專利名稱：一種防治三七枯萎病的微生物有機磷肥的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種防治三七枯萎病的微生物有機磷肥，屬微生物有機磷肥技術領域。
背景技術：
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)是五加科人參屬植物，是我國特有的名貴中藥材[I]，也是云南省最具特色的生物資源之一。三七具有散瘀止血、消腫定痛、調節血糖平衡、抗疲勞、抗衰老、耐缺氧和提高機體免疫力等多方面的藥理作用和保健功能[2-3]。三七是多年生宿根草本植物，由于三七生長周期較長，生長條件苛刻(要求冬暖夏涼、無嚴寒與酷暑，半光半陰、潮濕的特定環境)，種植區域受限，僅分布在云南文山市各縣以及廣西與文山交界的幾個地方[4]，因此與同屬植物人參、西洋參一樣，存在嚴重 的連作障礙問題[5]，即栽過一茬三七的土地要間隔至少八年甚至幾十年才能再栽三七，如果縮短輪作年限則表現為三七地上部分生長不良，病害多，產量低，甚至毀園絕收[6]。三七枯萎病(Root rot disease)是三七生產中的毀滅性病害，其造成的損失占三七全部病害損失的70-85%，已成為制約三七產業可持續發展的嚴重障礙。三七枯萎病為多種病原菌協同侵染引起的土傳復合病害(Complex disease),其病原包括真菌(Alternariapanax, A. tenuis, Cylindrocarpon destructans, C. didynum, Fusarium solani, F.oxysporum, Phytophthora cactorum, Phoma herbarum, Rhizoctonia solani) [7]。據調查統計三七輪作間隔4 5年，發病率達30%以上；間隔8年以上，發病率在10% 15%。因此，連作障礙導致三七適宜種植地塊十分緊張，已呈現出由適宜種植區域向次適宜區域轉移，不僅增加了“七農”的種植成本，還嚴重影響了三七的產量和質量。連作障礙也成為制約三七產業發展的重大問題。利用開墾新地和與非寄主作物輪作或休閑8 10年以上是傳統解決這一問題有效的方法。但是近年來，隨著三七規模化種植面積的不斷擴大，此方法已不能滿足市場需要，而施用化學農藥直接影響三七質量和污染環境。因此，一種安全、有效的防治措施，在此背景下，生物防治被賦予極大的期望。三七作為一種區域性植物，其根腐復合病害的生物防治極少被廣泛關注，但部分研究已經表明生防微生物在三七枯萎病防治方面有較好的應用前景。用微生物菌劑拌種(苗)處理，在三七生長前期，對枯萎病有明顯的控制效果(陳昱君等，2004);從三七根際土壤中分離的三株芽孢桿菌對三七枯萎病病原菌中的壞損柱孢霉(C. destructans)具有較好的抑菌作用，具備研發生物農藥的潛力(劉立志等，2004)。生防微生物在植物根際良好的定殖、生存及繁殖能力是其發揮生防效果的前提；良好的根際定殖能力已經成為篩選土傳病害拮抗微生物的重要考察參數。生物有機磷肥是采用經過高能活化的磷礦物為主要原料，在特效菌種的作用下與有機質共同發酵處理而得到的；其特點是長效緩釋、非酸化、非水溶性，后效性顯著，一季使用多季有效；該肥料的使用能優化土壤礦物組成和結構，避免化學肥料對農產品質量及土壤酸化的不良影響，達到增產、改善品質、綠色生態的效果。本發明利用一種能高效消除三七枯萎病連作障礙的高效拮抗菌(解淀粉芽孢桿菌)與生物有機磷肥相結合，生產出一種既能對種植三七的土壤土傳病害進行生物消毒又能為種植地提供持久養分的藥肥雙效生物有機肥料。經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。參考文獻[I]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版).北京化學工業出版社，2010: 10-11.[2] Sun S，Wang CZ, Tong R, Li XL, Fishbein A, Wang Q, He TC, Du ff, YuanCS. Effects of steaming the root of Panax notoginseng on chemical compositionand anticancer activities. Food Chemistry, 2010, 118(2): 307-314. [3]甘雨，徐惠波，孫曉波.三七總皂苷的藥理作用研究進展.時珍國醫國藥，2007，18 (5): 1251-1252. [4] Guo HB, Cui XM, An N and Cai GP. Sanchi ginseng (Panax notoginseng(Burkill) F. H. Chen) in China:distribution, cultivation and variations.Genetic Resources and Crop Evolution, 2010, 57: 453—460.[5]簡在友，王文全，孟麗，張子龍.人參屬藥用植物連作障礙研究進展.中國現代中藥，2008，10 (6) :3-5.[6]張重義，林文雄.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙.中國生態農業學報，2009，17 (I) :189-196.[7]繆作清，李世東，劉杏忠，等.三七根腐病病原研究.中國農業科學.2006， 39: 1371-1378.[8]陳昱君，王勇，劉蕓芝，等.生物菌劑控制三七根腐病的初步研究.中國中藥雜志.2004，29 (11) :1102-1103.[9]劉立志，王啟方，張克勤，等.三七根腐病拮抗菌的篩選及活性產物的初步分析 云南大學學報.2004，6(4) :357-359.
