一種海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，由以下組分按質量份數配比組成，芽孢桿菌劑與麥飯石的質量比為1:1~4；芽孢桿菌劑由芽孢桿菌混合物與營養飼料組成，其重量比為1：20~100，其中：芽孢桿菌劑制備過程包括以下步驟：增菌、洗滌后收集菌體；再加入大豆粉混合制得；利用本發明實施例所述方法配制的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，適用于海參的育苗池和養成池；處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統方法，本發明粉劑保存時間長，無污染。
【專利說明】一種海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及海產品疾病檢測【技術領域】，具體涉及海產品致病微生物防治營養粉，尤其是一種海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑。
【背景技術】
[0002]我國海域遼闊，自然條件優越，海洋資源十分豐富。但目前開發利用的程度還很低。這也說明我國開發利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國重要的海洋生物資源、漁業資源寶庫，其盛產海參、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動海洋經濟發展。加強多邊和雙邊的海洋開發國際合作，集中集約開發利用海域及海島資源，合理配置優勢海洋產業，科學高效開發海洋資源，積極開展科研與試驗、開發與利用，海水養殖標準化是合理開發海水養殖資源的重要手段，研究制定海產品養殖標準，合理開發海水灘涂養殖資源，提高養殖海產品疾病是當今養殖業的重點內容。
[0003]海產品養殖是一項高風險的養殖業，傳統的小戶的海產品養殖給養殖戶帶來了巨大的市場和技術風險。為了將養殖戶養殖風險降到最低，開展對各類養殖業，包括魚、蝦、蟹、海參、鮑魚、貝類、海藻等各類海產品的疾病防治工作任務舉足輕重。有報道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌等有害細菌，是引起海產品各種疾病的罪魁禍首。
[0004]世界海參養殖以刺參(溫帶種)和糙海參(熱帶種)為主要品種。除中國、日本、韓國主要養殖刺參外，其他國家均以糙海參為主要養殖對象。近年來，隨著自然資源的減少和消費需求的增加，海參的人工養殖在一些國家逐漸興起。其中，中國和日本是主要的養殖國家，印度、印度尼西亞、越南、菲律賓、韓國、埃及等也有小規模的增養殖。
[0005]刺參(Apostichopus japonicus)是我國有記載的20余種食用海參中價值最高、惟一分布于黃渤海域的溫帶種。其蛋白質含量高，糖類豐富，脂類含量低，且不含膽固醇，具有很高的營養保健和藥用價值，被人們視為重要的海珍品，因而具有重要的市場價值。近年來，海參消費需求量的逐年增加導致了世界范圍內海參自然資源的過度開發和種群數量的急劇下降，因此，海參的人工養殖也隨之發展起來。隨之而來的是海參養殖中遇到的各類問題。
[0006]芽孢桿菌是目前最常用的益生菌種類。本發明不限定芽孢桿菌的種類，只要是標準菌株即可，開發成海參養殖營養制劑，有效提高海參體內的益生菌群。能夠達到抗菌、免疫、促生長的多重效果，對海參健康養殖有現實意義。
[0007]麥飯石是一種對生物無毒、無害并具有一定生物活性的復合礦物或藥用巖石。麥飯石的主要化學成分是無機的硅鋁酸鹽。其中包括S1203、Fe203、Fe0、Mg0、Ca0、k20、Na20、Ti02、p205、MnO等還含有動物所需的全部常量元素如K、Na、Ca、Mg、Cu、Mo等微量元素和稀土元素約58種之多。麥飯石是一種天然的藥物礦石含有鉀、鈉、鈣、鎂、磷常量元素和鋅、鐵、硒、銅、鍶、碘、氟、偏硅酸等十八種微量元素。麥飯石中含鋁硅酸鹽類長石對色素和細菌有吸附能力。麥飯石能吸附水中游離子，麥飯石經水后可溶出對生物體有用的常量元素K、Ca、Mg 及 S1、Fe、Zn、Cu、Mo、Se、Mn、Sr、N1、V、L1、Co、Cr、1、Ge、Ti 等微量元素和氨基酸。
【發明內容】
[0008]由【背景技術】可見，提高刺參自身的免疫力，增強其抗病力是解決刺參病害問題的重要途徑。本研究為達到防治養殖業中海參患病的目的，避免在海參疾病防治中使用抗生素，本發明所述的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，其有以下組分按質量份數配比組成，
[0009]芽孢桿菌混合物與營養飼料總重量比為1:20-100，其中:
[0010]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50~70份；馬尾藻粉:25~40份；海蒿子15~35 ;大豆蛋白10~15份；魚粉:5~10份；螺旋藻2~5份；貽貝粉2~5份；低聚殼聚糖:1~4份；復合多維I~4份；復合多礦I~4份。
[0011]對于以上所有技術方案中，較優的條件如下:所述的芽孢桿菌混合物由以下方法制備:
[0012](I)增菌:從芽孢桿菌標準菌株的單一菌落中，挑菌接種到芽孢桿菌培養基中，3(T35°C條件下，100~200rpm振蕩培養12h后，再以3_5%的體積比接種芽孢桿菌混合物，進行發酵，3(T35°C條件下，100~200rpm振蕩培養24~48h，至菌懸液菌含量的終濃度為107^1010cfu/g ;制得發酵產物；
[0013](2)洗滌:將步驟(1)獲得的發酵產物，以400(T8000rpm轉數離心2~5min，以收集菌體；以50倍質量的PBS緩沖液混合，充分攪拌f 5min后，收集混合液；
[0014](3)益生菌配比:將收集的混合液；按1:1的質量比加入大豆粉，再混合均勻；
[0015](4)干燥:上述步驟(3)所得的混合物與營養飼料混合，混合物與營養飼料總重量比為1:2~10，干燥24~36h`，產物水份含量為2~5%，制得芽孢桿菌劑。
[0016](5)向步驟(4)所得到的芽孢桿菌劑中，按照f 4倍質量，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按10-30:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為35(T450r/min，球磨時間為2~4h，使得終產物的產品粒度為納米級。
[0017]對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下:其步驟包括菌種復蘇的步驟:芽孢桿菌標準菌株菌落接種在芽孢桿菌混合物中，3(T35°C條件下，100~200rpm振蕩培養12h。
[0018]對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下:所述的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，其特征在于，所述的芽孢桿菌培養基，其配制方法如下:
[0019]①取葡萄糖8~10g,鹿糖l(T20g,酵母膏4飛g,胰蛋白胨5~10g，牛肉膏4_6g,氯化鈣0.2^2g,氯化鈉0.4-0.8g，氯化鎂f 2g，硫酸鎂0.fig蒸餾水lOOOmL，121°C下滅菌20min ；
[0020]②待所述培養基逐漸冷卻后，調節所述溶液的pH至5.0-7.0，冷卻備用。
[0021]本發明中，上述產品制備方法中，均未限定方法的其他等效條件，因其可根據現有技術確定，也未限定所用試劑的級別，因其對結果影響小，并可以通過配制或商業途徑購買獲得，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發明不再贅述。
[0022]本發明的優點是:適用于海參的育苗池和養成池；處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統方法，本發明粉劑保存時間長，無污染。【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0024]實施例1
[0025](I)菌種復蘇:從芽孢桿菌標準菌株的單一菌落中，挑菌接種到芽孢桿菌培養基中，35°C條件下，培養12h。
[0026](2)增菌:再以4%的體積比接種到芽孢桿菌培養基中，35°C條件下，進行發酵，培養28h，至菌懸液菌含量的終濃度為108cfu/g ;制得發酵產物；
[0027]其中，所述的芽孢桿菌培養基，其配制方法如下:
[0028]取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取液5g，葡萄糖20g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸錳0.05，四水合硫酸錳0.25g，吐溫-80 Im L，蒸餾水lOOOmL，115°C滅菌20min ;待所述培養基逐漸冷卻后，調節所述溶液的pH至6.5，冷卻備用;
[0029](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以400(T8000rpm轉數離心3min，以收集菌體；以50倍質量的PBS緩沖液混合，充分攪拌3min后，收集混合液；
[0030](4)益生菌配比:將收集的混合液；按1:1的質量比加入大豆粉，再混合均勻；
[0031](5)干燥:上述步驟(3)所得的混合物與營養飼料混合，混合物與營養飼料總重量比為1:80，干燥28h，產物水份含量為3%，制得海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑；
[0032]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50份；馬尾藻粉:40份；海蒿子35 ;大豆蛋白15份；魚粉:10份；螺旋藻5份；貽貝粉5份；低聚殼聚糖:4份；復合多維I份；復合多礦4份。
[0033](6)向步驟(5)所得到的芽孢桿菌劑中，按照1:1的質量比，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按20:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為450r/min，球磨時間為3h，使得終產物的產品粒度為微米級。
[0034]實施例2
