專利名稱：具有增強的產率相關性狀的植物及其制備方法
技術領域：
本發明一般涉及分子生物學領域，并且涉及通過增加植物中產率增加性多肽的編碼核酸序列的表達來增強多種植物產率相關性狀的方法，所述產率増加性多肽選自核定位AT-hook 基序蛋白 19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調節蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉移酶(AAT)樣多肽，和丙氨酸氨基轉移酶(AAT)多肽。本發明還涉及具有増加的編碼所述產率増加性多 肽的核酸序列的表達的植物，該植物相對于對照植物具有增強的產率相關性狀。本發明還提供了用于本發明方法的構建體。
背景技術：
不斷增長的世界人口和逐漸減少的農業可用耕地助長了提高農業效率研究之勢。傳統的作物和園藝學改良方法利用選育技術來鑒定具有期望特性的植物。然而，此類選育技術有若干缺陷，即這些技術一般為勞動密集型的，而且產生的植物通常含有異質的遺傳組分，這些異質的遺傳組分不一定總是導致期望性狀自親本植物的傳遞。分子生物學的進展已經使人類能夠修飾動物和植物的種質。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(一般為DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳物質引入植物。這類技術能夠產生具多種改良的經濟、農藝或園藝性狀的作物或植物。具有特別經濟意義的ー種性狀是增加的產率。產率通常定義為作物可測量經濟價值的產出。這可以以數量和/或質量的方式進行定義。產率直接取決于若干因素，例如器官的數量和大小、植物構造(例如，分枝的數量)、種子產量、葉子衰老等等。根的發育、營養吸收、脅迫耐受性和早期活力也是決定產率的重要因素。因此優化ー個或多個上述因素也可以促進作物產率的增加。種子產率是特別重要的性狀，這是因為許多植物的種子對于人類和動物營養而言至關重要。通過對種子本身的直接消耗，或是通過消耗由加工的種子所飼養的肉類產品，作物諸如玉米、稻、小麥、蕓苔(canola)和大豆等占人類總卡路里攝取量的一半以上。它們也是エ業加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚(新的枝條和根的來源)和胚乳(萌發過程和幼苗早期生長過程中胚生長的營養源)。種子的發育涉及許多基因，并且需要代謝物自根、葉和莖轉移至正在生長的種子。特別是胚乳，同化糖類、油類和蛋白質的代謝前體，將其合成為貯存性高分子，以充盈籽粒。收獲指數為種子產率與地上干重之間的比值，其在許多環境條件下相對穩定，因此在植物大小和糧谷(grain)產率之間通常能夠獲得比較穩靠的相關性(如Rebetzke等人(2002) Crop Science42:739) 0這些方法存在固有的聯系，原因是大多數糧谷生物量取決于植物葉和莖的當前的或忙存的光合產率(Gardener等人(1985)Physiology of CropPlants. Iowa State University Press, 68-73頁)。因此，對植物大小的選擇，甚至是在發育早期階段的選擇，已經用作為未來潛在產率的指標(如Tittonell等人(2005)AgricEcosys & Environl05:213)。當檢查遺傳差異對脅迫耐受性的影響時，溫室或植物生長室環境與田間相比具有固有的優勢，即，能夠使土壌性能、溫度、水和養分可利用度以及光強度標準化。不過，由于因缺乏風カ或昆蟲導致的不良授粉，或由于空間不足以讓成熟根或冠層生長等等，而對產率造成的人為局限性，會限制這些受控環境在測試產率差異中的應用。因此，在生長室或溫室中在標準化條件下測量早期發育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產率優勢指標的標準作法。另ー重要的性狀為增加的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是導致全世界作物損失的首要原因，使大多數主要作物植物的平均產率下降超過50%(Wang等人，Planta (2003) 218:1-14)。非生物脅迫可以因干旱、鹽度、極端溫度、化學毒性、養分(大量元素和/或微量元素)過量或不足、輻射和氧化脅迫而引起。提高植物非生物脅迫耐受性的能力將對全世界的農場主帶來重大的經濟利益，并將使得能夠在不利條件下以及在原本不可能栽培作物的地域中栽培作物。 對于許多作物而言,另ー重要的性狀是早期活力(early vigour)。改良早期活力是溫帶和熱帶稻類栽培種的現代稻類育種項目的重要目標。長根對于水栽稻的恰當土壤錨固至關重要。