一種麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，由以下組分按質量份數配比組成，麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑與麥飯石的質量比為1:1~4；麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑由溶藻弧菌滅活產物與營養飼料按照質量比為1：2~10的比例混合；其制備方法包括增菌、收集菌體；再經β-丙內脂滅活處理后水解；再噴霧干燥到營養飼料中，干燥24~36h，再于麥飯石混合，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑；本發明適用于海參的育苗池和養成池；處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統方法，本發明粉劑保存時間長，無污染。對解決大批量海參養殖的溶藻弧菌的防治具有重要的現實意義。
【專利說明】一種麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及海產品疾病檢測【技術領域】，具體涉及海產品致病微生物防治營養粉，尤其是一種麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑。
【背景技術】
[0002]我國海域遼闊，自然條件優越，海洋資源十分豐富。但目前開發利用的程度還很低。這也說明我國開發利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國重要的海洋生物資源、漁業資源寶庫，其盛產海參、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動海洋經濟發展。加強多邊和雙邊的海洋開發國際合作，集中集約開發利用海域及海島資源，合理配置優勢海洋產業，科學高效開發海洋資源，積極開展科研與試驗、開發與利用，海水養殖標準化是合理開發海水養殖資源的重要手段，研究制定海產品養殖標準，合理開發海水灘涂養殖資源，提高養殖海產品疾病是當今養殖業的重點內容。
[0003]海產品養殖是一項高風險的養殖業，傳統的小戶的海產品養殖給養殖戶帶來了巨大的市場和技術風險。為了將養殖戶養殖風險降到最低，開展對各類養殖業，包括魚、蝦、蟹、海參、鮑魚、貝類、海藻等各類海產品的疾病防治工作任務舉足輕重。有報道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌等有害細菌，是引起海產品各種疾病的罪魁禍首。
[0004]世界海參養殖以刺參(溫帶種)和糙海參(熱帶種)為主要品種。除中國、日本、韓國主要養殖刺參外，其他國家均以糙海參為主要養殖對象。近年來，隨著自然資源的減少和消費需求的增加，海參的人工養殖在一些國家逐漸興起。其中，中國和日本是主要的養殖國家，印度、印度尼西亞、越南、菲律賓、韓國、埃及等也有小規模的增養殖。
[0005]刺參(Apostichopus japonicus)是我國有記載的20余種食用海參中價值最高、惟一分布于黃渤海域的溫帶種。其蛋白質含量高，糖類豐富，脂類含量低，且不含膽固醇，具有很高的營養保健和藥用價值，被人們視為重要的海珍品，因而具有重要的市場價值。近年來，海參消費需求量的逐年增加導致了世界范圍內海參自然資源的過度開發和種群數量的急劇下降，因此，海參的人工養殖也隨之發展起來。隨之而來的是海參養殖中遇到的各類問題。
[0006]溶藻弧菌病是指由各種類型溶藻弧菌所引起的對人類、以及海洋生物等不同形式的總稱。溶藻弧菌可引起刺參潰瘍病，發病癥狀為:患病刺參體表潰瘍，粘液增多，吐腸，1/4出現腫嘴，最后自溶死亡。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae),弧菌屬(Vibrio),革蘭氏陰性短桿菌,無芽孢、莢膜,單獨存在或尾端相連成“C”或“S”形，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧海生弧菌，適宜溫度為17?35°C。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作為一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于世界各地海水和海產品中，是許多海水養殖動物的致病菌。近年來在養殖生產上出現了較為嚴重的耐藥性現象，給養殖業帶來了很大的危害，這很可能與溶藻弧菌生物被膜的形成有關。溶藻弧菌還能引起人類食物中毒。溶血毒素、耐熱性腸毒素(ST)和不耐熱性腸毒素(LT)是致病性微生物中常見的致病因子。