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術之不足，而提供一種使用方便，成本低，效果明顯，無毒、無害的防治三七枯萎病的微生物有機磷肥。本發明的目的是這樣實現的本發明從云南省曲靖市富源縣藍莓種植區藍莓根際土壤中分離得到菌株KMXY1，對其鑒定結果表明該細菌屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),該菌株已經保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京市朝陽區北辰西路I號院3號；保藏日期2012年9月21 ;保藏號=CGMCC NO. 6598。此解淀粉芽孢桿菌菌體特征及菌落特征菌體呈短桿狀，染色均勻，具運動性，兼性厭氧，可形成內生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽性。在LB培養基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則，在多種培養基上均不產色素。該拮抗菌與有機磷肥堆肥混合制成微生物有機肥料，肥料中含有I X IO10個/g以上的拮抗微生物數量，總氮磷鉀養分為6 8 %，有機質含量為40 %。本發明的防治三七枯萎病的微生物有機磷肥經過如下具體步驟得到
(I)、生防菌種子液的制備a.將保藏號為CGMCC NO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培養基的試管進行一環活化，29°C培養48小時，LB培養基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH7. 0,瓊脂 17g/L ；b.取一環活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L,pH7.0 組成的LB培養液中，在110轉/min、29 °C下培養72小時，獲得發酵菌液；c.將培發酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養液中發酵培養，29-31°C發酵16-18小時,獲得發酵用菌種；d.將發酵用菌種按接種量1:20倍的比例接種于發酵罐中與b步驟相同的LB培 養液中發酵培養，29-31°C發酵72-96小時后，當發酵罐中的發酵液中芽孢含量大于或等于85-90%時，即獲得菌含量為IX IO11個/g以上的菌液時，出罐儲存作為生防菌種子液；(2)、生物有機磷肥基質的制備a.分別將水葫蘆渣干燥并粉碎，粉碎細度< 5cm ;草炭烘干或風干后粉碎，粉碎至(0. 45mm ;腐植酸粉碎至彡0. 45mm ;含量20_24%、磷礦粉粉碎至彡400目；b.將a.步驟粉碎后水葫蘆渣、草炭、腐植酸、磷礦粉質按質量比5 3 1 1的比例混合均勻，堆捂后自然發酵20-25天，其間當溫度升至62°C時進行翻堆以充分發酵，翻堆后繼續發酵，直至物料均為灰黑褐色時，物料發酵成熟，即得生物有機磷肥基質；(3)、防治三七枯萎病的微生物有機磷肥的制備將(I)步驟的生防菌種子液菌含量為IXlO11個/g以上時與步驟(2)的生物有機磷肥基質混合均勻，使混合肥料中含有I XlOltl個/g以上的拮抗微生物數量、全氮含量為5 6%，總氮磷鉀養分為6 8%、有機質含量為40%，包裝即為成品。本發明所用的設備均為市場銷售的通用設備。本發明的優點在于1、成本低，使用方便，效果明顯，無毒、無害、無環境造成污染。2、該肥料不僅能對種植三七土壤中的有害病菌進行充分消毒，而且能夠補充三七生長所需的營養元素，改良連作障礙土壤的理化性狀和土壤微生物活性，提高三七植株的抗逆性。
具體實施例方式實施例所用的設備均為市場銷售的通用設備。實施例1 :1、制備防治三七枯萎病的微生物有機磷肥(I)、生防菌種子液的制備a.將保藏號為CGMCC NO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培養基的試管進行一環活化，29°C培養48小時，LB培養基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH7. 0,瓊脂 17g/L ；b.取一環活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L,pH7.0 組成的LB培養液中，在110轉/min、29 °C下培養72小時，獲得發酵菌液；c.將培發酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養液中發酵培養，29°C或30°C或31°C發酵16小時或17小時或18小時，獲得發酵用菌種；d.