在直接向澇地里播種稻米的情況下，以及在植物必須迅速穿過水出苗的情況下，較長的枝條與活力有夫。在進行條播的情況下，較長的中胚軸和胚芽鞘對于優良的出苗至關重要。改造植物早期活力的能力在農業上將具有極其重要的意義。例如，一直以來早期活力弱限制了在歐洲大西洋地區引入基于玉米帶種質的玉米(玉蜀黍，Zea mays L.)雜交種。另ー重要的性狀是在非生物脅迫條件下生長的植物的增強的產率相關性狀。非生物脅迫是導致全世界作物損失的首要原因，使大多數主要作物植物的平均產率下降超過50% (Wang等人，Planta (2003) 218:1-14)。非生物脅迫可以因干旱、鹽度、極端溫度、化學毒性、養分(大量元素和/或微量元素)過量或不足、輻射和氧化脅迫而引起。增強在非生物脅迫條件下生長的植物的產率相關性狀的能力將對全世界的農場主帶來重大的經濟利益，并將使得能夠在不利條件下以及在原本不可能栽培作物的地域中栽培作物。因此通過優化上述因素之一可以增加作物產率。視最終用途而定，可能更優選修飾某些產率性狀。例如，對于諸如飼料或木材生產或者生物燃料資源等應用，可能期望植物營養部分的增長，而對于諸如面粉、淀粉或油料生產等應用，可能特別期望種子參數的增長。即便是在種子參數之中，視用途而定，一些參數也可能比另ー些更優。多種機制可促成増加的種子產率，無論形式是增加的種子大小、還是增加的種子數量。增加植物產率相關性狀(種子產率和/或生物量)的ー種方法可以是修飾植物的內在生長機制，如細胞周期或者參與植物生長或防御機制的各種信號傳遞路徑。
發明內容
現已發現，通過在植物中增加編碼核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)多肽的核酸序列的表達，可以相對于對照植物增強植物的多種種子產率相關性狀，而無延遲的開花。增強的種子產率性狀相關性狀包括一個或多個下列性狀増加的每圓錐花序的花數、增加的每株植物的種子總產率、增加的飽滿種子數和增加的收獲指數。此外，現已發現，増加編碼GRP多肽(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a (MT2a)多肽)的核酸序列的表達，可以產生在非生物脅迫條件下生長時相對于在相當條件下生長的對照植物具有增強的產率相關性狀的植物。此外，現還發現，調節ATT樣多肽編碼核酸在地上植物部分中的表達，可以產生相對于對照植物具有增強的產率相關性狀，特別是增加的產率，的植物。此外，現已發現，在非限氮條件下生長的植物的產率相關性狀可通過調節ATT多肽編碼核酸在這樣的植物中的表達來增強。發明背景
DNA結合蛋白是包含任何DNA結合結構域并因此對DNA具有特定的或一般的親和力的蛋白質。DNA結合蛋白包括例如調節轉錄過程的轉錄因子、切割DNA分子的核酸酶以及參與細胞核中DNA包裝的組蛋白。AT-hook基序是首先在高遷移率組非組蛋白染色體蛋白質HMG-I/Y中描述的短DNA 結合蛋白基序(Reeves 和 Nissen(1990) J Biol Chem265:8573-8582)。已知 AT-hook與富含AT的核酸序列的小溝相互作用(Huth等(1997)Nat Struc Biol4:657_665)。已在廣泛的來自動物、植物和微生物的DNA結合蛋白中鑒定到AT-hook基序。與幾種已良好表征的DNA結合基序不同，AT-hook基序短，不超過13個氨基酸殘基，并且在其中心具有典型的三肽序列甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(Gly-Arg-Pro或GRP)。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，大約30種包含至少一個AT-hook基序的多肽還包含植物及原核生物保守(nlant and prokaryotes conserved, PPC)結構域,該結構域在歐洲生物信息學研究所(European Bioinformatics Institute) (EBI)的 InterPro結構域數據庫中被描述為DUF296(未知功能結構域296) (Fujimoto等(2004)Plant MolecBiol56:225-239)。這些蛋白質之ー被發現定位于核質中，從而被稱為核定位AT-hook基序蛋白1(AHL1; Fujimoto等，同上)。類似地命名了旁系同源多肽，即AHL，并順序編號。在美國專利7，193，129和美國專利申請2005/0097638中，將擬南芥AHL多肽AHL19 (根據Fujimoto等，同上)(標識為G2153)轉化入擬南芥，并且使用35S CaMV啟動子進行表達。