專利名稱：一種防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物領域，涉及一種防治香蕉冠腐病的生防菌株B28及其應用。
背景技術：
由香蕉炭疽菌(Colletotrichummusae)、可可球二抱菌(Botryodiplodiatheobromae)、奇異長 _ 殼菌(Ceratocystis paradoxa)、串珠鍵刀菌(Fusariummoniliforme)、半裸鐮刀菌(Fusarium semitectum)等真菌感染引起的香蕉冠腐病能導致15—30%的香蕉果實腐爛，由此每年造成的損失近4. 2—8. 4億元。為了減少香蕉的腐爛，延長貨架期，香蕉采收后都要用殺菌劑處理，殺死或抑制果實上的真菌，減少由真菌引起的果 實腐爛。目前，香蕉果實的防腐主要靠化學防腐劑，常用的化學防腐劑有三唑類殺菌劑(敵力脫、晴氨唑、氟硅唑)，咪唑類(施保克、施保功)，特克多，撲海因，咪鮮安，苯來特，多菌靈，甲基托布津等。化學防腐劑處理香蕉果實，有一部分會殘留在果實上，人食用后會進入人體，引起急性或慢性中毒；同時，化學防腐劑還會進入水體、土壤、空氣等地方造成環境污染；更為重要的是，化學防腐劑的大量使用，使病菌產生抗藥性，使很多防腐劑失去了作用。生物防腐劑是由對人畜和環境安全的活的微生物菌體及其分泌的抗真菌物質組成，施用在香蕉果實上，對人無毒無害，人食用后很安全；對環境安全，進入自然環境后不污染環境。
發明內容
本發明的目的是提供了一種安全、高效的防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌，該芽孢桿菌，容易在香蕉上定植和成活，不易死亡，藥效期長；長期和大量使用病菌不易產生抗藥性。為了實現上述目的，本發明的技術方案為提供一種防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌，其中，該芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌B28，于2011年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No. 4623。該枯草芽孢桿菌B28培養基為牛肉膏I 3g、蛋白胨8 10g、酵母膏O. 8 lg、NaCl I 3g、蒸餾水1000毫升，初始pH值7. 2 7. 4, 30°C, 160轉每分鐘振蕩培養48小時，培養后離心的溫度O 4°C，離心轉速為4000 6000rpm，離心時間為15 40min。本發明還提供一種枯草芽孢桿菌B28的應用，該枯草芽孢桿菌B28制備的生防菌劑用于防治香蕉冠腐病，該生防菌劑中枯草芽孢桿菌B28含量為109-10ncfU/ml。生防菌劑是將枯草芽孢桿菌B28培養后離心濃縮，低溫干燥后加蒸餾水制得，最終活性菌的濃度為109-10ncfu/ml。該枯草芽孢桿菌B28為菌體桿狀，周生鞭毛，芽孢位于菌體中間，芽孢橢圓形，孢囊不膨大，菌體大小O. 4-0. 6μ mX I. 2-2. 3 μ m ;革蘭氏染色陽性，在NYDA培養基上24h內形成圓形、光滑、平坦、乳白色、中間細顆粒狀菌落；菌氧化葡萄糖產酸，過氧化氫酶、V. P.反應、硝酸鹽還原陽性，能液化明膠，能利用檸檬酸鹽，能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇，能在含10%NaCI的培養基中生長，生長溫度10-50度。
具體實施例方式本發明所提供的香蕉冠腐病生防菌劑其活性成分為枯草芽孢桿菌B28 (Bacillussubtilis)活菌。生防菌劑中枯草芽孢桿菌B28 (Bacillus subtilis)含量為109-10ncfu/ml，優選為 1010cfu/ml ο生防菌劑是將枯草芽孢桿菌B28 (Bacillus subtilis)培養后離心濃縮，低溫干燥后加蒸餾水制得，最終活性菌的濃度為109-10ncfu/ml。這里B28 (Bacillus subtilis)培養基優選為牛肉膏l_3g、蛋白胨8_10g、酵母膏O. 8-lg、NaCl I 3g、蒸餾水1000毫升，初始pH值7. 2-7. 4，30°C，160轉每分鐘振蕩培養48小時。培養后離心的溫度O 4°C，離心轉速為4000 6000rpm，離心時間為15 40mino 本生防菌劑存放期7個月，枯草芽孢桿菌B28 (Bacillus subtilis)芽孢存活率為 92. 