[0007]因此，由溶藻弧菌引起的海洋生物疾病問題是常見的，而目前檢測溶藻弧菌的方法檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。為了使得海產品因細菌引起的各種疾病有很好的預防和檢測，需要有新的方法能夠在一個短的時間內，在一個給定的樣品量中檢測病原體。
[0008]β-丙內酯(BPL)在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。β-丙內脂(C2H403)是一種雜環類化合物，沸點155°C，常溫下是無色粘稠狀液體，是廣譜殺菌劑，對病毒、細菌、真菌等都有很強的殺滅作用，比福爾馬林作用強25倍。作用機理:作用于病原體DNA或RNA，改變核酸結構達到滅活目的，而不直接作用于蛋白。1.特點:β_丙內酯(BPL)直接與核酸作用，而不作用于殼蛋白，不破壞病原體的免疫原性。2.大劑量β_丙內酯(BPL)雖是一種致癌物，但極易水解，在37°C水浴水解2h后消失，其水解為無毒性的脂肪代謝產物β -羥基丙酸。另外，由于其能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留。3.37°C僅需2小時丙內酯即可完全水解，滅活時間短，從而顯著地縮短了疫苗生產周期，提高了經濟效益。總之，β_丙內酯(BPL)作為疫苗滅活劑，可直接作用于核酸，滅活能力強，保持疫苗良好的免疫原性；其水解產物對機體無害，接種反應輕。目前，國內外已將其用于一些疫苗的滅活。
【發明內容】
[0009]由【背景技術】可見，提高刺參自身的免疫力，增強其抗病力是解決刺參病害問題的重要途徑。本研究為達到防治養殖業中海參患病的目的，避免在海參疾病防治中使用抗生素，本發明所述的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，采用以下技術方案實現:有以下組分按質量份數配比組成，
[0010]麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑與麥飯石的質量比為1:1~4; [0011]麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑由溶藻弧菌滅活產物與營養飼料按照質量比為1:2~10的比例混合；
[0012]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50~70份；馬尾藻粉:25~40份；海蒿子15~35 ;大豆蛋白10~15份；魚粉:5~10份；螺旋藻2~5份；貽貝粉2~5份；低聚殼聚糖:1~4份；復合多維I~4份；復合多礦I~4份。
[0013]對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下:所述的溶藻弧菌滅活產物由以下方法制備:
[0014](I)增菌:從溶藻弧菌標準菌株的單一菌落中，挑取一菌環，接種到營養肉湯培養基中，3-5%的體積比接種，進行發酵，32~37°C培養24~48h，至菌懸液菌含量的終濃度為107^1010cfu/g ;制得發酵產物；
[0015](2)洗滌:將步驟(1)獲得的發酵產物，以1:50的質量比與PBS緩沖液混合，充分攪拌I~5min后，以4000~8000rpm轉數離心2~5min,以收集菌體；
[0016](3)滅活處理:在收集的菌體中 ，按1:50的質量比加入PBS緩沖液，再向混合液體中，按1:1000-4000重量比加入β-丙內脂，IOOrmp振搖條件下，于4°C放置24h，然后于37°C放置2小時使其水解；
[0017](4)干燥:上述步驟(3)所得的滅活產物噴霧干燥到營養飼料中，干燥24~36h，滅活產物與營養飼料總重量比為1:2?10，產物水份含量為2飛％，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑；
[0018]對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下:其步驟包括菌種復蘇的步驟:溶藻弧菌標準菌株菌落接種在肉湯培養基中，或者溶藻弧菌培養基中，36土TC培養16?24h。
[0019]對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下:所述的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，其特征在于，所述的溶藻弧菌培養基，其配制方法如下:
[0020]①取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸餾水中，過濾除菌；
