而減少對細胞造成傷害，甚至可能在達到適當的濃度時，能夠在細胞外部形成特殊的保護膜，阻止細胞外冰晶對細胞造成損傷。在解凍期間，阿拉伯半乳聚糖是緩沖滲透壓物質，通過降低解凍時細胞的膨脹速度來減少滲透性損傷的發生。乙二醇為低分子量滲透性冷凍保護劑，在幾種常用的低分子量冷凍保護劑中，乙二醇毒性最低，滲透性最好，添加蔗糖能夠降低溶液的毒性，而血清含有許多成分，包括能量基質、氨基酸、維生素、激素、生長因子和細胞因子，作為胚胎的營養和能量底物，是其它物質不能取代的最佳選擇。但由于犢牛血清易造成動物病原菌污染，本發明使用牛血清白蛋白(BSA)替代犢牛血清，排除掉病原菌污染的問題，而且其中成分無很大變化。本發明冷凍液以常規冷凍液(乙二醇+蔗糖)為基礎，添加特定濃度的作為高分子量非滲透性抗凍保護劑的阿拉伯半乳聚糖，本發明充分利用乙二醇，蔗糖，阿拉伯半乳聚糖和牛血清白蛋白之間的相互配合、相互支持、協同作用。本發明冷凍液用于取樣胚胎的冷凍，取樣胚胎冷凍后的發育率高。本領域常識，一種冷凍液的胚胎發育率高于對照組的胚胎發育率，那么這種冷凍液效果就優于對照組。透明帶受損胚胎常規冷凍液添加阿拉伯半乳聚糖，對冷凍效果的影響結合表I和表2，可以看出當溶液中阿拉伯半乳聚糖的重量與總冷凍液的體積之比分別為0. 00276g/ml和0. 00368g/ml時，冷凍效果達到較好，并且這兩種冷凍液的冷凍效 果之間差異不顯著，且冷凍效果較穩定，沒有忽高忽低的變化。將阿拉伯半乳聚糖的濃度提高或者降低，則都不能達到如此好的效果。在解凍期間，阿拉伯半乳聚糖作為高分子量冷凍保護劑具有阻止解凍時形成冰晶的作用，并與蔗糖協同作用緩沖細胞內外液較高的滲透壓差，防止在細胞內部冷凍劑沒有完全脫除時細胞過度膨脹。另外，所以將胚胎常規乙二醇冷凍液中添加適量的阿拉伯半乳聚糖，能夠顯著提高胚胎解凍后的培養發育率。透明帶受損胚胎二次冷凍和鮮胚冷凍，冷凍效果比較長期的研究表明，胚胎在冷凍及解凍過程中，都會受到一系列的傷害，如低溫會引起細胞膜脂肪相的變化，從而影響細胞的新陳代謝；冷凍保護劑中主要是滲透性冷凍保護劑會對胚胎產生化學毒害作用，溫度越高、作用時間越長、濃度越大，則毒性就會越大，這種毒性會造成細胞變脆崩裂、透明帶硬化、微管微絲的聚合和解聚、染色體和DNA損傷等，以及胚胎冷凍和解凍時的冰晶損傷等。經對比實驗證實，本發明冷凍液具有如下優點I.取樣胚胎解凍后培養發育率顯著高于常規冷凍液；2.當阿拉伯半乳聚糖的重量與總冷凍液的體積之比在0. 00276 0. 00368g/ml之間時，冷凍效果較好，且冷凍效果較穩定，沒有忽高忽低的變化，將阿拉伯半乳聚糖的濃度提高或者降低，則都不能達到如此好的效果；3.本發明冷凍液尤其對取樣胚胎冷凍效果較好。
圖I胚胎冷凍裝管示意圖
具體實施例方式提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，并不局限于所述最佳實施方式，不對本發明的內容和保護范圍構成限制，任何人在本發明的啟示下或是將本發明與其他現有技術的特征進行組合而得出的任何與本發明相同或相近似的產品，均落在本發明的保護范圍之內。本發明試驗中對照組使用的常規乙二醇冷凍液由乙二醇和蔗糖組成，本發明實施例中的乙二醇為純的液態乙二醇。本發明試驗中所使用的冷凍儀為胚胎冷凍儀，型號CL5500，廠家澳大利亞。本發明所用試劑來源阿拉伯半乳聚糖購于美國Sigma公司，規格型號10830_25G。PBS 緩沖液(pH7. 2 7. 4) :NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L ；BSA牛血清白蛋白購自美國Hyclone公司，實施例中乙二醇購自美國Sigma公司(E-9129)，規格型號102466-500mL，其中乙二醇密度為 I. 110g/mL at25° C ；對照組常規乙二醇冷凍液(EG FREEZE),為進口 EG冷凍液，購于美國BI0NICHE公司，規格型號50mL，EVM034。 實施例I. 0. 03EAS冷凍液的配制將0.03g阿拉伯半乳聚糖置于IOml容量瓶中，加入PBS至近刻度線，4°C靜置溶解；待完全溶解后，加入0. 3424g蔗糖，4°C靜置溶解；待完全溶解后，加入0. 02IgBSA (勿搖動，防起泡)，4°C靜置溶解；待完全溶解后，加入PBS定容至刻度線；容量瓶中液體混勻后，取容量瓶中溶液9. 2ml同0. 8ml純的液態乙二醇相混合，密封，冰箱4°C靜置，待用。實施例2. 0. 