轉基因植物顯示出改良的性狀，例如増加的鹽脅迫耐受性、増加的滲透脅迫耐受性、增加的干旱耐受性、增加的對冷凍的耐受性和增加的對糖的植物應答。在美國專利申請2005/0097638中，與對照植物相比較，AHL19多肽以及幾種旁系同源AHL多肽的過量表達(在35S CaMV啟動子的控制下)顯著延遲了轉基因植物的開花，從而增加產率。發明概述根據ー個實施方案，提供了相對于對照植物增強植物的種子產率相關性狀的方法，該方法包括増加編碼AHL19/20多肽的核酸序列在植物中的表達。增強的種子產率相關性狀包括一個或多個下列性狀増加的每圓錐花序的花數、増加的每株植物的種子總產率、增加的飽滿種子數和增加的收獲指數。根據ー個實施方案，提供了相對于對照植物增強在非生物脅迫條件下生長的植物的產率相關性狀的方法，該方法包括增加GRP多肽編碼核酸序列在植物中的表達，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽，增強的產率相關性狀是ー個或多個下列性狀±曾加的地上生物量、增加的每株植物的種子總產率、增加的飽滿種子數、增加的種子總數、增加的一級圓錐花序(primary panicles)數、和增加的種子飽滿率。根據本發明的一個實施方案，提供了相對于對照植物增強植物的產率相關性狀的方法，該方法包括調節編碼AAT-樣多肽的核酸在地上植物部分中的表達。在優選實施方案中，編碼AAT-樣多肽的核酸的表達通過將所述核酸有效連接至在地上植物部分中具有活性的啟動子來進行調節(優選增加)。根據ー個實施方案，提供了增強在非限氮條件下生長的植物的產率相關性狀的方法，該方法包括調節ATT多肽編碼核酸在植物中的表達。定義多肽/蛋白質術語“多肽”和“蛋白質”在文中互換使用，是指通過肽鍵連接起來的、任意長度的氨基酸多聚體。 多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列術語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”在文中互換使用，是指任何長度的無支鏈形式的多聚核苷酸，所述核苷酸或者為核糖核苷酸或者為脫氧核糖核苷酸或者為兩者的組合。對照棺物選擇合適的對照植物是實驗設置的常規部分，并且可以包括相應的野生型植物或不含目的基因的相應植物。對照植物通常與待評估植物為相同的植物物種，或者甚至為同一品種。對照植物還可以是待評估植物的無效合子(nullizygote)。如本文所用的“對照植物”不僅指完整植物，而且指植物部分，包括種子和種子部分。同源物蛋白質的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，其相對于所討論的未修飾蛋白質具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有與其源自的未修飾蛋白質相似的生物活性和功能活性。缺失是指從蛋白質中除去一個或多個氨基酸。插入是指在蛋白質的預定位置引入一個或多個氨基酸殘基。插入可以包括單個或多個氨基酸的N-末端和/或C-末端融合以及序列內插入。一般氨基酸序列內部的插入將小于N-或C-末端的融合，數量級約I到10個殘基。N-或C-末端融合蛋白質或肽的實例包括如在酵母雙雜交系統中應用的轉錄激活因子的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標簽、谷胱甘肽S-轉移酶標簽、蛋白質A、麥芽糖結合蛋白、ニ氫葉酸還原酶、Tag 100表位、c-myc表位、廠し\(;"表位、IacZ, CMP (鈣調蛋白結合肽)、HA表位、蛋白質C表位和VSV表位。取代是指蛋白質中的氨基酸用具有相似性質(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打破a螺旋結構或0片層結構的傾向性)的其他氨基酸替換。氨基酸取代通常是單個殘基的取代，但是視施加于多肽上的功能性限制而定也可以發生成簇取代；取代通常在大約I到10個氨基酸殘基數量級。氨基酸取代優選為保守氨基酸取代。保守取代表在本領域眾所周知(參見例如 Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (編輯)和下表I)。
表I :保守氨基酸取代的實例
權利要求
1.相對于對照植物增強植物的產率相關性狀的方法，包括調節編碼丙氨酸氨基轉移酶(AAT)樣多肽的核酸在地上植物部分中的表達。