[0021]②取酵母浸膏3g，氯化鈉10g，膽酸鈉2g，檸檬酸鐵lg，硫代硫酸鈉10g，氯化鈣Ig,蒸懼水 900mL, 121 °C下滅菌 20min ；
[0022]③待所述培養基逐漸冷卻后，加入除菌的亮氨酸溶液；
[0023]④調節所述溶液的pH至8.0左右，冷卻放入15°C培養箱中備用。
[0024]對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下:按1:4000重量比加入β -丙內脂。
[0025]本發明中，上述產品制備方法中，均未限定方法的其他等效條件，因其可根據現有技術確定，也未限定所用試劑的級別，因其對結果影響小，并可以通過配制或商業途徑購買獲得，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發明不再贅述。
[0026]本發明的優點是:適用于海參的育苗池和養成池；處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統方法，本發明粉劑保存時間長，無污染。本發明對解決大批量海參養殖的溶藻弧菌的防治具有重要的現實意義。
【具體實施方式】
[0027]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0028]實施例1
[0029](I)菌種復蘇:溶藻弧菌標準菌株菌落在培養基上呈光滑、凸起、直徑f3mm、邊緣整齊的黃色。將溶藻弧菌標準菌株接種在溶藻弧菌培養基中，37°C培養18h，
[0030]其中，所述的溶藻弧菌培養基，其配制方法如下:
[0031]①取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸餾水中，過濾除菌；
[0032]②取酵母浸膏3g，氯化鈉10g，膽酸鈉2g，檸檬酸鐵lg，硫代硫酸鈉10g，氯化鈣Ig,蒸懼水 900mL, 121 °C下滅菌 20min ；
[0033]③待所述培養基逐漸冷卻后，加入除菌的亮氨酸溶液；
[0034]④調節所述溶液的pH至8.0左右，冷卻放入15°C培養箱中備用。
[0035](2)增菌:從步驟(I)獲得的溶藻弧菌標準菌株的單一菌落中，挑取一菌環，接種到營養肉湯培養基中，5%的體積比接種，進行發酵，36 V培養30h，至菌懸液菌含量的終濃度為KTlO'fu/g ;制得發酵產物；
[0036](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以1:50的質量比與PBS緩沖液混合，充分攪拌2min后，以8000rpm轉數離心3min,以收集菌體。
[0037](4)滅活處理:在收集的菌體中，按1:50的質量比加入PBS緩沖液，再向混合液體中，按1:3500重量比加入β-丙內脂，IOOrmp振搖條件下，于4°C放置24h，然后于37°C放置2小時使其水解；
[0038](5)干燥:上述步驟(4)所得的滅活產物噴霧干燥到營養飼料中，干燥25h，滅活產物與營養飼料總重量比為1:10，產物水份含量為2%，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑。
[0039]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50份；馬尾藻粉:40份；海蒿子35 ;大豆蛋白15份；魚粉:10份；螺旋藻5份；貽貝粉5份；低聚殼聚糖:4份；復合多維I份；復合多礦4份。
[0040]實施例2
[0041](I)菌種復蘇:溶藻弧菌標準菌株菌落在培養基上呈光滑、凸起、直徑f3mm、邊緣整齊的黃色。將溶藻弧菌標準菌株接種在溶藻弧菌培養基中，36°C培養18h，
[0042]其中，所述的溶藻弧菌培養基，其配制方法如下:
[0043]①取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸餾水中，過濾除菌；
[0044]②取酵母浸膏3g，氯化鈉10g，膽酸鈉2g，檸檬酸鐵lg，硫代硫酸鈉10g，氯化鈣Ig,蒸懼水 900mL, 121 °C下滅菌 20min ；
[0045]③待所述培養基逐漸冷卻后，加入除菌的亮氨酸溶液；
[0046]④調節所述溶液的pH至8.0左右，冷卻放入15°C培養箱中備用。
[0047](2)增菌:從步驟(I)獲得的溶藻弧菌標準菌株的單一菌落中，挑取一菌環，接種到營養肉湯培養基中，4%的體積比接種，進行發酵，37 V培養48h，至菌懸液菌含量的終濃度為KTlO'fu/g ;制得發酵產物；
