專利名稱：擬南芥At4g31910基因在改良水稻株型性狀方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于轉基因技術領域，具體涉及擬南芥At4g31910基因在改良水稻株型性狀方面的應用。
背景技術：
我國是農業大國，水稻是我國主要的糧食作物。因此提高水稻的產量，是全世界科學家努力奮斗的目標。提高水稻的產量可以通過多方面手段，包括通過轉基因手段等來實現水稻經濟性狀的改良。水稻的轉基因是根據已知的功能基因與表型性狀的關系，采用組成型表達載體或組織專一性表達載體將目的基因導入目標植物，以期獲得作物特定經濟性狀或抗逆性狀優良的轉基因材料。在不影響水稻育性和單株產量的基礎上，植株的矮化能夠使水稻更抗倒伏，從而增加單位面積上的水稻產量。油菜素留醇(BrassinosteiOid，簡稱BR)是植物的第六大激素，在花粉、種子和幼嫩組織中含量豐富，它調控了植物生長發育的許多過程，包括葉的發育，莖的伸長，木質部的分化，雄性育性，衰老以及對生物和非生物脅迫的抗性[Yang，CJ., Zhang, C.，Lu, YN, and Wang XL(2011)，The mechanisms of Brassinosteroid’ s Action: FromSignal Transduction to Plant Development. Molecular Plant, 4(4)， 588-600.][Shimada, Y. , Goda, H. , Nakamura, A. , Takatsuto, S. , Fujioka, S. andYoshida, S. (2003) Organ-specific Expression of brassinosteroid-biosyntheticgenes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis. PlantPhysiology, 131，287-297.]。在擬南芥中，乙酰輔酶A依賴的酰基轉移酶At4g31910在擬南芥中過表達后，會使植株變矮小，類似BR含量減少和信號減弱的突變體。因此，尋求將矮化基因的基因轉到了水稻當中，以期望改良水稻株型性狀可以提高水稻的產量。
發明內容
本發明目的在于提供擬南芥At4g31910基因在改良水稻株型性狀方面的應用。本發明內容為采用水稻日本晴為轉基因受體，用帶有擬南芥基因At4g31910的載體pCAMBIA1306，構建At4g31910基因的過表達轉基因植株。本發明中，帶有基因At4g31910的載體pCAMBIA1306，是將擬南芥At4g31910的基因插入到PCAMBIA1306載體35S組成型啟動子下游的KpnI和BamHI酶切位點之間而獲得。本發明中，擬南芥基因At4g31910的克隆通過PCR以擬南芥的cDNA為模板將其擴增而獲得。本發明中，擬南芥基因At4g31910的cDNA序列如SEQ. ID. NO. I所述。本發明中，擬南芥基因At4g31910的蛋白序列如SEQ. ID. NO. 2所述。本發明包括
I)擬南芥 似O表達載體的構建采用pCAMBIA1306為表達載體，將擬南芥基因 似O基因插入到pCAMBIA1306載體35S組成型啟動子下游的KpnI和BamHI酶切位點之間(圖I)。擬南芥編碼酰基轉移酶的基因余J7刃O 全長 cDNA,見 SEQ. ID. NO. I。2)帶有基因的載體pCAMBIA1306轉化水稻試驗與結果
利用日本晴為轉基因受體。將水稻種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培養基上誘導愈傷組織。在愈傷組織誘導2-4周后，采用侵染的方法，將含有J t4g31910基因的重組質粒導入日本晴愈傷組織細胞。在添加50mg/L潮霉素的MS培養基上連續培養3-4周摘選抗性細胞系，然后將篩選的細胞系轉移到分化培養基誘導長芽和生根。最終篩選出獨立的轉化株系。