84%ο使用方法用冷水稀釋10倍，浸泡香蕉。浸泡采后的香蕉果實，對香蕉冠腐病的防效可達67. 5%。采用對峙培養，在PDA平板上，中間接O. 5cm大小的香蕉冠腐病菌半裸鐮刀菌菌塊，在其四周同時點接枯草芽孢桿菌B28，30度下恒溫培養時，枯草芽孢桿菌B28對香蕉冠腐病菌半裸鐮刀菌(Fusarium semitectum)的抑菌作用明顯，抑菌帶寬O. 75cm,病菌被限制在Icm的范圍內不能再擴張，而點蒸餾水的空白平板上香蕉冠腐病菌半裸鐮刀菌已長滿整個平板；由B28制成的水劑，稀釋10倍后，浸泡香蕉10分鐘，香蕉常溫(30°C)下放置10天，香蕉果柄未腐爛，香蕉果實完好，對香蕉冠腐病的防效達67. 5%，而未經B28處理的香蕉100%發病，從果柄開始，整個果實腐爛。本發明通過對峙培養、復篩、殺菌活性物質分析、紫外線照射、劑型研制、防腐試驗、定植試驗、存活試驗、防腐安全性評價等步驟篩選出專門殺死引起香蕉果實腐爛的真菌的芽孢桿菌B28 (Bacillus subtilis)，該菌適應性強，耐干旱，耐高溫和低溫，能分泌強烈殺真菌多肽物質，能與其它殺真菌的化學殺菌劑和生理保鮮劑混用，能在香蕉果實上定植下來并持續分泌殺菌物質，能在香蕉果實采后防腐中廣泛應用。優越件本發明提供的牛防菌劑比目前常用、而目.認為是較好的化學農藥施保功的防效高，對香蕉冠腐病的防治效果達67. 5%，而施保功的防效只有53% ;采用本防治方法處理的香蕉不僅爛果率低，而且吃起來口感更好，沒有異味，而化學防腐劑處理的香蕉，口感較差；本生物防腐劑中所有成分(主要成分和輔助成分)均是自然物質，對人和環境非常安全。平板對峙培養實驗結果對3種香蕉冠腐病菌的抑菌帶寬度見表
權利要求
1.一種防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌，其特征在于該芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌B28，于2011年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為 CGMCC No. 4623。
2.如權利要求I所述的防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌，其特征在于該枯草芽孢桿菌B28培養基為牛肉膏I 3g、蛋白胨8 10g、酵母膏O. 8 lg、NaCl I 3g、蒸懼水1000毫升，初始pH值7. 2 7. 4，300C，160轉每分鐘振蕩培養48小吋，培養后離心的溫度O 4°C，離心轉速為4000 6000rpm,離心時間為15 40min。
3.如權利要求I所述的防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌，其特征在于該枯草芽孢桿菌B28制備的生防菌劑用于防治香蕉冠腐病，該生防菌劑中枯草芽孢桿菌B28含量為109-10ncfu/ml。
4.如權利要求3所述的防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌，其特征在干該生防菌劑是將枯草芽孢桿菌B28培養后離心濃縮，低溫干燥后加蒸餾水制得，最終活性菌的濃度為109-10ncfu/ml。
全文摘要
本發明公開了防治香蕉冠腐病的芽孢桿菌及其應用，該芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌B28, 于2011年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No.4623。該枯草芽孢桿菌B28制備的生防菌劑用于防治香蕉冠腐病，該生防菌劑中枯草芽孢桿菌B28含量為109-1011cfu/ml。本發明通過對峙培養、復篩、殺菌活性物質分析、紫外線照射、劑型研制、防腐試驗、定植試驗、存活試驗、防腐安全性評價等步驟篩選出專門殺死引起香蕉果實腐爛的真菌的芽孢桿菌B28(Bacillus subtilis)，該菌適應性強，耐干旱，耐高溫和低溫，能分泌強烈殺真菌多肽物質，能與其它殺真菌的化學殺菌劑和生理保鮮劑混用，能在香蕉果實上定植下來并持續分泌殺菌物質，能在香蕉果實采后防腐中廣泛應用。
文檔編號A01P3/00GK102851244SQ20121033309
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者張榮意, 譚志瓊 申請人:海南大學