[0048](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以1:50的質量比與PBS緩沖液混合，充分攪拌2min后，以5000rpm轉數離心2min,以收集菌體。
[0049](4)滅活處理:在收集的菌體中，按1:50的質量比加入PBS緩沖液，再向混合液體中，按1:5000重量比加入β-丙內脂，IOOrmp振搖條件下，于4°C放置24h，然后于37°C放置2小時使其水解；
[0050](5)干燥:上述步驟(4)所得的滅活產物噴霧干燥到營養飼料中，干燥30h，滅活產物與營養飼料總重量比為1:7，產物水份含量為4%，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑。
[0051]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙60份；馬尾藻粉:30份；海蒿子30 ;大豆蛋白15份；魚粉:7份；螺旋藻4份；貽貝粉4份；低聚殼聚糖:2份；復合多維2份；復合多礦2份。
[0052]實驗例3
[0053](I)菌種復蘇:溶藻弧菌標準菌株菌落在培養基上呈光滑、凸起、直徑f3mm、邊緣整齊的黃色。將溶藻弧菌標準菌株接種在溶藻弧菌培養基中，36±1°C培養16?24h，
[0054]其中，所述的溶藻弧菌培養基，其配制方法如下:
[0055]①取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸餾水中，過濾除菌；
[0056]②取酵母浸膏3g，氯化鈉10g，膽酸鈉2g，檸檬酸鐵lg，硫代硫酸鈉10g，氯化鈣lg，蒸懼水 900mL, 121°C下滅菌 20min ；
[0057]③待所述培養基逐漸冷卻后，加入除菌的亮氨酸溶液；
[0058]④調節所述溶液的pH至8.0左右，冷卻放入15°C培養箱中備用。
[0059](2)增菌:從步驟(I)獲得的溶藻弧菌標準菌株的單一菌落中，挑取一菌環，接種到營養肉湯培養基中，5%的體積比接種，進行發酵，37 V培養28h，至菌懸液菌含量的終濃度為108cfu/g ;制得發酵產物；[0060](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以1:50的質量比與PBS緩沖液混合，充分攪拌Imin后，以4000rpm轉數離心5min,以收集菌體。
[0061](4)滅活處理:在收集的菌體中，按1:50的質量比加入PBS緩沖液，再向混合液體中，按1:2000重量比加入β-丙內脂，IOOrmp振搖條件下，于4°C放置24h，然后于37°C放置2小時使其水解；
[0062](5)干燥:上述步驟(4)所得的滅活產物噴霧干燥到營養飼料中，干燥26h，滅活產物與營養飼料總重量比為1:5，產物水份含量為2飛％，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑。
[0063]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50份；馬尾藻粉:30份；海蒿子15 ;大豆蛋白15份；魚粉:8份；螺旋藻5份；貽貝粉4份；低聚殼聚糖:2份；復合多維2份；復合多礦2份。
[0064]實驗例4
[0065](I)菌種復蘇:溶藻弧菌標準菌株菌落在培養基上呈光滑、凸起、直徑f3mm、邊緣整齊的黃色。將溶藻弧菌標準菌株接種在溶藻弧菌培養基中，36±1°C培養16?24h，
[0066]其中，所述的溶藻弧菌培養基，其配制方法如下:
[0067]①取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸餾水中，過濾除菌；
[0068]②取酵母浸膏3g，氯化鈉10g，膽酸鈉2g，檸檬酸鐵lg，硫代硫酸鈉10g，氯化鈣Ig,蒸懼水 900mL, 121 °C下滅菌 20min ；
[0069]③待所述培養基逐漸冷卻后，加入除菌的亮氨酸溶液；
[0070]④調節所述溶液的pH至8.0左右，冷卻放入15°C培養箱中備用。
[0071](2)增菌:從步驟(I)獲得的溶藻弧菌標準菌株的單一菌落中，挑取一菌環，接種到營養肉湯培養基中，5%的體積比接種，進行發酵，37 V培養48h，至菌懸液菌含量的終濃度為101(lcfu/g ;制得發酵產物；
[0072](3)洗滌:將步驟(2)獲得的發酵產物，以1:50的質量比與PBS緩沖液混合，充分攪拌3min后，以4000rpm轉數離心5min,以收集菌體。
[0073](4)滅活處理:在收集的菌體中，按1:50的質量比加入PBS緩沖液，再向混合液體中，按1:1000重量比加入β-丙內脂，IOOrmp振搖條件下，于4°C放置24h，然后于37°C放置2小時使其水解；