將發酵用菌種按接種量1:20倍的比例接種于發酵罐中與b步驟相同的LB培養液中發酵培養，或30°C或31°C發酵72小時或86小時或96小時后，當發酵罐中的發酵液中芽孢含量大于或等于85或90%時，出罐儲存作為生防菌種子液；(2)、生物有機磷肥基質的制備a.分別將水葫蘆渣干燥并粉碎，粉碎細度< 5cm ;草炭烘干或風干后粉碎，粉碎至(0. 45mm ;腐植酸粉碎至彡0. 45mm ;含量20%或24%的磷礦粉粉碎至彡400目；b.將a.步驟粉碎后水葫蘆渣、草炭、腐植酸、磷礦粉質按質量比5 3 1 1的比例混合均勻，堆捂后自然發酵20-25天，其間當溫度升至62°C時進行翻堆以充分發酵，翻堆后繼續發酵，直至物料均為灰黑褐色時，物料發酵成熟，即得生物有機磷肥基質；(3)、防治三七枯萎病的微生物有機磷肥的制備將(I)步驟的生防菌種子液菌含量為IXlO11個/g以上時與步驟(2)的生物有機磷肥基質混合均勻，使混合肥料中含有I XlOltl個/g以上的拮抗微生物數量、全氮含量為5%或6%,總氮磷鉀養分為6%或7%或8%、有機質含量為40%,包裝即為成品。2、防治三七枯萎病的微生物有機磷肥的應用2009-2011年在云南省文山州進行相關試驗，供試農田土壤理化性狀基本相同，肥力中等。采用隨機設計，設連作土壤、本肥料施用連作土壤和新地(尚未種植過三七)3個處理，每處理各重復3次，各小區面積均為200m2。2009年11月，對即將施用本肥料實施例做底肥一次性施入土壤，用量為16000kg/hm2，然后均勻翻耕；連作和新作地處理按照當地常規方法施用復合肥400kg/hm2，2010年I月15日移栽一年生三七苗植株，栽植密度為35萬棵/hm2，其余田間管理措施同當地常規。在2010年12月進行田間調查，考察三七的生長和病害發生等狀況，收獲測產。實驗結果如下表。防枯萎病微生物有機磷肥對三七枯萎病菌的田間試驗結果
權利要求
1. 一種防治三七枯萎病的微生物有機磷肥，其特征在于該微生物有機磷肥經如下步驟制(1)、生防菌種子液的制備a.將保藏號為CGMCCNO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培養基的試管進行一環活化，29°C培養48小時，LB培養基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, ρΗ7· O,瓊脂 17g/L ；b.取一環活化后的菌苔移入用IOOOml錐形瓶裝的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 5g/L，ρΗ7· O 組成的 LB培養液中，在110轉/min、29 °C下培養72小時，獲得發酵菌液；c.將培發酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養液中發酵培養，29-31°C發酵16-18小時,獲得發酵用菌種；d.將發酵用菌種按接種量1:20倍的比例接種于發酵罐中與b步驟相同的LB培養液中發酵培養，29-31°C發酵72-96小時后，當發酵罐中的發酵液中芽孢含量大于或等于85-90% 時，即獲得菌含量為I X IO11個/g以上的菌液時，出罐儲存作為生防菌種子液；(2)、生物有機磷肥基質的制備a.分別將水葫蘆渣干燥并粉碎，粉碎細度<5cm;草炭烘干或風干后粉碎，粉碎至 (O. 45mm ;腐植酸粉碎至彡O. 45mm ;含量20_24%、磷礦粉粉碎至彡400目；b.將a.步驟粉碎后水葫蘆渣、草炭、腐植酸、磷礦粉質按質量比53 1 1的比例混合均勻，堆捂后自然發酵20-25天，其間當溫度升至62°C時進行翻堆以充分發酵，翻堆后繼續發酵，直至物料均為灰黑褐色時，物料發酵成熟，即得生物有機磷肥基質；(3)、防治三七枯萎病的微生物有機磷肥的制備將(I)步驟的生防菌種子液菌含量為IXlO11個/g以上時與步驟(2)的生物有機磷肥基質混合均勻，使混合肥料中含有I XlOltl個/g以上的拮抗微生物數量、全氮含量為5 6%，總氮磷鉀養分為6 8%、有機質含量為40%，包裝即為成品。
全文摘要
防治三七枯萎病的微生物有機磷肥，屬微生物有機磷肥技術領域。本發明用解淀粉芽孢桿菌，通過液體發酵培養制備生防菌種子液；將粉碎的水葫蘆渣草炭腐植酸含量20-24%、細度400-450目的磷礦粉以 5311比例混合發酵得生物磷肥基質；再將生防菌種子液與生物磷肥基質混勻，制成防治三七枯萎病的微生物有機磷肥，肥料中含有1×1010個/g以上的拮抗微生物數量、全氮含量為5～6％，總氮磷鉀養分為6～8％、有機質含量為40％。本發明的優點在于成本低，使用方便，效果明顯，無毒、無害、無環境造成污染；能對種植三七土壤中的有害病菌進行充分消毒，并補充三七生長所需的營養元素，改良連作障礙土壤的理化性狀和微生物活性，提高三七植株的抗逆性。
文檔編號C05F11/08GK103011918SQ201210410170
公開日2013年4月3日 申請日期2012年10月24日 優先權日2012年10月24日
發明者余磊, 趙建榮 申請人:昆明學院