005EAS冷凍液的配制配制步驟同實施例1，加入0. 005g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、純的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。實施例3. 0. OlEAS冷凍液的配制配制步驟同實施例1，加入0. Olg的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、純的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。實施例4. 0. 02EAS冷凍液的配制配制步驟同實施例1，加入0.02g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、純的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。實施例5. 0. 04EAS冷凍液的配制配制步驟同實施例1，加入0.04g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、純的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。實施例6. 0. 05EAS冷凍液的配制配制步驟同實施例1，加入0.05g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、純的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。實施例7.本發明冷凍液的使用方法本發明采用慢速程序化冷凍，使用方法如下①將冷凍儀組裝接入電源，倒入液氮，選擇冷凍儀的0程序進行冷凍，此程序為_6°C植冰，降溫速度為0. 50C /min, _35°C投入液氮。②裝管，本發明采用六段法裝管，先裝入兩段冷凍液，然后第三段裝入胚胎，后面三段再裝入冷凍液，最后塞入貼有標簽的細管塞。(如圖I)③胚胎放入冷凍液平衡5min，裝管后將細管放入已降溫至_6°C的冷凍儀中并再次平衡5min后植冰(植冰點見圖I )，植冰后按下RUN鍵(IOmin后儀器開始以0. 5°C /min的速度開始降溫);5min后檢查植冰；當冷凍儀溫度降到_35°C時將細管投入液氮并裝入CANE中放入液氣進彳丁保存。實施例8. EAS系列冷凍液(添加阿拉伯半乳聚糖冷凍液)和常規乙二醇冷凍液(EGFREEZE)進行透明帶受損胚胎二次冷凍-解凍觀察用實施例1-6所得冷凍液，對透明帶受損胚胎進行二次冷凍、解凍、CO2培養箱培養試驗，同時以常規乙二醇冷凍液(EG FREEZE)為對照組，比較本發明冷凍液和常規冷凍液(EG FREEZE)的冷凍效果。表I透明帶受損胚胎二次冷凍-解凍培養結果
實施~冷凍液冷凍解凍胚胎回培養24h~培養24h~培養48h~培養48h 例胚胎存活收率!％ 發育數發存率％發育胚數發育率％ _數數_
I (T005EA~10 7 70. OOab~I14.29a I14.29a
S
20. OlEAS 10 9 90. OOab I11.11s I11. Ila
30.02EAS 10 770. OOab I14.29a 228.57a
40.03EAS 10 10 100. OOa 220. OOa 330. OOa
50.04EAS 10 7 70. OOab 342.86* 342.86°
60. 05EAS 15 S5 33b 337. 5Cf 450. OOa對照 EG 20 1*d 75.00* 2 13.33* 2 13.33°
J|_注同列肩標小寫字母相同者差異不顯著(P > 0. 05)，肩標小寫字母不同者差異顯著(P < 0. 05)。如表I所示，在胚胎回收率方面，只有0. OlEAS和0. 03EAS高于對照組(P > 0. 05)，其余四種冷凍液中，0. 05EAS的胚胎回收率最低；培養24h發育率和培養48h發育率，只有0. OlEAS低于對照組(P > 0. 05)，其余五種冷凍液均高于常規乙二醇冷凍液(EG FREEZE),但差異不顯著(P > 0. 05)。因此，總的來說，本發明冷凍液的效果都優于常規冷凍液。結合EAS系列冷凍液的透明帶受損胚胎二次冷凍解凍觀察試驗的結果，挑選出0. 03EAS和0. 04EAS兩種冷凍液進行后續的鮮胚冷凍試驗。實施例9.透明帶受損鮮胚冷凍-解凍培養仍以常規乙二醇冷凍液(EG FREEZE)為對照，將0. 03EAS冷凍液和0. 04EAS冷凍液，對透明帶受損鮮胚進行冷凍、解凍、CO2培養箱培養試驗，比較本發明冷凍液和常規乙二醇冷凍液(EG FREEZE)的冷凍效果。表2