[0074](5)干燥:上述步驟(4)所得的滅活產物噴霧干燥到營養飼料中，干燥26h，滅活產物與營養飼料總重量比為1:5，產物水份含量為5%，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑。
[0075]所述的營養飼料為:黃粉蟲沙70份；馬尾藻粉:25份；海蒿子35 ;大豆蛋白15份；魚粉:8份；螺旋藻5份；貽貝粉2份；低聚殼聚糖:4份；復合多維4份；復合多礦4份。
[0076]利用本發明實施例f 4所述方法配制的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，適用于海參的育苗池和養成池；處理過程簡單，耗時少；制備成本低于傳統方法，本發明粉劑保存時間長，無污染。本發明對解決大批量海參養殖的溶藻弧菌的防治具有重要的現實意義。
[0077]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，其特征在于:有以下組分按質量份數配比組成， 麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑與麥飯石的質量比為l:f4 ; 麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑由溶藻弧菌滅活產物與營養飼料按照質量比為1:2~10的比例混合； 其中:所述的營養飼料為:黃粉蟲沙50~70份；馬尾藻粉:25~40份；海蒿子15~35 ;大豆蛋白10~15份；魚粉:5~10份；螺旋藻2~5份；貽貝粉2~5份；低聚殼聚糖:I~4份；復合多維I~4份；復合多礦I~4份。
2.根據權利要求1所述的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，其特征在于，所述的溶藻弧菌滅活產物由以下方法制備: (1)增菌:從溶藻弧菌標準菌株的單一菌落中，挑取一菌環，接種到營養肉湯培養基中，3-5%的體積比接種，進行發酵，32~37 V培養24~48h，至菌懸液菌含量的終濃度為107^1010cfu/g ;制得發酵產物； (2)洗滌:將步驟(1)獲得的發酵產物，以1:50的質量比與PBS緩沖液混合，充分攪拌I~5min后，以4000~8000rpm轉數離心2~5min,以收集菌體； (3)滅活處理:在收集的菌體中，按1:50的質量比加入PBS緩沖液，再向混合液體中，按1:1000~4000重量比加入丙內脂，IOOrmp振搖條件下，于4°C放置24h，然后于37°C放置2小時使其水解； (4)干燥:上述步驟(3)所得的滅活產物噴霧干燥到營養飼料中，干燥24~36h，滅活產物與營養飼料總重量比為1:2~10，產物水份含量為2飛％，制得麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑； (5)向步驟(4)所得到的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑中，按照1:1~4的質量比，加入麥飯石，充分混合均勻后球磨，球磨條件為:按10-30:1的質量比裝入鋼球和沉淀物；球磨轉速設為35(T450r/min，球磨時間為2~4h，使得終產物的產品粒度為納米級~微米級。
3.根據權利要求2所述的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，其特征在于，其步驟包括菌種復蘇的步驟:溶藻弧菌標準菌株菌落接種在肉湯培養基中，或者溶藻弧菌培養基中，36±1°C 培養 16~24h。
4.根據權利要求3所述的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，其特征在于，所述的溶藻弧菌培養基，其配制方法如下: ①取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸餾水中，過濾除菌； ②取酵母浸膏3g，氯化鈉10g，膽酸鈉2g，檸檬酸鐵lg，硫代硫酸鈉10g，氯化鈣lg，蒸餾水 900mL，121°C 下滅菌 20min ； ③待所述培養基逐漸冷卻后，加入除菌的亮氨酸溶液； ④調節所述溶液的pH至8.0左右，冷卻放入15°C培養箱中備用。
5.根據權利要求4所述的麥飯石載體海參抗溶藻弧菌劑，其特征在于，按1:4000重量比加入β_丙內脂。
【文檔編號】A23K1/00GK103815161SQ201210468408
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月19日 優先權日:2012年11月19日
【發明者】謝克煥 申請人:大連德通生物技術開發有限公司