本發明中，用于轉化水稻的A包 沒切基因序列(SEQ. ID. NO. I)及翻譯的蛋白(SEQ.ID. NO. 2)，使用的PCR引物為: 4g31910-F(KpnI) lAAGGATCCCTTATACAATATGCCCATGTTAAATG 4g31910-R(BamHI) |aAGGATCCGCAATCAAGGAAATGATTTGAAAAGC
本發明利用擬南芥基因命沿似O的編碼序列構建了組成型表達載體轉化水稻日本晴，獲得了比對照株型矮小的水稻轉基因材料，改良了水稻的株型形狀，提高了水稻的抗倒伏性，從而可以達到增加單位面積上的水稻產量的益處。
圖I為pCAMBIA1306的多克隆位點示意圖。圖2為轉基因Tl代8個轉化子以及轉空載苗中A余似O基因的表達量示意圖，其中，Ni代表日本晴，1306-1和1306-2代表轉空載的2個株系，Tl-I到T1-8為8個轉A t4g31910基因的轉化株系。圖3為成苗的表型示意圖，左為轉1306空載的轉基因植株，右為轉A似O基因的植株。圖4為轉基因T2代2個株系不同植株以及轉空載植株中A余似O基因的表達量示意圖，其中，1306-1和1306-2代表T2代空轉的2個株系，T2和T6是T2 \WiAt4g31910基因株系中的第2和第6個株系，其中每個株系選擇3棵苗，分表用1，2，3表示。圖5為轉基因T2代2個株系不同植株對比轉空載苗中的BR標記基因的表達量變化示意圖。
具體實施例方式下面的實施例是對本發明的進一步說明，而不是限制本發明的范圍。實施例I.
轉基因載體的構建
先通過PCR以擬南芥Col-O的cDNA為模板擴增帶有酶切位點的目標片段的cDNA序列，采用pCAMBIA1306為表達載體，將擬南芥基因插入到pCAMBIA1306載體35S組成型啟動子下游KpnI和BamHI之間(圖I)。
水稻轉基因流程
I.誘導剝去種子的外、內穎，選成熟飽滿的種子，裝入50ml的離心管。無菌水30ml清洗4 5次，70%乙醇浸泡2 min，無菌水清洗3次，再用無菌水清洗4 5次，O. 15% HgCl2UOOrpm、15 20 min。在無菌超凈臺打開,倒出HgCl2,用無菌水清洗4 5次,倒在滅菌的平板和濾紙上吸干，約Ih左右。將之置入N6D固體培養基上(10粒/25 ml/瓶)，種胚朝上或接觸培養基，28 0C，暗培養25 30d。2.繼代
觀察誘導的愈傷，一般長得能自行脫落的樣子就可以剝下來進行繼代培養。除去胚乳、胚芽，將愈傷轉入新的N6D，培養7 10天。如果剝下的愈傷比較大，可以在這一步用鑷子將之弄小。(I)前培養(PH=5. 6)將繼代的愈傷重新轉依次培養基即可，也應保證培養基吹干和愈傷干燥。一般3 4天就可以進行感染。(2)農桿菌的培養將適量農桿菌(100 μ I左右)涂布接種在LB固體培養·基上，ΕΗΑ105和LBA4404暗培養36 h即可。(3)感染和共培養
①懸浮取滅菌小勺刮取農桿菌，用勺背面將菌體貼在管壁輕輕拍散，0D_=0. 8 I. O。(一般刮5 6勺菌即可，也就是透過菌液隱約可見離心管刻度，濃度不能太大，否則就要稀釋)。②感染將前培養的愈傷在無菌濾紙上晾一下，然后集中至一個平皿一次性轉入菌液中，輕輕轉動離心管使菌液均勻分布，靜置時間約15 20 min(根據濃度不同調整，濃度大，時間就相對短)。③共培養將菌液倒出，愈傷在無菌濾紙上放約I. 5 h,保證菌液吸干，接至1/2N6D AS中，20°C、暗培養2 3天，看到愈傷與培養基接觸部分有菌膜，就可以除菌了。共培養過程中不要經常開培養箱，以免溫度變化太大，產生水膜。3.農桿菌的去除
將共培養的愈傷裝入50 ml的離心管，用無菌水清洗3次以上，至液體比較清亮。倒出無菌水，N6D+Cn500 mg/L (或 AP500ml/L)，100 rpm, 15-20 min, 2-3 次。將愈傷倒在無菌濾紙上吸干2h左右，視情況而定。將干燥的愈傷轉入N6D-AS中，不加Hn,加Cn250 mg/L,28°C，暗培養7 IOd。4.愈傷組織的篩選