2.權利要求I的方法，其中所述AAT樣多肽包含ー個或多個以下特征 (a)催化下列反應的能力L-丙氨酸+2-酮戌ニ酸◎丙_酸+L-谷氨酸 (b)屬于酶分類編號EC2.6. I. 2. (c)具有氨基轉移酶結構域(在InterPro中稱為IPR004839;以及在PFAM中稱為PF00155) (d)具有I-氨基環丙烷-I-羧酸合酶結構域(在InterPro中稱為IPROOl176) (e)靶向線粒體 (f)當用于構建包含AAT序列的系統發生樹時，與包含SEQID NO :51的AAT樣多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類， (g)由編碼AAT樣多肽并且能夠與SEQID NO :50所示核酸雜交的核酸編碼， (h)由編碼SEQID NO :51所示蛋白的直系同源物或旁系同源物的核酸序列編碼。
3.權利要求I或2的方法，其中所述調節的表達通過在植物中引入和表達在啟動子控制下的編碼AAT樣多肽的核酸來實現，其中所述啟動子在地上植物部分中具有活性。
4.任何前述權利要求的方法，其中所述增強的產率相關性狀包括相對于對照植物増加的產率、優選增加的種子產率。
5.權利要求3或4的方法，其中所述在地上植物部分中具有活性的啟動子是枝條特異性和/或葉特異性啟動子。
6.任何前述權利要求的方法，其中所述AAT樣多肽編碼核酸是藻類來源的，優選來自衣藻屬，更優選來自物種雷氏衣藻。
7.可通過前述權利要求之任ー項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼AAT樣多肽的重組核酸，優選地所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黒麥、黑小麥(triticale)、高粱和燕麥。
8.構建體，包含 (i)編碼權利要求2中定義的AAT樣多肽的核酸； (ii)能夠驅動(i)中的核酸序列在地上部分中表達的啟動子序列；和任選地 (iii)轉錄終止序列。
9.權利要求8的構建體在用于產生相對于對照植物具有增加的產率，特別地增加的種子產率的植物的方法中的用途。
10.用權利要求8的構建體轉化的植物、植物部分或植物細胞，優選地所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黒麥、黑小麥(triticale)、高粱和燕麥。
11.產生與對照植物相比具有增加的產率，特別地增加的種子產率的轉基因植物的方法，包括 (i)在植物中引入和表達編碼權利要求2中所定義的AAT樣多肽的核酸，該核酸處于在地上部分中具有活性的啟動子的控制之下；和 (ii)在促進植物生長和發育的條件下培養所述植物細胞。
12.由于編碼權利要求2中定義的AAT樣多肽的核酸的表達增加而與對照植物相比具有増加的產率、特別是増加的種子產率的轉基因植物、或源自所述轉基因植物的轉基因植物細胞，其中所述核酸處于在地上部分中具有活性的啟動子的控制之下，優選地所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黒麥、黑小麥(triticale)、高粱和燕麥。
13.根據權利要求7、10或12的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
14.AAT樣多肽編碼核酸用于相對于對照植物増加植物的產率，特別是増加種子產率的用途，其中該核酸處于在地上部分中具有活性的啟動子的控制之下。
15.AAT樣多肽編碼核酸用于改變植物的收獲周期的用途。
16.AAT樣多肽編碼核酸作為探針用于對包含其的基因進行遺傳作圖以及用作與那些基因連鎖的性狀的標志物的用途。
全文摘要
本發明總體上涉及分子生物學領域，并且涉及通過調節植物中編碼產率增加性多肽的核酸序列的表達來增強多種植物產率相關性狀的方法，所述產率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生長調節蛋白)(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉移酶(AAT)樣多肽、和丙氨酸氨基轉移酶(AAT)多肽。本發明還涉及具有調節的產率增加性多肽編碼核酸序列表達的植物，所述產率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生長調節蛋白)(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉移酶(AAT)樣多肽、和丙氨酸氨基轉移酶(AAT)多肽，該植物相對于對照植物具有增強的產率相關性狀。本發明還提供了可以用于本發明方法的構建體。
文檔編號A01H5/10GK102827865SQ20121028186
公開日2012年12月19日 申請日期2008年7月21日 優先權日2007年7月20日
發明者Y·海茨費爾德, V·弗蘭卡德 申請人:巴斯夫植物科學有限公司