[0035](I)菌種復蘇:從芽孢桿菌標準菌株的單一菌落中，挑菌接種到芽孢桿菌培養基中，35°C條件下，培養12h ；
[0036](2)增菌:再以5%的體積比接種到芽孢桿菌培養基中，35°C條件下，進行發酵，培養48h，至菌懸液菌含量的終濃度為101(lCfu/g ;制得發酵產物；
[0037]其中，所述的芽孢桿菌培養基，其配制方法如下:
[0038]取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取液5g，葡萄糖20g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸錳0.05，四水合硫酸錳0.25g，吐溫-80 Im L，蒸餾水lOOOmL，115°C滅菌20min ;待所述培養基逐漸冷卻后，調節所述溶液的pH至6.5，冷卻備用;
[0039](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以5000rpm轉數離心3min，以收集菌體；以I: 50的質量比與PBS緩沖液充分混合后，收集混合液；
[0040](4)益生菌配比:將收集的混合液；按1:1的質量比加入大豆粉，再混合均勻；
[0041](5)干燥:上述步驟(3)所得的混合物與營養飼料混合，混合物與營養飼料總重量比為1:70，干燥30h，產物水份含量為5%，制得海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑；
[0042]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙60份；馬尾藻粉:30份；海蒿子30 ;大豆蛋白15份；魚粉:7份；螺旋藻4份；貽貝粉4份；低聚殼聚糖:2份；復合多維2份；復合多礦2份。
[0043](6)向步驟(5)所得到的芽孢桿菌劑中，按照1:4的質量比，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按10:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為450r/min，球磨時間為4h，使得終產物的產品粒度為納米級。
[0044]實驗例3
[0045](I)菌種復蘇:從芽孢桿菌標準菌株的單一菌落中，挑菌接種到芽孢桿菌培養基中，35 °C條件下培養12h。
[0046](2)增菌:再以3-5%的體積比接種到芽孢桿菌培養基中，35°C條件下，進行發酵培養28h，至菌懸液菌含量的終濃度為101(lCfu/g ;制得發酵產物；
[0047]其中，所述的芽孢桿菌培養基，其配制方法如下:
[0048]取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母提取液5g,葡萄糖20g,朽1檬酸二銨2g,乙酸鈉5g,磷酸氫二鉀2g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸錳0.05，四水合硫酸錳0.25g，吐溫-80 Im L，蒸餾水lOOOmL，115°C滅菌20min ;待所述培養基逐漸冷卻后，調節所述溶液的pH至6.5，冷卻備用;
[0049](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以6000rpm轉數離心3min，以收集菌體；以50倍質量的PBS緩沖液混合，充分攪拌5min后，收集混合液；
[0050](4)益生菌配比:將收集的混合液；按1:1的質量比加入大豆粉，再混合均勻；
[0051](5)干燥:上述步驟(3)所得的混合物與營養飼料混合，混合物與營養飼料總重量比為1:60，干燥36h，產物水份含量為5%，制得海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑；
[0052]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50份；馬尾藻粉:30份；海蒿子15 ;大豆蛋白15份；魚粉:8份；螺旋藻5份；貽貝粉4份；低聚殼聚糖:2份；復合多維2份；復合多礦2份。
[0053](6)向步驟(5)所得到的芽孢桿菌劑中，按照1:2的質量比，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按10:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為350r/min，球磨時間為2h，使得終產物的產品粒度為微米級。
[0054]實驗例4
[0055](I)菌種復蘇:從芽孢桿菌標準菌株的單一菌落中，挑菌接種到芽孢桿菌培養基中，35 °C條件下培養12h。
[0056](2)增菌:再以5%的體積比接種到芽孢桿菌培養基中，35°C條件下，進行發酵，培養48h，至菌懸液菌含量的終濃度為101(lCfu/g ;制得發酵產物；
[0057]其中，所述的芽孢桿菌培養基，其配制方法如下:
[0058]取蛋白胨IOg,牛肉膏IOg,酵母提取液5g,葡萄糖20g,朽1檬酸二銨2g,乙酸鈉5g,磷酸氫二鉀2g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸錳0.05，四水合硫酸錳0.25g，吐溫-80 Im L，蒸餾水lOOOmL，115°C滅菌20min ;待所述培養基逐漸冷卻后，調節所述溶液的pH至6.5，冷卻備用;