挑出沒被農桿菌污染的愈傷，第一次加Cn250 mg/L和Hn (50 mg/L), 15 20d。如果在這次篩選中，仍有愈傷被污染，挑出好的轉平板篩選一次。第二次同上，不加Cn，加Hn，把所有的愈傷全部再轉一次，15 20d。第三次選出新的愈傷，用Hn篩選，15 20d。次數部用一定按上述安排，但應保證愈傷在Hn上篩選的時間至少45 d以上，第三次挑出的新長出的愈傷最好篩選20 do5.分化
將第四次篩選的全部愈傷組織移入MS中，Hn 50 mg/L，暗培養，預分化(PH 5. 9) 12 15d。選出長勢好的新鮮的愈傷(淡黃色)，移入MS (PH 6.0)中，光培養15 20 d，可看到有綠芽長出，一般15 d換一次培養基。如果愈傷分化比較好，培養基看上去也比較清新，可以不換。選長出Icm以上的綠芽，剝去周圍多余的愈傷，剪去根(可留約O. 5cm長)移入試管中，1/2 MS生根培養。6.轉化株系的檢測
將篩選后存活的轉化子通過實時定量PCR來檢測候選的轉化子，獲得8個過表達At4g31910的轉化株系。經實時定量PCR分析內源 刃O在對照日本晴以及轉入pCAMBIA1306空載的苗和轉入 似O基因植株中的表達量
用實時定量PCR檢測發苗14天的轉基因Tl代Ai At4g31910基因的表達情況，以日本晴和轉空載體植株為對照，用Actin作為內參(圖2)。發現 似O在轉基因植株內高水平表達，上調倍數從幾百到上千倍不等。·At4g31910轉基因水稻Tl代表現出對照轉空載植株的株型發生明顯變化。轉At4g31910基因的水稻表現出整體植株比空載苗的株高矮(圖3)。7、T2代BR標記基因水平的檢測
T2代苗通過實時定量PCR來檢測BR標記基因DWARF，D2,和DWF4的表達量。選取了其中兩個生長表型不同于對照的兩個轉基因株系，每個株系選了 3棵植株，對BR信號輸出的標記基因進行轉錄水平的檢測。首先檢測了這6株植物中命沿似O的含量(圖4)。進一步發現BR合成酶基因/ 和的表達在T2代轉基因植物中上調(圖5)，表明在這些株系中BR信號的輸出減弱了，從而引起了植株的矮化。
權利要求
1.擬南芥At4g31910基因在改良水稻株型性狀方面的應用，其特征在于采用水稻日本晴為轉基因受體，用帶有擬南芥基因At4g31910的載體pCAMBIA1306，構建At4g31910基因的過表達轉基因植株。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于帶有擬南芥基因At4g31910的載體PCAMBIA1306,是將擬南芥At4g31910的基因插入到pCAMBIA1306載體35S組成型啟動子下游的KpnI和BamHI酶切位點之間而獲得。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于擬南芥基因At4g31910的克隆通過PCR以擬南芥的cDNA為模板將其擴增而獲得。
4.根據權利要求I所述的應用，其特征在于擬南芥基因At4g31910的cDNA序列如SEQ.ID. NO. I 所述。
5.根據權利要求I所述的應用，其特征在于擬南芥基因At4g31910的蛋白序列如SEQ.ID. NO. 2 所述。
全文摘要
本發明屬于轉基因技術領域，涉及擬南芥At4g31910基因在改良水稻株型性狀方面的應用。具體為采用水稻日本晴為轉基因受體，用帶有擬南芥基因At4g31910的載體pCAMBIA1306，構建At4g31910基因的過表達轉基因植株，本發明可以用基因At4g31910的過量表達使BR信號輸出減弱，以改良水稻的株型，使其矮化，更易抗倒伏。
文檔編號A01H5/00GK102911966SQ20121030303
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者王學路, 朱文姣, 王海嬌, 喬勝龍, 申紅蕓 申請人:復旦大學