實施冷凍液~SI Si 培養24h培養24h培~養培~~例胚胎數存活數冋收率％ 發育K數發育率％ 48h發48h發
_胚數首率％
~0.03EAS 403792. 50" 2670. 27to 3081.08Aa
權利要求
1.一種用于保存胚胎的冷凍液，含乙二醇和蔗糖，其特征為還含有阿拉伯半乳糖、含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS，其配比為 阿拉伯半乳糖0.4 5g 乙二醇75 85ml:鹿糖30 40g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液 PBS 910 930ml ； 所述含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS中，所述牛血清白蛋白在緩沖溶液中的含量為0.0021g/ml ； 配制時，將乙二醇、蔗糖和阿拉伯半乳糖溶解于含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS中。
2.根據權利要求I所述冷凍液，其各組分的配比為阿拉伯半乳糖0.46 4.6g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 920ml。
3.根據權利要求2所述冷凍液，其各組分的配比為阿拉伯半乳糖2.76 3. 68g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 920ml。
4.根據權利要求3所述冷凍液，其各組分的配比為阿拉伯半乳糖2.76g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 920ml。
5.根據權利要求4所述冷凍液，其各組分的用量為阿拉伯半乳糖0.0276g，乙二醇0. 8ml，蔗糖0. 315008g，含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 9. 2ml。
6.權利要求I 5任一所述的冷凍液，所述胚胎是經切割取樣的取樣胚胎。
7.權利要求I 5任一所述冷凍液的制備方法，包括如下步驟 (1)將阿拉伯半乳聚糖加入容器中，再加入緩沖溶液PBS，4°C靜置溶解； (2)再加入蔗糖，4°C靜置溶解； (3)再加入牛血清白蛋白BSA，勿搖動，4°C靜置溶解； (4)再加入緩沖溶液PBS，得到混合液； (5)取步驟(4)所得混合液與乙二醇相混合，密封，4°C冰箱靜置； 上述各成分的配比為阿拉伯半乳糖0. 4 5g :乙二醇75 85ml:鹿糖30 40g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 910 930ml，所述牛血清白蛋白在緩沖溶液中的含量為0.0021g/ml。
8.權利要求I 5任一所述冷凍液在保存取樣胚胎中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用于保存胚胎的冷凍液，特別是用于保存取樣胚胎的冷凍液。本發明冷凍液含乙二醇和蔗糖，其特征為還含有阿拉伯半乳糖、含牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的緩沖溶液PBS，其配比為阿拉伯半乳糖0.4～5g∶乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS 910～930ml；所述牛血清白蛋白在緩沖溶液中的含量為0.0021g/ml；配制時，將乙二醇、蔗糖和阿拉伯半乳糖溶解于含牛血清白蛋白的緩沖溶液PBS中。本發明充分利用乙二醇，蔗糖，阿拉伯半乳聚糖和牛血清白蛋白之間的相互配合、相互支持、協同作用以及充分發揮各組分的特點，本發明冷凍液對取樣胚胎解凍后的發育率高于常規乙二醇冷凍液。
文檔編號A01N1/02GK102771472SQ20121027978
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年4月25日
發明者余文莉, 李樹靜 申請人:余文莉, 李樹靜