[0059](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以4000rpm轉數離心5min，以收集菌體；以50倍質量的PBS緩沖液混合，充分攪拌5min后，收集混合液；
[0060](4)益生菌配比:將收集的混合液；按1:1的質量比加入大豆粉,再混合均勻；
[0061](5)干燥:上述步驟(3)所得的混合物與營養飼料混合，混合物與營養飼料總重量比為1:50，干燥36h，產物水份含量為2%，制得海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑；[0062]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙70份；馬尾藻粉:25份；海蒿子35 ;大豆蛋白15份；魚粉:8份；螺旋藻5份；貽貝粉2份；低聚殼聚糖:4份；復合多維4份；復合多礦4份。
[0063](6)向步驟(5)所得到的芽孢桿菌劑中，按照1:3的質量比，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按30:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為450r/min，球磨時間為4h，使得終產物的產品粒度為納米級。
[0064]與對照組海參相比，利用本發明實施例f 4所述方法配制的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑喂養海參，體重均有所增加，且不易患病；本發明產品適用于海參養殖；處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統方法，本發明粉劑保存時間長，無污染。本發明對解決大批量海參的養殖具有重要的現實意義。
[0065]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，其特征在于:有以下組分按質量份數配比組成， 芽孢桿菌劑與麥飯石的質量比為1:1~4 ; 芽孢桿菌劑由芽孢桿菌混合物與營養飼料組成，其重量比為1:20-100，其中: 所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50~70份；馬尾藻粉:25~40份；海蒿子15~35 ;大豆蛋白10~15份；魚粉:5~10份；螺旋藻2~5份；貽貝粉2~5份；低聚殼聚糖:1~4份；復合多維I~4份；復合多礦I~4份。
2.根據權利要求1所述的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，其特征在于，所述的芽孢桿菌混合物由以下方法制備: (1)增菌:從芽孢桿菌標準菌株的單一菌落中，挑菌接種到芽孢桿菌培養基中，3(T35°C條件下，100~200rpm振蕩培養12h后，再以3_5%的體積比接種芽孢桿菌混合物，進行發酵，3(T35°C條件下，100~200rpm振蕩培養24~48h，至菌懸液菌含量的終濃度為107^1010cfu/g ;制得發酵產物； (2)洗滌:將步驟(1)獲得的發酵產物，以400(T8000rpm轉數離心2~5min，以收集菌體；以50倍質量的PBS緩沖液混合，充分攪拌f 5min后，收集混合液； (3)益生菌配比:將收集的混合液；按1:1的質量比加入大豆粉，再混合均勻； (4)干燥:上述步驟(3)所得的混合物與營養飼料混合，混合物與營養飼料總重量比為1:2~10，干燥24~36h，產物水份含量為2~5%，制得芽孢桿菌劑； (5)向步驟(4)所得到 的芽孢桿菌劑中，按照f4倍質量，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按10~30:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為35(T450r/min，球磨時間為2~4h，使得終產物的產品粒度為納米級。
3.根據權利要求2所述的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，其特征在于，步驟(1)還包括菌種復蘇的步驟:芽孢桿菌標準菌株菌落接種在芽孢桿菌混合物中，3(T35°C條件下，100~200rpm振蕩培養12h。
4.根據權利要求3所述的海參養殖用麥飯石載體芽孢桿菌劑，其特征在于，所述的芽孢桿菌培養基，其配制方法如下: ①取葡萄糖8~IOg,鹿糖l(T20g,酵母膏4~6g,胰蛋白胨5~IOg,牛肉膏4_6g,氯化鈣0.2^2g,，氯化鈉0.4-0.8g，氯化鎂f 2g，硫酸鎂0.fig蒸餾水1000mL, 121 °C下滅菌20min ； ②待所述培養基逐漸冷卻后，調節所述溶液的PH至5.0-7.0，冷卻備用。
【文檔編號】A23K1/175GK103815160SQ201210468388
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月19日 優先權日:2012年11月19日
【發明者】謝克煥 申請人:大連德通生物技術開發有限公司